S0109 总SOD活性检测试剂盒_NBT法_
SOD试剂盒说明说书(100孔)
超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒- WST®操作说明书 100孔
*本试剂盒（货号：S311）只能用于检测SOD的活性，不能用于检测超氧阴离子（O2- ）
本说明书提供了下列两种检测方法。 方法 1（检测 SOD 抑制率法）：100 孔可以检测 18-29 个样品。 方法 2（检测 SOD 活性法）： 100 孔可以检测 4-13 个样品。 两种方法的操作和实验结果准确度都有区别，请根据您的具体情况和实验准确度要求选择。如有疑问，请按照说明书下 方的联系方式咨询技术人员。
检测机理
超氧化物歧化酶（SOD）是一种重要的抗氧化酶，它可以催化超氧阴离子（O2- ）的歧化反应，生成过氧化氢和单
质氧。目前有很多种直接或间接地测量SOD活性的方法，在这些方法中，使用硝基蓝四唑（氮蓝四唑nitroblue tetrazolium ，
简称NBT）的一种间接测量方法因其便捷、简单的使用方法而被广泛应用。但是，NBT法存在一些缺点，例如生成的染 料（Formanzan dye）的水溶性较低，会和黄嘌呤氧化酶的还原型发生反应等问题。SOD检测试剂盒- WST®提供了更为 简便的检测SOD的方法，它是利用同仁化学研究所研发的高度水溶性四唑盐WST®-1（2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4二磺酸苯基)-2氢-四唑盐,二钠盐），能与超氧阴离子（O2- ）反应生成一种水溶性的染料。WST®-1被超氧阴离子还原的 比率与黄嘌呤氧化酶的活性线性相关，并且会被SOD所抑制（见下图，即红色区域SOD反应优先发生，SOD反应完后蓝
至10 ml，4℃下，600 g 离心10分钟。 4. 弃上清液，加入等量的生理盐水至沉淀中，制成悬液。4℃下，600 g 离心10分钟。重复此步骤1次。 5. 在沉淀中加入4.0 ml蒸馏水，制成悬液。加入1 ml乙醇和0.6 ml氯仿。 6. 将混合后的液体，盖紧盖子， 4℃下用振荡器强烈震荡15分钟。 7. 在4℃下，将混合液600 g，离心10分钟，随后将上层水乙醇层小心移入一支新的试管中。 8. 取出0.1 ml的水乙醇层，加入0.7 ml蒸馏水，制成红细胞样品溶液。
超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(邻苯三酚法)产品技术要求百奥泰康
超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（邻苯三酚法）适用范围：该产品用于体外定量测定人血清中超氧化物歧化酶的活性。
1.1 产品规格1.2 组成成分1.2.1 试剂组成试剂1：Tris缓冲液 100mmol/LEGTA 1mmol/L试剂2：试剂2: 邻苯三酚 20mmol/L1.2.2 校准品的组成单个水平的冻干校准品，校准品组成是在牛血清（20g/L）中加入含不同浓度的超氧化物歧化酶纯品，稳定剂<5%。
定值范围：(80-180)U/mL。
1.2.3质控品的组成单个水平的冻干质控品，质控品组成是在牛血清（20g/L）中加入含不同浓度的超氧化物歧化酶纯品，稳定剂<5%。
定值范围：(100-300)U/mL。
2.1 外观液体双试剂：试剂1：无色澄清液体，试剂2：无色澄清液体。
校准品：冻干品，溶解后为无色至浅黄色透明液体。
质控品：冻干品，溶解后为无色至浅黄色透明液体。
2.2 净含量液体试剂的净含量不得低于标示体积。
2.3 试剂空白2.3.1 空白吸光度试剂空白吸光度A应≤1.0。
2.4 分析灵敏度样品中SOD值在 150U/mL时，分析灵敏度应≥0.0052.5 线性在[15，400] U/mL线性范围内，线性相关系数r≥0.99。
在[15，100]U/mL范围内的绝对偏差不超过15U/mL；在(100，400]U/mL范围内线性相对偏差不超过±15%。
2.6 精密度试剂盒测试项目精密度 CV≤10%。
2.7 批间差不同批号之间测定结果的相对极差≤20% 。
2.8 准确度回收试验：回收率应在90%-110%之间。
2.9 瓶间重复性（均一性）校准品、质控品瓶间重复性CV≤5%2.10 质控品赋值有效性测定值在质控靶值范围内。
2.11校准品溯源性要求根据GB/T21415-2008《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品控制物质赋值的计量学溯源性》及有关规定提供超氧化物歧化酶校准品的来源、赋值过程以及测量不确定度等内容。
超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒说明书
Beijing Solarbio Science & Technology Co., LtdTel: 400-968-6088超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒说明书微量法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC0175规格：100T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称规格保存条件提取液液体110 mL×1瓶2-8℃保存试剂一液体5 mL×1瓶2-8℃保存试剂二液体100 μL×1支2-8℃保存试剂三液体4 mL×1瓶2-8℃保存试剂四液体0.25mL×1支2-8℃保存溶液的配制：1、试剂二：使用前先离心再吹打混匀。
根据样本量将试剂二用蒸馏水稀释10倍后使用，当天用完。
2、试剂四：根据样本量将试剂四用蒸馏水稀释5倍后使用，当天用完。
产品说明：SOD（EC 1.15.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化超氧化物阴离子发生歧化作用，生成H2O2和O2。
SOD不仅是超氧化物阴离子清除酶，也是H2O2主要生成酶，在生物抗氧化系统中具有重要作用。
通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O2-)，O2-可还原氮蓝四唑生成蓝色甲臜，后者在560nm 处有吸收；SOD可清除O2-，从而抑制了甲臜的形成；反应液蓝色越深，说明SOD活性愈低，反之活性越高。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、细胞超声破碎仪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1.细胞、细菌样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎（功率200w，超声3s，间隔10s，重复30次）。
超氧化物歧化酶SOD活性测定
什么叫逆境？
逆境的种类?
逆境是指对植物生存生长
不利的各种环境因素的总称.
为什么要测定 完全液和缺素 苗的SOD 活性？
二、目的要求：
1.了解SOD活力测定的实践意义； 2.掌握SOD测定的原理及操作要点； 3.比较完全液溶液和缺素溶液培养的
超氧化物歧化酶(SOD)
活性测定
(NBTБайду номын сангаас)
一、测定意义 二、目的要求 三、原理 四、仪器设备 五、试剂配制 六、植物材料 七、操作步骤 八、结果计算 九、注意事项 十、思考题
一、意义：
植物正常情况下
细胞内自由基的产生和消除处于动态平 衡状态，自由基水平很低，不会伤害细 胞。
植物逆境胁迫下
植物体内活性氧代谢系统的平衡被打破
九、注意事项:
1.所用试管的玻璃质量要一样。包括厚度、直径、质量等。 2. 照光条件要一致。照光时试管放的高度、背景等。 3. 要多做对照消除日光灯管的光质差异。
4. 植物组织中的酚类物质对测定有干扰，对酚类含量高的材料提取酶液时 可加入聚乙烯吡咯烷酮消除。 5. 结果计算时要用相邻对照管代入公式计算。
石英砂
→研磨成匀浆→再加入3ml缓冲液,?研磨均匀后, 将匀浆液倒入聚乙烯离心 管中→低温(0～4℃)下、4800rpm 离心10min ─→上清液即为酶液， 将上清液倒入小青霉瓶，低温下贮存，供SOD活性测定。
? 2.SOD 活性测定：
取6支试管, 编号, 按下表加入试剂。将1号管用黑纸袋套上, 与其它试管 一起放荧光灯下, 光强3000Lx 照光10min, 到时间后关灯, 用黑布罩上试 管(如室内光线不强, 不罩黑布也可), 以1号试管溶液为参比, 测定样品在 560nm 处的吸光度。 ?不加酶的 2号试管溶液颜色最深 ; 加入酶的由于 SOD抑制了硝基四唑蓝的光还原,颜色变浅。
SOD测定方法（NBT）
SOD活性的测定（NBT法）一、原理超氧化物歧化酶（SOD）抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而生成O2.－，O2.－可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大吸收。
而SOD可清除O2.－，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
二、试验材料、主要仪器及试剂（一）试验材料龙眼、荔枝胚性愈伤组织（二）主要仪器（1）型号为Cary5的紫外分光光度计（2）高速台式离心机（3）研钵（4）指形管（10ml）（三）试剂（1）0.05mol/L pH7.8 磷酸缓冲液分别称取8.1938g Na2HPO4·12H2O和0.3316g NaH2PO4·2H2O于100ml小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入500ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，充分混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液称取1.9389g Met用磷酸缓冲液溶解定容至100ml。
4℃冰箱中保存可用1～2d。
（3）750μmol/L NBT溶液称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液溶解定容至100ml，避光保存。
4℃冰箱中保存可用2～3d。
（4）20μmol/L核黄素溶液称取0.0075g核黄素，用磷酸缓冲液溶解定容至1000ml，现配现用，避光保存。
（5）100μmol/L EDTA-Na2溶液称取0.0372g EDTA-Na2，用蒸馏水溶解定容至1000ml。
（6）SOD提取介质0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）内含1%~4%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。
（7）石英砂三、操作方法步骤（1）SOD粗酶液的提取称取龙眼（荔枝）胚性愈伤组织0.5g于预冷的研钵中，加2ml预冷的提取介质和少量石英砂，在冰浴中研磨成匀浆，转移至10ml量瓶中，用提取介质冲洗研钵2～3次（每次1～2ml），合并冲洗液于量瓶中，定容至10ml。
氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力
氮蓝四唑（NBT ）法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力一、 目的与要求SOD 在植物抗逆过程中发挥着重要的作用，通过本实验理解其抗逆机理，熟悉其操作步骤及其计算方法。
二、原理SOD 是普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O 2-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大吸收。
而SOD 可清除O 2-，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
一个酶活力单位定义为将NBT 的还原抑制到对照一半（50％）时所用的酶量。
222222SOD O H H O O -+−−−→+222222CAT H O H O O −−−→+三、材料、仪器设备及试剂（一）材料：水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx ）；5.试管（三）试剂：1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8: 0.2mol/L Na 2HP04 91.5 ml; 0.2mol/L NaH 2P048.5 ml ）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met ）溶液：称1.9397gMet 用磷酸缓冲液定容至100ml ；3. 750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至100ml ，避光保存；4. 100μmol/L EDTA －Na 2溶液：称取0.03721gEDTA －Na 2用磷酸缓冲液定容至1000ml ；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g 核黄素用蒸馏水定容至1000ml 避光保存。
四、实验步骤1. 酶液提取：取叶片0.5g 于预冷的研钵中，加2ml 预冷的PH 7.8的磷酸缓冲液，在研钵上研磨成匀浆，加缓冲液使终体积为10ml ，取5ml 于4度下4000rpm 离心15min ，上清液即为SOD 粗提液。
总超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(NBT 核黄素比色法)
检测，如超过检测范围，用SOD检测缓冲液稀释后检测。
血清去除红细胞的简易方法如下：用抗凝管收集血液，颠倒混匀。
取至少500μl全血，4℃3000g离心5min。
转移上清至另一新的1ml离心管中，适量生理盐水稀释后待测。
亦可采用红细胞裂解液去除红细胞，如Leagene ACK红细胞裂解液等。
②组织样本：动物用含有20U/ml heparin的生理盐水(0.9% NaCl containing 20U/ml heparin)灌流清除血液后获取组织样品。
按照每100mg组织加入500μl SOD检测缓冲液的比例，用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆。
4℃，4000g离心10min。
取上清液(SOD粗提液)用于酶活性的测定。
③细胞样本：对于贴壁细胞，由于后续用于酶活性的测定，避免使用胰酶消化细胞。
可以使用用细胞刮或EDTA处理细胞收集细胞。
细胞用无菌的PBS或生理盐水洗涤1次。
按照每106细胞加入300-500μl SOD检测缓冲液的比例用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆，4℃10000g离心10min，取上清液(SOD粗提液)用于酶活性的测定。
④上述样品准备完毕后可以BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。
通常10-20μg蛋白的细胞或组织匀浆液样品其中的SOD平均活力约1个活力单位左右(不同细胞和组织的差异会比较大，该活力范围仅作为初步的参考)。
每种样品准备20-100μg蛋白量通常已经足够用于后续检测。
根据蛋白浓度和预计的蛋白使用量，用本试剂盒提供的SOD检测缓冲液适当稀释样品。
例如，小鼠肝脏组织10%匀浆液(组织和匀浆液的重量比为10%)上清，通常需要稀释10-100倍。
准备好的样品如果当天测定，可。
超氧化物歧化酶测定试剂盒(SOD底物法)产品技术要求华宇亿康
超氧化物歧化酶测定试剂盒（SOD底物法）适用范围：本试剂用于体外定量测定人血清中超氧化物歧化酶（SOD）的活性。
1.1 产品型号/规格试剂1：1×15mL、试剂2：1×5mL；试剂1：1×30mL、试剂2：1×10mL；试剂1：8×15mL、试剂2：8×5mL；试剂1：1×45mL、试剂2：1×15mL；试剂1：2×30mL、试剂2：2×10mL；试剂1：4×30mL、试剂2：4×10mL；试剂1：8×45mL、试剂2：8×15mL；试剂1：1×60mL、试剂2：1×20mL；试剂1：2×60mL、试剂2：2×20mL；试剂1：3×60mL、试剂2：3×20mL；试剂1：3×60mL、试剂2：1×60mL；试剂1：4×60mL、试剂2：4×20mL；试剂1：5×60mL、试剂2：5×20mL；试剂1：8×60mL、试剂2：8×20mL；试剂1：3×40mL、试剂2：2×20mL；试剂1：4×30mL、试剂2：1×40mL；试剂1：4×45mL、试剂2：4×15mL；试剂1：1×7.5mL、试剂2：1×2.5mL；试剂1：1×15L、试剂2：1×5L；试剂1：1×9L、试剂2：1×3L；试剂1：1×3L、试剂2：1×1L；试剂1：1×900mL、试剂2：1×300mL。
校准品（选配）：0.5mL/瓶×1瓶1.2 主要组成成分试剂1：Tris缓冲液100mmol/L试剂2：邻苯三酚20mmol/L乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸1mmol/L牛血清白蛋白适量Proclin-300适量校准品（选配）：超氧化物歧化酶 120.0U/mLProclin-3000.5‰Tris缓冲液 100mmol/L 牛血清白蛋白 40g/L校准品值具有批特异性，每批定值，具体定值见瓶签。
NBT法测定SOD活力
NBT法测定SOD活力1.原理超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（O2.-）的酶，它催化下列反应：2 O2.- + 2H+→H2O2 + O2反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
实验中依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2.-，O2.-可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除O2.-，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可计算出酶活性大小。
2.试剂50mM，PH7.8磷酸缓冲液（57.1875mL A + 5.3125mL B定容至250mL）130mM甲硫氨酸，0.1940g →10mL，磷酸缓冲液配制750µM NBT，0.0061g →10mL，磷酸缓冲液配制100µM EDTA-Na2，0.0037g →100mL，磷酸缓冲液配制20µM 核黄素，0.00753g →100mL，蒸馏水配制，避光保存附录：不同pH 磷酸缓冲液的配制母液：A：0.2M Na2HPO4溶液：Na2HPO4.12H2O 71.64g用蒸馏水溶至1LB：0.2M NaH2PO4溶液：NaH2PO4.2H2O 15.60g用蒸馏水溶至500mL100mM磷酸缓冲液配法：x(mL)A + y(mL)B稀释至200 mL3.实验步骤（1）酶液粗提称取一定量的实验材料于预冷的研钵中，加入适量磷酸缓冲液，冰浴充分研磨后定容（1mL/0.1g）。
取1.5mL匀浆于4℃,10000rpm离心15min，上清液即为酶粗提液。
（POD，CAT，MDA，可溶性蛋白等的测定均按此方法提取）（2）反应液配制取透明度好的指形管或离心管，按下表依次加入各溶液：试剂（酶液）用量/µL 终浓度/比色时50mM磷酸缓冲液600130mM Met 120 13 mM750µM NBT 120 75µM 100µM EDTA-Na2120 10µM20µM 核黄素120 2.0µM酶液20 对照以缓冲液代替酶液蒸馏水100总体积1200混匀后将1只对照管放在暗处，其它各样品于4000lx日光下反应20min（各管受光必须一致，温度高则缩短时间，低则延长）。
NBT法测定SOD活力
NBT法测定SOD活力1.原理超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（O2.-）的酶，它催化下列反应：2 O2.- + 2H+→H2O2 + O2反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
实验中依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2.-，O2.-可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除O2.-，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可计算出酶活性大小。
2.试剂50mM，PH7.8磷酸缓冲液（57.1875mL A + 5.3125mL B定容至250mL）130mM甲硫氨酸，0.1940g →10mL，磷酸缓冲液配制750µM NBT，0.0061g →10mL，磷酸缓冲液配制100µM EDTA-Na2，0.0037g →100mL，磷酸缓冲液配制20µM 核黄素，0.00753g →100mL，蒸馏水配制，避光保存附录：不同pH 磷酸缓冲液的配制母液：A：0.2M Na2HPO4溶液：Na2HPO4.12H2O 71.64g用蒸馏水溶至1LB：0.2M NaH2PO4溶液：NaH2PO4.2H2O 15.60g用蒸馏水溶至500mL100mM磷酸缓冲液配法：x(mL)A + y(mL)B稀释至200 mL3.实验步骤（1）酶液粗提称取一定量的实验材料于预冷的研钵中，加入适量磷酸缓冲液，冰浴充分研磨后定容（1mL/0.1g）。
取1.5mL匀浆于4℃,10000rpm离心15min，上清液即为酶粗提液。
（POD，CAT，MDA，可溶性蛋白等的测定均按此方法提取）（2）反应液配制取透明度好的指形管或离心管，按下表依次加入各溶液：试剂（酶液）用量/µL 终浓度/比色时50mM磷酸缓冲液600130mM Met 120 13 mM750µM NBT 120 75µM 100µM EDTA-Na2120 10µM20µM 核黄素120 2.0µM酶液20 对照以缓冲液代替酶液蒸馏水100总体积1200混匀后将1只对照管放在暗处，其它各样品于4000lx日光下反应20min（各管受光必须一致，温度高则缩短时间，低则延长）。
总SOD活性检测试剂盒使用说明
和其它各种溶液。加入反应启动工作液后充分混匀。注意：加入反应启动工作液后反应即会
开始，可以在低温操作或用排枪操作以减小各孔间因加入反应启动工作液的时间先后差异而
导致的误差。
样
品
空白对照
空白对照
空白对照 3
(Sample)
1(Blank1)
2(Blank2)
(Blank3)*
待测样品
20μ l
－
－
20μ l
参考上图 A 和 B ，SOD 酶活力和抑制百分率呈非线性关系，而 1/SOD 酶活力和 1/ 抑
制百分率成线性关系。上图仅作参考，不同的样品不同的检测条件，实际测定获得的标准曲 线的斜率和截距可能和上图有较明显的差别。
SOD 酶活力的计算公式如下： 待测样品中 SOD 酶活力单位＝检测体系中 SOD 酶活力单位＝抑制百分率 / (1 －抑制
4. 样品中总 SOD 活力的计算： a. 抑制百分率的计算： 参考如下计算公式计算抑制百分率： 抑制百分率 ＝ [(A 空白对照 1－A 空白对照 2) －(A 样品－A 空白对照 3)] / (A 空 白对照 1－A 空白对照 2) × 100% 如果没有设置空白对照 3，则可以把计算公式简化为： 抑制百分率 ＝ (A 空白对照 1－A 样品) / (A 空白对照 1－A 空白对照 2) × 100% 如果计算出来的抑制百分率小于 30% 或大于 70% ，则通常需要把该样品重新测定。尽 量使样品的抑制百分率在 30-70%范围内。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需适当稀释 样品；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度较高的待测样品。 b. SOD 酶活力单位的定义：在上述黄嘌呤氧化酶藕联反应体系中抑制百分率为 50% 时，反应体系中的 SOD 酶活力定义为 一个酶活力单位(unit)。注意：SOD 的活力单位的定义方式有很多种，不同的活力单位 需根据其定义的不同进行适当换算。 c. SOD 酶活力的计算：
sod检测试剂盒原理
sod检测试剂盒原理
SOD检测试剂盒是检测超氧化物歧化酶（SOD）活性的试剂盒。
SOD是
细胞内一种主要的抗氧化酶，在细胞内起到非常重要的保护作用，能够清
除细胞内的超氧自由基，防止氧化应激反应的发生。
SOD检测试剂盒原理是利用人工合成的邻苯二酚（NBT）受到还原剂
还原的特性。
SOD能够在NBT中间断超氧离子链的传导，从而阻止NBT的
还原反应，使得NBT变为黄色，从而测定样品中超氧化物离子的清除能力。
一般的SOD检测试剂盒中，SOD活性的计算方法通常是根据清除反应
液中NBT的比例来计算的，反映出样品中SOD活性的高低。
总SOD活性检测试剂盒(
100U/ml，50U/ml，20U/ml, 10U/ml， 5U/ml，1U/ml，0.1U/ml，0.01U/ml，0.001U/ml。在随后的检测中可以各取20微
升，参考样品进行检测。说明：本试剂盒对于SOD的检测并不需要SOD作为标准品，但可以使用SOD标准品作为阳性
对照或作为对SOD活性定量的参考。
组织样品，加入碧云天的Western及IP细胞裂解液(P0013)或其他适当溶液进行匀浆。对于匀浆产物，4℃离心取上清作
为待测样品。裂解或匀浆宜在冰浴或4℃进行操作。
c. 红细胞或血浆样品的准备：用抗凝管收集血液，颠倒混匀。4℃ 600g离心10分钟，移取上清至另一新的1ml离心管 中，适量生理盐水稀释后即可作为血浆样本进行检测。红细胞样品可同细胞样品的准备，可以用碧云天的Western及IP
c. 在560nm测定吸光度。可以使用大于650nm的波长作为参考波长进行双波长测定。
4. 样品中总SOD活力的计算：
a. 抑制百分率的计算：
参考如下计算公式计算抑制百分率：
抑制百分率 ＝ [(A空白对照1－A空白对照2)－(A样品－A空白对照3)] / (A空白对照1－A空白对照2) × 100% 如果没有设置空白对照3，则可以把计算公式简化为：
细胞裂解液(P0013)或其他适当的裂解液裂解。
d. 上述样品准备完毕后可以用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋
白浓度。通常10-20微克蛋白的细胞或组织裂解液或匀浆液样品其中的SOD平均活力约1个活力单位左右。每种样品准
备20-100微克蛋白量通常已经足够用于后续检测。
e. 根据蛋白浓度和预计的蛋白使用量，用本试剂盒提供的稀释液适当稀释样品。裂解好的样品通常至少需要加入等体积
sod测定方法
SOD氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD 可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。
（三）试剂 1. L 磷酸缓冲液（）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称用磷酸缓冲液定容至100ml；μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4. 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。
三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。
取～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。
2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）L 磷酸缓冲液L Met溶液L 750μmol/L NBT溶液μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液μmol/L 20μmol/L 核黄素μmol/L 酶液支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水总体积混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。
总SOD活性检测试剂盒使用说明
总SOD活性检测试剂盒使用说明以下是总SOD活性检测试剂盒的使用说明：1.实验前准备：-将试剂盒从-20℃的冰箱中取出，并在室温下平衡15-30分钟。
-将提取的细胞溶液、组织提取液、血清或其他生物样本稀释。
2.样本处理：-将处理后的样本分成实验组和对照组。
对照组不加入样本，只加入稀释缓冲液。
-实验组中添加适量的处理后的样本。
3.加入工作液：-对每个孔加入100μl的稀释缓冲液。
-对照组孔和实验组孔分别加入提取液和样本。
4.加入底物液：-对每个孔加入50μl的底物液。
-快速混合并轻轻振荡。
5.反应：-将微板封闭，并在37℃恒温箱中孵育20分钟。
6.终止反应：-加入50μl的终止液至每孔中，立即轻轻振荡。
-让反应停止5分钟。
7.测量：- 使用微板阅读器，设置吸光度测量波长为450 nm，并读取吸光度值。
-记录吸光度值。
8.计算结果：-使用提供的标准曲线，通过吸光度值计算样本中的SOD活性。
- 结果以单位为ml/min/mg蛋白表示。
9.注意事项：-实验过程中保持试剂和样本在恒温条件下。
-避免光照，尽量在暗室或避光条件下进行实验。
-每个步骤都要轻轻振荡混合，确保均匀混合。
-温度、时间和步骤都要严格控制，避免操作差异对结果的影响。
-样本处理要严格按照说明进行，不得有任何误操作。
总SOD活性检测试剂盒是一种方便易用的实验工具，可以快速、准确地测量样本中的SOD活性。
通过使用本试剂盒，可以有助于深入研究SOD 在生物体内的功能和机制，从而进一步认识抗氧化系统的重要性。
同时，在药物研发、疾病诊断和治疗等方面也具有一定的应用前景。
总SOD活性检测试剂盒(WST法)
总SOD活性检测试剂盒(WST法)产品编号产品名称包装S0102 总SOD活性检测试剂盒(WST法) 100次产品简介：¾碧云天的总SOD活性检测试剂盒(WST法)(Total Superoxide Dismutase Assay Kit with WST-1)是一种基于WST-1的显色反应，通过比色来检测细胞、组织或其它样品中SOD即超氧化物歧化酶活性的试剂盒。
¾超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD)能催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生成过氧化氢(H2O2)和氧气(O2)，是生物体内一种重要的抗氧化酶。
¾目前有多种SOD活性测定法，其中NBT(氮蓝四唑)法由于使用方便而被广泛使用。
但NBT法产生的甲臜染料水溶性差，易和被还原的黄嘌呤氧化酶相互作用，抑制百分率达不到100%等，从而使检测的灵敏度和精确度受到影响；细胞色素C法也是一种常用来检测SOD活性的方法，但细胞色素C其氧化活性高，易受样品中的还原剂干扰，另外该方法需要连续测定吸光度值，对于SOD的检测灵敏度比较低，并且不太适合大批量样本的检测。
¾本试剂盒采用了目前测定SOD方法中最先进的WST-1法。
WST-1即2-(4-Iodophenyl)- 3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt。
参考下图，WST-1可以和黄嘌呤氧化酶催化产生的超氧化物阴离子反应产生水溶性的甲臜染料(formazan dye)，该反应步骤可以被SOD所抑制。
通过对WST-1产物的比色分析即可计算SOD的酶活力。
基于黄嘌呤氧化酶藕联反应体系和WST-1的SOD酶活力检测原理图。
XO：xanthine oxidase。
¾WST-1本身吸光度很低，且反应产物是稳定的水溶性产物，提高了SOD检测的灵敏度和特异性，适合高通量筛选研究。
一种用于检测血清中SOD的胶乳增强免疫比浊法试剂盒[发明专利]
![一种用于检测血清中SOD的胶乳增强免疫比浊法试剂盒[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/14f635b43b3567ec112d8aa0.png)
专利名称：一种用于检测血清中SOD的胶乳增强免疫比浊法试剂盒
专利类型：发明专利
发明人：不公告发明人
申请号：CN201510441147.9
申请日：20150724
公开号：CN106290871A
公开日：
20170104
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种定量检测人血清中SOD胶乳增强免疫比浊试剂盒。
试剂盒中包含试剂
R1、试剂R2和校准品；其中试剂R1包含缓冲溶液、电解质、反应增强剂、稳定剂和防腐剂；试剂R2包含抗SOD抗体致敏胶乳颗粒、缓冲溶液、电解质、稳定剂、表面活性剂和防腐剂；校准品中包含缓冲溶液、稳定剂、防腐剂以及SOD重组蛋白；本发明利用多克隆抗体包被胶乳颗粒结合胶乳增强免疫比浊的方法优势，使得本发明试剂盒具有灵敏度高、准确性好、线性范围宽泛、高通量检测的优点，非常适合临床诊断应用。
申请人：北京华宇亿康生物工程技术有限公司
地址：102200 北京市昌平区科技园区兴昌路1号2幢三层
国籍：CN
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SOD酶活性测定方法
SOD酶活性测定所需药品：（1）0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液：A液：0.1mol/l磷酸氢二钠液B液：0.1mol/l磷酸二氢钠液1毫升B+10.76毫升A（2）0.026mol/l蛋氨酸液（Met）：现用现配称取0.3879克蛋氨酸，用1号液定容至100毫升。
（3）75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）液：现用现配称取0.1533克NBT，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至250毫升。
（4）1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液（5）0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液（6）石英砂实验步骤：1.酶液制备：称取0.5克鲜叶，放入研钵中，加入3毫升5号液和少量石英砂，于冰浴中研成匀浆。
然后用5号液定容至8毫升，于0～4℃、13000g时离心15分钟，上清液即为酶提取液。
酶液可在低于0℃下的环境中保存。
2.按下表加入试剂：试剂摇匀后，迅速遮光处理1号杯，其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟，然后立即遮光。
接着在560nm下，以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。
假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%，然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。
M/N=100/XM——2、3号杯中溶液的光密度的平均值N——其余杯中溶液的光密度值X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率然后以酶液量为横坐标，以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率（X）为纵坐标制作曲线，根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位。
结果计算：SOD活力按下式计算：A=V*1000*60/（B*W*T）A——酶活力（酶活力单位·g-1·FW·h-1）V——酶提取液体积（毫升）B——一个酶活力单位的酶液量（微升）W——样品鲜重（克）T——反应时间（分）因测定样品数量多时也可用下列简式计算：A=（D1-D2）*V*1000*60/（D1*B*W*T*50%）D1——2、3号杯光密度的平均值D2——测定样品的光密度值。
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液。配制好的反应启动工作液4℃或冰浴保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。
c. (可选做)SOD标准品准备：需自备SOD标准品，用本试剂盒提供的稀释液将SOD标准品稀释至如下系列浓度：
200U/ml，100U/ml，50U/ml，20U/ml，10U/ml，5U/ml，2U/ml。在随后的检测中可以各取20微升，参考样品进行检
中，适量生理盐水稀释后即可作为血浆样本进行检测。红细胞样品可以参考步骤1a细胞样品的制备方法，或其它不含
Triton X-100等去垢剂的样品制备方法。
d. 上述样品准备完毕后可以用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋
超氧化物岐化酶活性水平。本试剂盒的检测原理图如下:
基于黄嘌呤氧化酶藕联反应体系和NBT的SOD酶活力检测原理图。XO：xanthine oxidase。 本试剂盒的检测不受样品中过氧化氢的干扰。很多细胞和组织样品中含有内源性的过氧化氢，会干扰SOD的检测。本试
剂盒通过添加适量过氧化氢酶等特殊方法，能有效去除常规样品中过氧化氢的干扰。例如，对于SOD标准品的检测，标 准品中添加高达0.1mM的过氧化氢时，对于检测结果仍无显著影响。 本试剂盒可以检测细胞或组织匀浆液上清、全血、红细胞抽提物、血清等生物样品中的SOD活性。一个试剂盒共可以进 行100次检测。
测。说明：为避免稀释后SOD酶活性的下降， SOD标准品宜现稀释现使用；本试剂盒对于SOD的检测并不需要SOD作
为标准品，但可以使用SOD标准品作为阳性对照或作为对SOD活性定量的参考。
3. 样品测定：
a. 参考下表使用96孔板设置样品孔和各种空白对照孔。并按下表依次加入待测样品和其它各种溶液。加入反应启动工作
液(组织和匀浆液的重量比为10%)上清，通常需要稀释10-100倍。准备好的样品如果当天测定，可以冰浴保存；如果
当天不能完成测定，可以-70℃冻存，但建议尽量当天完成测定。
2. 试剂盒的准备工作： a. NBT/酶工作液的配制：按照每个反应160μl的体积配置适量的NBT/酶工作液。均匀混合158μl SOD检测缓冲液、1μl NBT和1μl酶溶液，即可配置成160μl NBT/酶工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配置适量的NBT/酶工作
b. 组织样品的准备：动物用生理盐水(0.9% NaCl，含有0.16mg/ml肝素钠)灌流清除血液后获取组织样品。取适量的组织
样品，加入4℃或冰浴预冷的PBS在4℃或冰浴进行匀浆(可以使用玻璃匀浆器或各类常见电动匀浆器)。随后匀浆液4℃
离心，取上清作为待测样品。
c. 血浆或红细胞样品的准备：用抗凝管收集血液，颠倒混匀。4℃ 600g离心10分钟，移取上清至另一新的1ml离心管
较高的待测样品。
b. SOD酶活力单位的定义：在上述黄嘌呤氧化酶藕联反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD酶活力定义为
一个酶活力单位(unit)。注意：SOD的活力单位的定义方式有很多种，不同的活力单位需根据其定义的不同进行适当换
算。
c. SOD酶活力的计算：
参考上图A和B，SOD酶活力和抑制百分率呈非线性关系，而1/SOD酶活力和1/抑制百分率成线性关系。上图仅作 参考，不同的样品不同的检测条件，实际测定获得的标准曲线的斜率和截距可能和上图有较明显的差别。 SOD酶活力的计算公式如下： 待测样品中SOD酶活力单位＝检测体系中SOD酶活力单位＝抑制百分率 / (1－抑制百分率) units 例如，当抑制百分率为50%时，待测样品中SOD酶活力单位＝50% / (1－50%)units＝1 unit；当抑制百分率为60%时， 待测样品中SOD酶活力单位＝60% / (1－60%)units＝1.5 units。 d. 如果样品为细胞或组织的匀浆液，可以根据样品的蛋白浓度和稀释倍数，将SOD活力单位换算为U/g或U/mg蛋白。如 果样品为红细胞抽提液，可以根据血红蛋白含量，可换算为U/克血红蛋白或U/毫克血红蛋白。 附1：SOD酶活力计算的参考方案：可以先使用本试剂盒绘制SOD标准品的抑制百分率曲线，然后根据样品检测到的抑制 百分率对比标准品的抑制百分率曲线计算出样品中的SOD酶活力单位。本方案仅供参考，使用本试剂盒时不必使用本 方案进行检测和计算。此外，本方案需确保标准品的酶活力数据可靠，不会因为标准品的保存问题而导致实际酶活力 下降。 附2： SOD酶活力的动力学检测：如果条件许可，使用本试剂盒时也可以使用动力学方法检测SOD的酶活力。通常在步骤 3a后可以37℃孵育同时在560nm连续测定吸光度30分钟。根据30分钟内的吸光度变化的斜率计算出抑制百分率： 抑制百分率 ＝ [(斜率空白对照1－斜率空白对照2)－(斜率样品－斜率空白对照3)] / (斜率空白对照1－斜率空白对照2) × 100% 其余的计算方法同上述非动力学的计算方法。动力学方法的检测和计算更加精确一些，但检测起来相对要麻烦一些。 使用本试剂盒通常使用非动力学方法即可。
超氧化物岐化酶(Superoxidቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ Dismutase, SOD)能催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生成过氧化氢(H2O2)和氧气(O2)，是生 物体内一种重要的抗氧化酶。
本试剂盒采用经典的氮蓝四唑(NBT)显色法。通过黄嘌呤(Xanthine)及黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase)反应系统产生超氧 阴离子(O2-.)，将氮蓝四唑还原为蓝色的甲臜(formazan)，后者在560nm处有强吸收。而SOD可清除超氧阴离子，从而抑制 了甲臜的形成。反应液蓝色愈深，说明超氧化物岐化酶活性愈低，反之则酶活性愈高。据此通过比色分析就可以计算出
液后充分混匀。注意：加入反应启动工作液后反应即会开始，可以在低温操作或用排枪操作以减小各孔间因加入反应
启动工作液的时间先后差异而导致的误差。
样品(Sample)
空白对照1(Blank1) 空白对照2(Blank2) 空白对照3 (Blank3)*
待测样品
20μl
－
－
20μl
SOD检测缓冲液
－
20μl
抑制百分率 ＝ (A空白对照1－A样品) / (A空白对照1－A空白对照2) × 100% 如果计算出来的抑制百分率小于30%或大于70%，则通常需要把该样品重新测定。尽量使样品的抑制百分率在30-70%
范围内。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需适当稀释样品；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度
包装清单：
产品编号 S0109-1 S0109-2 S0109-3 S0109-4
—
产品名称 SOD检测缓冲液
NBT 酶溶液 反应启动液(40X) 说明书
包装 70ml 100μl 100μl 60μl 1份
保存条件：
-20℃保存，半年有效。S0109-2 NBT溶液需避光保存。
注意事项：
待测样品-70℃可保存1个月。需注意反复冻融会导致SOD部分失活。 细胞或组织等样品制备时不能采用含有Triton X-100等去垢剂的溶液，否则会干扰本试剂盒的检测。 抗氧化物会对本试剂盒的检测产生干扰，例如0.1mM ascorbic acid，5mM GSH都会使测定出来的吸光度显著升高。此时
液。具体配置方法可以参考下表。配制好的NBT/酶工作液4℃或冰浴保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现
用。注意：由于酶溶液的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。
待测样品数量 SOD检测缓冲液(μl)
1
10
20
50
158
1580
3160
7900
NBT(μl)
1
10
20
尽管样品没有颜色，如果设置了使用说明中的空白对照3，就可以消除样品中的抗氧化物的干扰。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：
1. 样品的准备： a. 细胞样品的准备：收集细胞，用4℃或冰浴预冷的PBS或生理盐水洗涤1-2遍。沉淀用预冷的PBS在4℃或冰浴进行匀浆
(可以使用玻璃匀浆器或各类常见电动匀浆器)。随后匀浆液4℃离心，取上清作为待测样品。
分钟。
c. 在560nm测定吸光度，可以使用大于650nm的波长作为参考波长进行双波长测定。
4. 样品中总SOD活力的计算：
a. 抑制百分率的计算：
参考如下计算公式计算抑制百分率：
抑制百分率 ＝ [(A空白对照1－A空白对照2)－(A样品－A空白对照3)] / (A空白对照1－A空白对照2) × 100% 如果没有设置空白对照3，则可以把计算公式简化为：
白浓度。通常10-20微克蛋白的细胞或组织匀浆液样品其中的SOD平均活力约1个活力单位左右(不同细胞和组织的差异
会比较大，该活力范围仅作为初步的参考)。每种样品准备20-100微克蛋白量通常已经足够用于后续检测。
e. 根据蛋白浓度和预计的蛋白使用量，用本试剂盒提供的SOD检测缓冲液适当稀释样品。例如，小鼠肝脏组织10%匀浆
产品编号 S0109
总SOD活性检测试剂盒(NBT法)
产品名称 总SOD活性检测试剂盒(NBT法)
包装 100次
产品简介：
碧云天的总SOD活性检测试剂盒(NBT法)(Total Superoxide Dismutase Assay Kit with NBT)是一种基于NBT的显色反应，通 过比色来检测细胞、组织或其它样品中SOD即超氧化物歧化酶活性的试剂盒。
40μl
20μl
NBT/酶工作液
160μl
160μl
160μl
160μl
反应启动工作液
20μl
20μl
－
－
*如果样品有颜色或含有抗氧化物质，则需设置空白对照3；如果样品没有颜色并且也不含有抗氧化物则没有必要设置
空白对照3。
b. 37℃孵育30分钟。说明：孵育25至35分钟检测出来的SOD活力无显著差异，但为保证检测结果的一致性，推荐孵育30