凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量16页PPT

4. 收集与鉴定
用自动部分收集器收集流出液，每管4ml， 紫外检测仪280nm波长处检测，最高的一 个OD值时的体积即为吸收峰的洗脱体积 Ve。
5．凝胶柱的处理
凝胶用过后，反复用蒸馏水洗后保存，如 果有颜色或比较脏，可用0.5mol/LNaCl洗 涤。短期可保存在水相中，加入防腐剂或 加热灭菌后于低温保存。建议长期用干燥 状态保存。
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、 呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的 直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网 孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大 小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装 填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动 而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液 移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而 小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再 扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层 析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。 若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物 质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相 对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和 扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间 也不同，从而彼此可以分离开来。
1、不要轻言放弃，否则对不起自己。
2、要冒一次险!整个生命就是一场冒险。走得最远的人，常是愿意 去做，并愿意去冒险的人。“稳妥”之船，从未能从岸边走远。-戴尔．卡耐基。
梦 境
3、人生就像一杯没有加糖的咖啡，喝起来胶层析法测定蛋白质相对分子质量 4、守业的最好办法就是不断的发展。 5、当爱不能完美，我宁愿选择无悔，不管来生多么美丽，我不愿失 去今生对你的记忆，我不求天长地久的美景，我只要生生世世的轮 回里有你。
计算
分子量的测定和计算，一般都采用标准曲线 法。只要测得几种标准蛋白质相对分子质 量的Ve，并以它们的相对分子质量的对数 (logMr)对Ve作图得一直线，再测出待测样 品的Ve，即可从图中确定它的相对分子质 量。
注意事项
各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损， 否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应 无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产 生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱 内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处， 应仔细检查并加以纠正。
始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发， 凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量 气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变 坏，不得不重新装柱。
如果假定蛋白质分子近于球形，同时没有显著的水合 作用，则不同大小分子量的蛋白质，在洗脱时峰的位置和 该物质相对分子质量有直接的定量的关系。在一根凝胶柱 中，凝胶颗粒间空隙所含水相体积为外水体积VＯ，不能 进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为时VＯ，出现 洗脱峰。
凝胶颗粒内部孔穴的总体积为内水体积Vi，能全部渗 入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为VＯ+Vi时，出现洗脱 峰。
利用Andrews的实验经验式：
lgMr = a/b—Ve/bVo 式中，Ve为洗脱体积。它是自加样品开始到该组分的 洗脱峰（峰顶）出现时所流出的体积。Vo为外水体积， Mr为相对分子质量，a和b为常数。 葡聚糖凝胶有不同的型号，用于分离不同相对分子质 量大小的物质。例如Sephardex G-75的分级范围是300080000的球形分子。在本实验中用于分离胰岛素（Mr为 6000）和牛血清蛋白（Mr75000）。
将洗脱剂与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析 柱相连。通过2—3倍柱床容积的洗脱液使柱床 平衡，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤 布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保 持凝胶上端有一段液体。
3. 上样与洗脱
样品上柱是实验成败的关键之一，若样品稀释 或上柱不均，会使区带扩散，影响层析效果。 上样时应尽量保持床面的稳定。先打开柱的出 口，待柱中洗脱液流至距床表面1～2mm时，关 闭出口，用滴管将1ml样品慢慢地加至柱床表面， 应避免将床面凝胶冲起，打开出口并开始计算 流出体积，当样品滲入床中接近床表面1mm时 关闭出口。按加样操作，用少量（约1ml）洗脱 液冲洗管壁2次。最后加入少量洗脱液于凝胶上， 使高出床表面3～5cm，旋紧上口螺丝帽，柱进 水口连通恒流泵，调好流速，以每管3ml/10min 流速开始洗脱。上样的体积，分析用量为柱床 容积的1—2%；制备用量为柱床容积的 20%~30%。
2. 装柱与平衡
装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出，将层析 柱垂直装好。关闭出口，向柱管内加入约1/3柱 容积的洗脱液，然后在搅拌下，将浓浆状的凝 胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉 降约2—3cm后，打开柱的出口，调节合适的流 速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离 柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。装 柱要求连续、均匀、无气泡、无“纹路”。
凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量
实验目的
掌握凝胶层析的基本原理。 学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质
量的实验技能。
实验原理
凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具 有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层 析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析 柱时，其中各组分按其分子大小不同而被 分离的技术。该法设备简单、操作方便、 重复性好、样品回收率高。
仪器和试剂
仪器：层析柱、恒流泵、紫外检测仪、自动部分 收集器
试剂
待测样品：胰岛素、牛血清白蛋白 蓝色葡聚糖2000；Sephardex G-75；洗脱剂
实验步骤
1．凝胶溶胀 凝胶颗粒要求大小比较均匀 ，可流速稳定，
结果较好。 取葡聚糖Sephardex G-75干粉，加过量的蒸馏
水室温充分溶胀一天（溶胀时间因凝胶交联度不 同而不同），或沸水浴中溶胀3小时，这样可大大 缩短溶胀时间，而且可以杀死细菌和霉菌，并可 排出凝胶内气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌， 以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易 沉下的细小颗粒，最后凝胶经减压抽气除去气泡， 即可准备装柱。