凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量16页PPT

2. 装柱与平衡
装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出，将层析 柱垂直装好。关闭出口，向柱管内加入约1/3柱 容积的洗脱液，然后在搅拌下，将浓浆状的凝 胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉 降约2—3cm后，打开柱的出口，调节合适的流 速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离 柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。装 柱要求连续、均匀、无气泡、无“纹路”。
凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量
实验目的
掌握凝胶层析的基本原理。 学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质
量的实验技能。
实验原理
凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具 有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层 析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析 柱时，其中各组分按其分子大小不同而被 分离的技术。该法设备简单、操作方便、 重复性好、样品回收率高。
如果假定蛋白质分子近于球形，同时没有显著的水合 作用，则不同大小分子量的蛋白质，在洗脱时峰的位置和 该物质相对分子质量有直接的定量的关系。在一根凝胶柱 中，凝胶颗粒间空隙所含水相体积为外水体积VＯ，不能 进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为时VＯ，出现 洗脱峰。
凝胶颗粒内部孔穴的总体积为内水体积Vi，能全部渗 入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为VＯ+Vi时，出现洗脱 峰。
4. 收集与鉴定
用自动部分收集器收集流出液，每管4ml， 紫外检测仪280nm波长处检测，最高的一 个OD值时的体积即为吸收峰的洗脱体积 Ve。
5．凝胶柱的处理
凝胶用过后，反复用蒸馏水洗后保存，如 果有颜色或比较脏，可用0.5mol/LNaCl洗 涤。短期可保存在水相中，加入防腐剂或 加热灭菌后于低温保存。建议长期用干燥 状态保存。
计算
分子量的测定和计算，一般都采用标准曲线 法。只要测得几种标准蛋白质相对分子质 量的Ve，并以它们的相对分子质量的对数 (logMr)对Ve作图得一直线，再测出待测样 品的Ve，即可从图中确定它的相对分子质 量。
注意事项
各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损， 否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应 无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产 生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱 内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处， 应仔细检查并加以纠正。
1、不要轻言放弃，否则对不起自己。
2、要冒一次险!整个生命就是一场冒险。走得最远的人，常是愿意 去做，并愿意去冒险的人。“稳妥”之船，从未能从岸边走远。-戴尔．卡耐基。
梦 境
3、人生就像一杯没有加糖的咖啡，喝起来是苦涩的，回味起来却有 久久不会退去的余香。
凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量 4、守业的最好办法就是不断的发展。 5、当爱不能完美，我宁愿选择无悔，不管来生多么美丽，我不愿失 去今生对你的记忆，我不求天长地久的美景，我只要生生世世的轮 回里有你。
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、 呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的 直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网 孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大 小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装 填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动 而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液 移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而 小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再 扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层 析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。 若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物 质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相 对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和 扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间 也不同，从而彼此可以分离开来。
利用Andrews的实验经验式：
lgMr = a/b—Ve/bVo 式中，Ve为洗脱体积。它是自加样品开始到该组分的 洗脱峰（峰顶）出现时所流出的体积。Vo为外水体积， Mr为相对分子质量，a和b为常数。 葡聚糖凝胶有不同的型号，用于分离不同相对分子质 量大小的物质。例如Sephardex G-75的分级范围是300080000的球形分子。在本实验中用于分离胰岛素（Mr为 6000）和牛血清蛋白（Mr75000）。
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仪器和试剂
仪器：层析柱、恒流泵、紫外检测仪、自动部分 收集器
试剂
待测样品：胰岛素、牛血清白蛋白 蓝色葡聚糖2000；Sephardex G-75；洗脱剂
实验步骤
1．凝胶溶胀 凝胶颗粒要求大小比较均匀 ，可流速稳定，
结果较好。 取葡聚糖Sephardex G-75干粉，加过量的蒸馏
水室温充分溶胀一天（溶胀时间因凝胶交联度不 同而不同），或沸水浴中溶胀3小时，这样可大大 缩短溶胀时间，而且可以杀死细菌和霉菌，并可 排出凝胶内气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌， 以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易 沉下的细小颗粒，最后凝胶经减压抽气除去气泡， 即可准备装柱。
始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发， 凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量 气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变 坏，不得不重新装柱。
将洗脱剂与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析 柱相连。通过2—3倍柱床容积的洗脱液使柱床 平衡，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤 布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保 持凝胶上端有一段液体。
3. 上样与洗脱
样品上柱是实验成败的关键之一，若样品稀释 或上柱不均，会使区带扩散，影响层析效果。 上样时应尽量保持床面的稳定。先打开柱的出 口，待柱中洗脱液流至距床表面1～2mm时，关 闭出口，用滴管将1ml样品慢慢地加至柱床表面， 应避免将床面凝胶冲起，打开出口并开始计算 流出体积，当样品滲入床中接近床表面1mm时 关闭出口。按加样操作，用少量（约1ml）洗脱 液冲洗管壁2次。最后加入少量洗脱液于凝胶上， 使高出床表面3～5cm，旋紧上口螺丝帽，柱进 水口连通恒流泵，调好流速，以每管3ml/10min 流速开始洗脱。上样的体积，分析用量为柱床 容积的1—2%；制备用量为柱床容积的 20%~30%。