体细胞胚胎发生和人工种子
人工种子
人工种子
1、人工种子的概念
植物人工种子概念有狭义和广义之分。
狭义的概念是指植物离体培养中产生的胚状体（包括体细胞胚和性细胞胚），包裹在含有养分和具有保护功能的物质中，并在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。
但由于技术原因以及花粉胚状体等性细胞胚有遗传分离或单倍体不育等不足，所以目前主要应用的是体细胞胚。
胚状体是由非合子细胞分化形成的类似于胚的结构物，在一定条件下，其可以通过胚胎发育程序形成植株。
自然界中仅在少数植物中偶尔发现有天然形成的胚状体。
胚状体在其发育早期与不定芽十分相似，但胚状体具有明显的极性，可以分化出茎端和根端，同时它的维管束与其母体的维管束系统不是紧紧相连，所以，较易从母体脱离。
广义而言，人工种子是在胚状体或一块组织（顶芽、腋芽）、一个器官（小鳞茎等）之外加上必要的营养成分（人工胚乳）后，用具有一定通透性而无毒的材料将其包裹起来，形成的与天然种子相似的颗粒体。
甚至不经包裹，作适当处理后直接播种发芽的体细胞胚，混在胶体物质中，用流质播种法直接播种的体细胞胚等也属于此类。
但由于植物的种子有胚乳型与无胚乳型之分，对于无胚乳型植物的健壮胚体不需要加入人工胚乳也能在有菌条件下发芽，而有胚乳型植物的体细胞胚的生长需要附加人工胚乳，且其人工种子发芽成苗显著低于前者。
2、人工种子的基本制作流程
人工种子的制作主要包括胚状体的诱导、包裹制作与发芽试验。
以海藻酸钠包裹细胞胚制作人工种子的研究可分为：愈伤组织诱导→体细胞胚诱导→体细胞胚的同步化→体细胞胚的分选→体细胞胚的包裹（相当于种子的胚乳或子叶）→包裹外膜→人工种子的贮藏→发芽成苗试验→检查体细胞变异程度及农艺研究。
人工种子——精选推荐
人工种子（artificial seeds）的研制。
1、人工种子：即人为制造的种子，它是一种含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其他成分的人工胶囊。
人工种子又称合成种子或体细胞种子，任何一种繁殖体，无论是在涂膜胶囊中包裹的，裸露的或经过干燥的，只要能够发育成完整的植株，均可称之为人工种子。
根据包被的需要程度可分为三类：第一类是裸露的或休眠的繁殖体，如可以适当干燥的体细胞胚(如鸭毛草的体细胞胚)，休眠的微鳞茎和微块茎等，它们在不加包被的情况下也具有较高的成株率；第二类为人工种皮包被的繁殖体，一些体细胞胚，原球茎等虽不能过度干燥，但只需人工种皮包被即可维持良好的发芽状态，如胡萝卜体细胞胚；第三类是水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体，大多数体细胞胚，不定芽，茎尖等均需要先包埋在半液态凝胶中，再经人工种皮包裹才能避免失水，从而维持良好的发芽能力。
与试管苗技术和自然有性繁殖种子相比,人工种子具有以下突出的，甚至是不可取代的优点：其一，在无性繁殖植物中，有可能建立一种高效快速的繁殖方法，它既能保持原有品种的种性，又可以使之具有实生苗的复壮效应；其二，可以对优异杂种种子不通过有性制种而快速获得大量种子，特别是对于那些制种困难的植物更具有重要的实用意义；其三，对于一些不能正常产生种子的特殊植物材料如三倍体，非整倍体，基因工程植物等，有可能通过人工种子在短期内加大繁殖应；其四，与田间制种相比，可以节省制种用地，且不受季节限制，可以实现工厂化生产，同时还避免了种子携带病原菌的危险；其五，与利用试管苗相比，可以避免移栽困难，且可以实现机械化操作，同时还便于储藏和运输。
2、人工种子的构成及特点：（1）人工种皮：包裹在人工种子最外层的胶质化合物薄膜，具有进行气体交换、防止营养物的渗漏、抗机械压力。
（2）人工胚乳：人工配制的保证胚状体营养物质。
（3）胚状体：胚状体是由组织培养产生的具有胚芽、胚根和类似天然种子胚的结构，具有萌发长成植株的能力。
组培——精选推荐
植物组织培养：是指在无菌和人工控制的环境的条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。
根据培养的可分为：愈伤组织培养、悬浮培养、器官培养、茎尖分生组织培养、原生质体培养。
根据培养过程分为：初代培养、继代培养、生根培养根据培养基的物理状态分为：固体培养，液体培养，半固体培养，双层培养脱分化：也称去分化，是指离体培养条件生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或成为未分化细胞特征的细胞的过程。
再分化：离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官、甚至完整植株的，这个过程成为再分化。
*器官发生型：由愈伤组织不同部位产生不定芽或不定根，而且通常是单极性的。
*胚胎发生型：由愈伤组织产生胚状体或称体细胞胚，胚状体是双极性的，芽根间有维管组织连接，可独立生长完成整植物体。
*外植体：在植物组织培养中，由植物体上取下来，进行离体培养的那部分组织或器官。
植物组培的应用：1理论研究反面的应用：研究细胞分化和器官建成影响因素的主要方法。
2快速繁殖：离体诱导不定芽分化和促进腋芽增殖。
3人工种子制备：通过诱导体细胞胚（胚胎发生）制备人工种子。
4次生产物生产：有用化合物工业化生产。
5脱毒培养：离体茎尖培养技术可脱去病毒，解决无性繁殖植物品种退化。
6植物种植资源的保存和交换，保存物种多样性。
7遗传操作a突变体的筛选b离体授粉及胚胎培养：克服远远杂交不亲和性（受精前/后障碍）c原生质融合：可获得有性杂交不能产生的杂种，产生细胞质杂种d单倍体诱导：花药培养技术可缩短杂合体纯合时间，加速育种进程e遗传进化：基因工程不可缺少的部分。
一准备室：材料，培养器械的清洗，培养基准备，灭菌的工作。
*1普通化学实验室：仪器及设备化学药品（纯水仪，冰箱，过滤灭菌器，电炉，微波炉，磁力搅拌器，低速台式离心机，电脑等。
人工种子的研究现状和发展前景
人工种子的研究现状和发展前景白雪11021295411级种工二班引言种子不仅是植物种续代繁衍之本，而且也是人类衣食之源。
春种一粒粟，秋收万颗籽。
”农业上传统的种植方式，大多是用种子播种来进行作物的繁殖与栽培。
植物人工种子的制作，是在植物组织培养基础上发展起来的一项生物技术。
“细胞工程技术的开展，为作物的育种与繁殖提供了不少新的技术手段。
在离体培养条件下，植物学家们已可使植物的一个芽、一小块茎、一小块叶甚至一个细胞再生成为小植株；在实验室里，一年四季可生产出成千上万的试管植物来。
植物人工种子作为一项新兴的生物技术，为农业生产展示了诱人的前景，已引起世界各国的重视。
尽管尚未进入应用阶段。
但目前植物人工种子技术发展迅速，在不久的将来定能发挥出其潜在的优势。
一．人工种子的概念植物人工种子（plant artificial seed）概念最早由Murashige （1978）提出，它是指利用细胞的全能性，将植物离体培养中产生的体细胞胚或能发育成完整植株的分生组织（芽、愈伤组织、胚状体等）包埋在含有营养物质具有保护功能的外壳内形成的在适宜条件下能够能够发育成完整植株的小颗粒。
天然的植物种子是由种皮、胚、胚乳三部分组成。
种皮是由珠被受精后发育而来，常具有多层细胞：外部为厚壁细胞，内部几层为薄壁细胞，排列紧密，有极强的保护作用机械力量。
胚乳由受精极核发育来，含有大量养料，为胚发育提供营养。
胚由受精卵（合子）发育而来，由胚芽、胚轴、胚根、子叶组成，将来发育成新的植株。
完整的人工种子包括：人工种皮、人工胚乳胚状体（体细胞胚）3 部分。
有的人工种皮是指海藻酸钠与氯化钙络合形成的包在胚状体等材料外的藻酸钙层，它具有一定的硬度，有保护功能。
有的人工种子在海藻酸钠胶囊外又包一层高分子化合物（Elvax4260 或聚丙烯酸酯），种皮就是指这层高分子化合物外膜。
人工种皮上没有种脐、种孔等结构。
人工胚乳常是人工配制的能供胚良好生长的培养基。
体细胞胚发生
植物物种和品种基因型影响 愈伤组织的分化
• 程林梅等（2001）的研究表明，利用不同 基因型大豆品种的下胚轴作外植体进行组培时， 培养基对愈伤组织的影响不明显；细胞分裂素 （KT）和NAA的配比浓度对其愈伤组织的分 化影响显著；不同基因型大豆植株再生作用差 异明显；外植体取材时间和取材部位对再生植 株的形成也具有较大的影响，再生能力最强的 取材部位时从子叶节到下胚轴6mm区段,当下 胚轴长到2~3cm时取材最佳。
2 氮源 除生长素外，培养基中氮源的形态也会影响离 体条件下的胚胎发生。只有当培养基中含有一定量 的还原态氮时，才能出现胚胎发生过程。 在以KNO3为唯一氮源的培养基上建立起来的 愈伤组织，去掉生长素后不能形成胚。然而，若在 55mmol/LKNO3的培养基中加入少量的 (5mmol/L)NH4Cl形态的氮，胚胎发生过程就会出 现。
不同浓度的激素对烟草愈伤组织的影响
愈伤分化
器官分化的植物激素控制理论
• 大量的实验结果表明：
大多数植物组织或器官的再生作用符合器 官分化的植物激素控制理论。
即：生长素与细胞分裂素的比例小时则产 生苗，比例大时则生根，而两种激素的比例适中 时，则产生无结构的愈伤组织。
器官发生途径
外植体 脱分化 愈伤组织 再分化
• 1.4.1.2位置效应
1.4.2 器官分化信息传递
1.4.2.1 胞外信号分子
• 胞外通讯信号分子又称第一信使(first messenger)。在植物细胞外的通讯信号分子，， • 如植物激素主要通过维管束系统在细胞与器官间 进行调节。它在植株的某些发育阶段，于特， • 部位发生作用。植物激素信号由位于膜或其它部 位的受体所接收，进一步直接或间接地影响： • 因表达。当植物激素以直接的形式影响基因表达 时，就会产生在转录、翻译等水平上的不同， • 应，从而控制酶的合成，影响代谢变化，最终产 生某些生理反应。
8人工种子
第一节 人工种子的概念
• 一. 基本概念
• 广义 而言，人工种子是在胚状体或一块组 织（顶芽、腋芽）、一个器官（小鳞茎等） 之外加上必要的营养成分（人工胚乳）后， 用具有一定通透性而无毒的材料将其包裹 起来，形成的与天然种子相似的颗粒体
• 狭义 的概念是指植物离体培养中产生的胚 状体（包括体细胞胚和性细胞胚），包裹 在含有养分和具有保护功能的物质中，并 在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。
• 1986年Redenbaugh等成功地利用藻酸钠包埋 单个体细胞胚，生产人工种子。 • 胡萝卜、棉花、玉米、甘蓝、莴苣、苜蓿等人工 种子制作获得成功。
• 目前已有许多国家的植物基因公司和大学实验室 从事这方面研究。欧共体将人工种子的研制列人 “尤里卡”计划，我国也于1987年将其列入国家 高新技术研究与发展计划(863计划)。经过20多 年的努力，人工种子研究已取得了很大进展。
茶树
体细 胞胚
不定 芽 体细 胞胚 不定 芽, 4%
0.5-1.0
1.0
0.5
GA(0.3), IAA(0.3-0.5) IAA(0.3) 1.0
Step II, 30
MS, 2-3%
1.0
0.5
25 Step I, 25
MS, 2-3% MS, 3% 1.0
1.0 0.2
表7.3 部分植物繁殖体诱导培养条件
植物 种类
繁殖 体类 型 体细 胞胚 微芽 体细 胞胚 桉树 微芽 培养程序 及培养天 数
Step I, 21
培养基 及蔗糖 浓度
MS, 3%
激素浓度（mg./L）
2,4-D 2.0 NAA 1.0 Zeatin 1.0 BA Kin
其它成分 (mg/L)
植物细胞工程的发展史
综述一般都包括题名、著者、摘要、关键词、正文、参考文献几部分。
其中正文部分又由前言、主体和总结组成。
植物细胞工程的历史回顾与展望摘要：概要介绍了植物细胞工程的历史回顾与主要分支学科及其研究进展。
包括原生质体培养、细胞融合与体细胞杂交、胚胎培养和试管受情、组织和细胞培养生产有用物质、单倍体育种、体细胞无性系变异‘细抱突变体的筛选、植物快速萦殖技术‘体细胞胚胎发生和人工种子、组织细胞培养物的超低温保存以及转基因植物等关键词：植物细胞工程概况植物组织培养农业生物技术生物技术：以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需新产品或达到某种目的。
植物细胞工程：以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新品种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程。
（一）探索阶段（1902-1929）19世纪30年代，细胞学说的确立。
1902年，德国著名植物生理学家Haberlandt, 首次进行高等植物的细胞培养实验，但细胞未能发生细胞分裂和增殖。
1904年，Hanning对萝卜和辣根菜未成熟胚进行培养，离体胚可以充分发育并提早形成小苗。
1922年，Kundson采用胚培养法获得了兰花幼苗，克服兰花种子发芽困难的问题。
1922年，美国的Robbins和德国的Kotte分别报道了培养离体根尖获得的某些成功。
这是有关根培养的最早的实验。
1925年Laibach把亚麻种间杂交形成的不能成活的种子中的胚剥出，人工培养至成熟。
因此可以认为，幼胚培养和胚胎拯救（embyrorescue）技术是最早应用的植物细胞工程技术。
（二）培养技术与理论的建立与发展阶段（1930-1959）20世纪30年代，植物组织培养技术基本建立。
李继侗（1933年）将3mm以上的银杏胚培养成功，并且发现加入胚乳汁可以促进离体胚的成长。
植物组培复习总结
第一章植物细胞组培：在离体条件下利用人工培养基对植物器官、组织、细胞原生质体等进行培养，使其长成完整株体。
类型 1器官培养 2茎尖分生组织培养3愈伤组织培养 4细胞培养 5原生质体培养植物组培特点:1培养条件可认为控制 2 生长周期短，繁殖率高 3管理方便，利用工厂化生产和自动化控制植物细胞全能性：每个植物体细胞或性细胞都具有该植物的全套遗传基因，因此在一定条件下培养都可发育成一个与母体一样的植株。
植物细胞变现全能性必须经过的步骤:成熟细胞——分生细胞——胚状体——完整植株成熟细胞——愈伤组织——出根出芽——完整植株愈伤组织:原本指植物受伤后在表面形成的一团薄壁细胞。
植物组培中特指人工培养基上形成的无数生长的薄壁细胞。
脱分化：已经完全分化定型的细胞，经过诱导成为重新恢复分裂能力的细胞的过程。
诱导细胞脱分化是处于抑制的，需要外接条件刺激，在各条件中，激素起重要作用。
4类植物 1有些植物只需生长素——IAA吲哚乙酸 NAA萘乙酸 2,4-D 如菊苣2 有些仅需细胞激动素萝卜大豆3 须加细胞激动素和生长素烟草胡萝卜马铃薯4不需加任何激素烟草愈伤组织再分化：植物成熟细胞经过脱分化后（形成愈伤组织后），由愈伤组织再形成完整植株的过程。
植物组培过程取组织——形成愈伤组织——幼胚——植物幼体——成熟植株脱分化再分化*以高度分化的动物体细胞的细胞核具有全能性植物组培动物组培原理植物细胞全能性细胞增殖培养基性质固体培养基液体培养基培养基特有成分蔗糖、植物生长调节剂葡萄糖、动物血清培养结果植物植株细胞系、细胞株获得细胞或细胞分泌物培养目的快速繁殖、培育无病毒植株等植物组培发展简史探索阶段施莱登施旺创立细胞学说提出理念细胞学说要点1动植物均由细胞组成2所有细胞来自其他细胞3卵和精子是细胞4单个细胞可分裂形成组织5细胞遗传全能性；组培技术哈勃兰特成功培育出植物提供理论基础奠基阶段怀特配制出培养基认识到维生素和植株激素在植物组培中的重要作用崔徵用不同种类和比例植物激素处理离体培养的烟草茎段和髓发现腺嘌呤和生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一斯图尔特证实哈波兰特50年前理论正确性快速发展阶段 MS培养基 PEG原生质体融合法植物遗传转化体细胞无性系变异人工种子植物组培应用1增加遗传变异性，改良作物2繁殖植物无性系：组培中从一个单细胞、一块愈伤组织、一个芽等器官都可获得无性系。
《林木生物技术》复习题、资料
《林木生物技术》复习题一、名词讲解题1、愈伤组织的驯化2、胚状体3、愈伤组织4、基因克隆5、人工种子6、感觉态细胞7、器官发生8、植物体细胞杂交9、载体10、外植体11、植物生物技术12、植物细胞全能性13、化学恒定培养14、基因15、选择标记基因二、辨析题1、辨析分化、脱分化和再分化。
2、辨析培养细胞器官发生的几个学说的差别。
3、比较花药培养和小孢子培养的异同。
4、比较自然突变和培养细胞突变的异同。
5、比较体细胞杂交四各样类的差别。
6、愈伤组织的驯化与其形态发生潜力的丧失有何差别？7、辨析体细胞胚发生的几个学说。
8、比较茎尖培养脱毒、愈伤组织培养脱毒、花药（或花粉）培养脱毒以及珠心胚培养脱毒的机理。
9、比较原生质体培养方法的异同。
10、比较有性杂种、体细胞杂种与细胞质杂种的差别。
11、比较体细胞发生与器官发生的差别。
12、低温保存和冷冻保存有何差别？13、比较可遗传变异和表观遗传变异的特点。
三、简答题1、简述分生组织防备病毒侵染的系统。
2、简述植物组织培养实验室的组成与功能。
3、怎样引诱和调治不同样种类的愈伤组织？4、简述将外源基因导入植物细胞的方法。
5、简述常有的鉴于PCR 的各分子标记的基根源理。
6、举例说明组织培养过程中植物细胞决定作用的表现。
7、简述依照培养基中无机盐含量而划分的培养基种类。
8、简述农杆菌介导的基因转移方法。
9、简述分子标记协助育种的优点。
10、简述基因克隆工具酶的特点和用途。
11、怎样理解植物细胞全能性的表达？12、简述培养物对氮素吸取利用致使培养基pH 发生的变化。
13、简述植物组织培养器官发生中，重生植株形态发生的基本形式。
14、简述农杆菌介导的遗传转变机理。
15、简述 RAPD 标记技术的优缺点。
四、阐述分析题1、试述基因克隆的过程。
2、试述影响花药和花粉培养的因素。
3、试述迅速生殖植物种苗各阶段技术举措。
4、试举例说明分子标记的主要应用方面。
5、试述无机营养在植物组织培养中的作用以及培养物的吸取特点。
植物生物技术名词解释
生物技术:也称生物工程, 是指以现代生命科学为基础,结合先进的工程技术手段和其他基础科学的科学原理, 按照预先的设计改造生物体或加工生物原料, 为人类生产出所需要的产品或达到某种目的的一系列技术。
重组DNA技术：采用分子生物学操作方法，在体外将外源DNA与载体DNA构建成具有自我复制能力的DNA分子，通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有该外源DNA的转化细胞，在进行增殖。
细胞工程:指应用细胞生物学和分子生物学的方法，在细胞水平进行的遗传操作。
愈伤组织:植物外植体脱分化、经过细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。
体细胞胚:又叫胚状体，是指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。
人工种子:是将植物离体培养产生的体细胚包埋在含有营养成分和保护功能的物质中，在适宜的条件下发芽出苗。
茎尖培养:取植物茎尖组织放入培养液中进行的无菌培养。
植物组织培养:在含有营养物质及植物生长物质的培养液中，培养离体植物组织（器官或细胞）并诱导使其长成完整植株的技术。
细胞全能性:广义的细胞全能性指一个细胞发育成一个完整有机个体的潜能和特性。
植物细胞的全能性指具有完整细胞核的细胞，在适宜的条件下能够分化发育成完整植株的潜在能力。
无病毒苗：未被病毒感染，或经人工处理去除病毒的植物苗株。
外植体:从植株上切离、用于培养的部分或器官称为外植体。
植物胚胎培养：在无菌条件下对植物的胚、子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育成完整植株的技术。
单细胞培养:指从植物器官、愈伤组织或悬浮培养物中游离出单个细胞，在无菌条件下，进行外培养，使其生长、发育的过程。
细胞悬浮培养:指将植物的细胞和小的细胞聚集体悬浮在液体培养基中进行培养，使之在体外生长、发育，并在培养过程中保持很好的分散性。
体细胞无性系变异：指植物体细胞在组织培养过程发生变异，进而导致再生植株发生遗传改变的现象。
细胞突变体:指将植物细胞培养在附加一定化学物质的培养基上，用生物化学的方法诱导细胞遗传物质的改变，从细胞水平上大量筛选拟定目标突变体。
第十五章体细胞胚胎发生和人工种子
5）源于原生质体的胚状体，如玉米、黄瓜。
体细胞胚胎发生的同步控制
在培养中体细胞胚胎的发生一般是不同步的。控制胚状体的同步发育是人工种子的重要条件。
现在常用以下几种方法对体细胞胚的发生进行同步控制。
1）同步脱分化促进细胞的同步分裂 细胞培养初期加入DNA合成抑制剂（如五氨基脲嘧啶），使细胞DNA合成暂时停止。一旦除去DNA抑制剂，细胞开始进入同步分裂。
凝胶囊中直接加入大量元素、碳水化合物及防病用抗生素。
2）微型包裹法
首先将碳水化合物和大量元素包裹在微型胶囊内，然后再把微型胶囊和种胚一起包裹在褐藻酸钙（人工种子）中。目的是使人工胚乳的营养成分在人工种子内缓慢地释放，提高种子的存活时间。
2、人工种子的研究现状
人工种子具备了组培试管苗的全部优点，具有巨大的应用潜力：
1、愈伤组织的诱导
愈伤组织的形成大致要经过起动期、分裂期和形成期三个阶段。
1）起动期 当外植体已分化的活细胞在外源植物生长物质的作用下，通过脱分化起动而进入分裂时期，进而形成愈伤组织。此期的细胞大小无明显变化，胞内RNA含量迅速明显增加，细胞核变大。
2）分裂期 是指细胞通过一分为二的方式不断增生子细胞的过程。外植体的细胞一旦经过诱导，其外层细胞开始细胞分裂，使细胞脱分化。此期细胞分裂快、结构疏松、缺少组织结构。
图15.3 人工种子的结构
1 、人工种子的制备
A、体细胞胚的制备
体细胞胚的发生方式
体细胞胚胎（胚状体）可由表皮细胞、愈伤组织、悬浮细胞、花粉、原生质体等发生：
1） 来源于外植体的表皮细胞，如石龙芮、刺五加、芹菜等；
2） 来源于愈伤组织细胞，如玉米、西洋参桃等；
第六章 人工种子的研制
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图6.1 人工种子及其萌发。左图为人工种子示意图（Redenbaugh，1990），中图 为用海藻糖包裹胚状体制成的芹菜人工种子，右图为水稻人工种子的发芽
二、人工种子的研制的意义
• （一）繁殖产生人工种子速度快、数量多、效率高。例如用液体培养基方法 在1升培养基中可产生10万个体细胞胚胎，而在一个体积为12升的发酵罐中， 20多天内生产的胡萝卜体细胞胚可制成1000万粒人工种子。与微繁殖一样， 它不受季节气候和空间的限制，可全年进行，具有占空间小，快速、高效等 优点。 • （二）与微繁殖一样，人工种子属无性繁殖，不存在基因型和表现型的分离， 非常适于固定和繁殖杂种（尤其是需三系配套生产的杂种一代）及雄性不育 系、优良单株、突变体及遗传工程筛选出的优良基因型等。另外，对一些珍 稀名贵品种或经济价值较高的品种、不能产生种子、种子发育不全、或自然 条件萌发率极低的植物，以及存在较长的幼年期（或童期）的木本树种等也 具有重要的应用前景。 • （三）人工种子内可以加入农药、菌肥或有益微生物及激素等，改善和调节 植物的抗逆能力和生长发育。 • （四）利用体细胞胚胎发生途径可进行基因转移，因此人工种子可作为遗传 工程的受体或向生产实践应用的桥梁。 • （五）与试管快繁相比，人工种子操作方便，便于运输、贮存及机械化作业， 节省劳动力和生产成本。这对快繁苗木及人工造林等方面具有很大的应用优 势。
（四）单个体细胞胚胎的分离
• 在单个体细胞胚胎包裹这前，可利用机 械切割或在2%蔗糖溶液中浮力不同分级 筛选1.0 mm长度或以上的单个体细胞胚。
（五）体细胞胚的包裹及人工胚乳研制 •
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1. 胶囊和胶囊膜制备 ①胶囊和胶囊膜制备材料 人工种子研制所用的包裹材料（有时也称为人工种皮或内种皮）要求质地柔软，能保 护内部的体细胞胚胎并且不能对胚胎有毒害作用，另外要求通气效果好，能形成胶囊， 抗压性好，不粘连，适于贮藏、运输和播种。常用的包裹材料有藻酸盐、藻酸盐-明胶、 琼脂糖、琼脂等，但由于藻酸盐胶凝性好、使用方便、无毒性和价格低廉，目前以藻 酸盐应用较多。Redenbaugh等（1986）采用海藻酸钠作包裹材料，制成苜蓿人工种子， 离体成株率达86%，播种于温室，成株率可达20%。虽然海藻酸钠应用较广，但以海藻 酸钠单一材料包埋体细胞胚及类体胚材料也存在不少缺点，如保水性差、水溶性成分 及助剂易渗漏、易干燥失水、干燥后不能吸水回胀、易粘连、机械强度差，从而影响 到人工种子的贮藏、运输、播种和萌芽。许光学等（1990）采用纤维素衍生物与海海 藻酸钠制成复合改性的包埋基质，可提高包裹材料的透气性。黄绍兴等（1995）用木 薯淀粉与海海藻酸钠制成复合包埋基质，可改善海海藻酸钠的吸水性。Timber等 （1995，1996）在海海藻酸钠中加入多糖、树胶、高岭土等可减慢凝胶脱水的速度。 日本麒麟啤酒公司与美国植物遗传工司（PGI）联合研制成一种新的包埋胶胶衣，可在 一定条件下自行裂开，顺利萌发。 由于单一包裹材料存在的缺陷，因此许多研究者对胶囊膜材料（外种皮）进行了试验， 但只有Elvax 4260效果较好。Ling-Fong Tay（1993）年用壳聚糖作为外种皮制作油菜 人工种子。除涂复外膜外，许多研究者还采用组合包埋法、流体播种法、液胶包埋法、 琼脂或铝胶囊等包埋法等新的方法。许光学等（1990）筛选聚合物材料对人工种子进 行包埋。George等（1995）用硅胶包埋谷子体细胞胚，萌发率达82%，在4℃条件下贮 藏14天可自行裂开萌发。
植物组织培养-绪论
大蒜愈伤组织培养
日本牵牛花的离体培养
禾本科牧草的体胚发生过程
菊花体细胞胚胎 发生及植株再生
大蒜体细胞胚 胎发生过程
01 人工种子（Ar tificial seed，Synthetic
02 Seed）：是指植物离 体培养产生的胚状体或 不定芽被包裹在含有营 养和保护功能的人工胚 乳和人工种皮中，从而 形成能发芽出苗的颗粒 体。作为繁殖材料。
1934年，美国的White（怀特） 用无机盐、糖类和酵母抽提物的 培养基进行番茄根尖切段培养， 建立了第一个活跃生长的无性繁 殖系。无机盐、三种B族维生素、 取代酵母浸出液（1934→1968） 继代1600代后仍能正常生长。
1943年，white出版了第一本专 著《植物组织培养手册》《A Hand Book of Plant Tissue Culture》。
体细胞胚胎发生
贯叶金丝桃不定芽直接再生过程
非洲紫罗兰叶片培养
无BAP BAP 0.1mg/l BAP 5.0mg/l 无NAA
优化培养基 1%蔗糖
无蔗糖 5%蔗糖
无BAP BAP 0.1mg/l BAP 5.0mg/l 无NAA
优化培养基 1%蔗糖
无蔗糖 5%蔗糖
台湾百合离体 培养
大花蕙兰原球茎增 殖与植株再生
可概括为以下四个方面：
1962 Murashige & Skoog 在烟草培养中筛选出卓 有成效的MS培养基。
2. 原生质体培养取得突破：
1971 Takebe 在烟草上首次由原生质体获得了 再生植株。再次证实植物细胞的全能性。原生质 体培养为外源基因的导入提供了理想的受体，促 进了体细胞融合技术的发展细胞水平→分子水平
植物学名词解释 (8)
1．传递细胞：A结构特点：初生壁具有次生性的内突生长，形成指状、鹿角状突起，使质膜面积增大，有利于原生质体与外界进行物质交换。
胞间连丝发达，核多样，细胞器丰富（1.5分）。
B部位：出现于溶质短途密集运输的部位，如小叶脉、节和花序节部、分泌结构、子叶、胚乳、胚柄、中央细胞和反足细胞、珠被绒毡层和伴胞等（1.5分）。
C.功能：一种特化的薄壁细胞，具有高效的传递和运输能力（1分）。
2．植物细胞的编程性死亡：A指在一定生理和病理条件下，细胞遵循自身的程序，主动结束生命的过程，属正常的生理性死亡（1.5分）。
B细胞表现为染色质降解，核DNA形成寡聚小体片段，细胞质浓缩，内质网成泡状，具自溶作用，主动耗能（1.5分）。
C根毛死亡，管状分子死亡，大孢子退化，叶的衰老等都属于编程性死亡。
它以与有丝分裂相反的方式来调节细胞群的相对平衡，是长期演化的结果（1分）。
3．细胞编程性死亡：A指在一定的生理和病理条件下，细胞遵循自身的程序，主动结束生命的过程，属正常的生理性死亡（1分）。
B细胞表现为染色质降解，核DNA形成寡聚小体片段，细胞质浓缩，内质网成泡状，具自溶作用，主动耗能（2分）。
C根毛死亡，管状分子死亡，大孢子退化，叶的衰老等都属于编程性死亡。
它以与有丝分裂相反的方式来调节细胞群的相对平衡，是长期演化的结果（1分）3．外胚乳：A 种子在形成和发育过程中，胚珠的珠心、珠被组织不被完全吸收而消失，有部分残留，构成外胚乳（1.5分）。
B 外胚乳是补充胚乳的一种附属贮藏组织，是演化位置较高的次生性状（1.5分）。
C 外胚乳可以与胚乳并存，如芡的种子等（1分）。
4．双受精：A 被子植物的花粉管进入胚囊后，释放两个精子，一个与卵细胞结合成合子（或受精卵），另一个与极核结合形成受精极核的过程（1.5分）。
B意义：双受精是被子植物特有的生殖现象，它使2个单倍体的雌雄配子融合在一起，恢复了亲本原有的二倍体染色体数目，具有父母双亲的遗传特性，加强了后代个体的生活力和适应性（1.5分）。
第6章 体细胞胚胎发生和人工种子
影响胚状体发生和发育的因素 1
1、供体植物的基因型 2、外植体的来源和培养物的生理状况 双子叶植物的下胚轴和子叶、禾谷类幼 胚的盾片和幼穗都是容易诱导胚状体的外植体
随着胚性愈伤组织继代培养次数的增加， 胚状体发生能力逐渐降低。而有些植物的愈伤 要经长期培养才产生胚状体。
影响胚状体发生和发育的因素 2
第二节 人工种子
人工种子（artificial seeds）：将植物组培产生的 胚状体包裹上用有机化合物和营养物质制作的 人工种皮。 人工种子制作要求：要求能够同步地、大规模地 产生成熟的体细胞胚状体；给胚状体包裹上高 质量的人工种皮；最后解步发育的方法： 1、用 DNA抑制剂处理细胞培养物 5-氨基尿嘧啶；低温处理抑制细胞分裂，再把温度提 高到正常的培养温度，也可达到部分同步化。 2、分离过筛 可获得大小均一的胚性细胞团，再转移到无激素培养基 上培养，可得到大小基本一致的胚状体。 3、利用气体调控胚状体的同步发生 间歇性地向悬浮培养物中通氮气或乙烯可达到胚状体发 生的同步化。 4、利用渗透压调控胚状体的同步生长 胚状体由小到大，其渗透压由高到低。可用高浓度的蔗 糖培养基来控制胚的发育，使其停留于某一阶段，然 后降低蔗糖浓度，使胚状体进入同步发育的状态。
影响胚状体发生和发育的因素 3
☆一般，赤霉素对胚状体的形成没有好处。 ☆脱落酸（ABA）对胚状体的后期发育有促进作用。 ☆腺嘌呤有利于胚状体的诱导。
5、培养基的氮源 还原性氮（铵态氮）高低直接影响胚状体的诱导效果 MS培养基有利于胚状体形成 有机氮源有利于胚状体发生。 脯氨酸对禾谷类胚状体发生有重要作用。 6、天然提取物与活性炭对胚状体形成作用 椰乳对胚胎发生最有效物质；活性炭吸附有毒有害物质。
《植物组织培养》试题及答案
试卷编号NO：高等函授教育《植物组织培养》试题学号：姓名：一名词解释：（10*2分=20分）1、植物细胞组织培养2、细胞全能性3、脱分化4、外植体5、试管苗驯化6、间接不定芽发生7、双极性8、微体嫁接9、人工种子10、体细胞无性系变异二填空：（30*1分=30分）1、目前植物组织培养应用最广泛的方面是和。
2、由脱分化的细胞再分化出完整植株有两种途径，一种叫做，另一种叫做。
3、培养用具的常用灭菌方法有、、。
4、某些生长调节物质及抗生素、酶类物质遇热不稳定，对其灭菌时不能进行，而要进行。
5、一般来说，黑暗条件下有利于的增殖，而往往需要一定的光照。
6、植物离体授粉技术通常包括、、三个方面。
7、一般液体培养的继代时间较短，继代一次；而固体培养继代时间可以长些，继代一次。
8、外植体器官发生的三种途径包括、、。
9、从再生植株倍性来看，小孢子培养通常产生植株，胚培养通常产生植株，通常产生三倍体植株。
10、脱毒苗鉴定与检测的主要方法有、、、。
11、在生长素中，对于许多作物花粉的启动、分裂、形成愈伤组织和胚状体起着决定性作用，但是对却有抑制作用。
12、用平板培养法培养单细胞或原生质体时，常用来衡量细胞培养效果。
13、用药剂处理是诱导染色体加倍的传统方法。
三计算题（1*10分=10分）某培养基的配方是MS＋BA 2.0mg/L＋NAA 0.5mg/L＋2.5%蔗糖＋0.7％琼脂粉。
MS母液的浓度分别是：大量元素２０倍，微量元素500倍，铁盐100倍，有机物５０倍；BA母液浓度1.0 mg/ml ，NAA母液浓度0.1mg/ml。
要配制400ml 该培养基，需要吸取各种母液各多少ml？分别称取蔗糖、琼脂粉各多少克？（要求写出计算步骤）四简答题（5*5分=25分）1、造成组织培养过程中发生污染的原因有哪些？如何有效控制污染？2、简述外植体消毒的一般步骤。
3、胚培养在科学研究及生产实践中有哪些应用？4、结合花粉培养，简述看护培养法。
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并可直接播种于田间。
外形上它就象一颗颗乳白色、半透明、圆 粒状的石榴果实内的小颗粒。
二、人工种子的制备
农业生产中使用的天然种子，一般由种皮、胚乳和胚 三部分构成。
目前，人工种子的制作程序包括：
a、体细胞胚的诱导及同步化控制
important
b、人造胚乳及人造种皮研制及包埋
c、人工种子的贮藏及萌发
制作过程
体细胞胚与藻
酸钠混合后， 滴入到硝酸钙 或CaCl2中，
10分钟后，表 面聚合，形成 人工种子
（2）人造胚乳的研制
• 人造胚乳即包裹胚状体的营养基质，其外部 就是人工种皮。
人工胚乳的成分
• 人工胚乳的主要成分为无机盐、碳水化
合物、蛋白质等营养物质。
人工胚乳的制作
• 直接法
在凝胶中直接加入大量元素、碳水化合物及
3、为一些不能采用种子繁殖的园艺植物开辟了良好 的良种繁育新途径。
（二）、局限性
1、一些具有重要性状的植物目前发生体细胞胚的能 力较弱，再生系统尚不健全，难以形成有活力的胚并 同步化发育。
2、制作的人工种子成本远高于自然种子，无竞争力。 3、人工种子的贮藏、运输以及机械化播种等问题尚 未解决。
人工种子长 出的芹菜味 道非常鲜美
B. 体细胞胚包裹的材料：
• 凝胶
• 可以使人工种皮具有柔软性，不仅适于 胚状体的要求，而且具有抗压性。
C.人造种子的包埋技术
最佳的包埋材料是海藻酸钠，包埋方法有干燥包埋法、 液胶包埋法和水凝胶法。 干燥包埋法：将胚状体置于23度，相对湿度为79％， 黑暗条件下逐渐干燥，然后用聚氧乙烯中包裹贮藏。 液胶包埋法：将胚状体悬浮在一种粘滞的流体胶中， 直接播入土壤。 水凝胶法：用海藻酸钙水性胶囊包埋胚状体，用以生 产人工单胚种子称水凝胶法。
A.材料：胶质的化合物薄膜，以便包裹于人工胚乳之外，
为种子提供保护，并防止融于水的营养物质向外渗透。
人工种皮需要满足的条件：
• 1、具有一定的透气性，不能影响胚状体的呼
吸；
• 2、具有一定的硬度，经得起种子储存和运输
中的挤压和机械播种中的磨损； • 3、易于降解； • 4、含有其他有利于胚状体存活、生长的成分。
• 1.非胚性愈伤组 织的悬浮细胞 • 2.胚性愈伤组织 的悬浮细胞 • 3.球形胚 • 4.心形胚
• 5.鱼雷胚
• 6.子叶胚
• 7.愈伤组织表面 具早期体细胞胚
• 愈伤组织（callus）指从外植体的内
部或切口表面形成的一团没有分化 的均一一致、无序生长的薄壁细胞
团。这种组织具有再分化的能力。
A：化学抑制法－同步脱分化促进细胞的同步分裂 在细胞培养初期加入DNA合成的抑制剂，使细胞DNA合成暂 时停止，除去抑制剂后，细胞同步分裂。
B：低温抑制法 低温处理导致发育停止，形成温度冲击，处理时间过后恢 复正常温度，可使胚性细胞达到同步分裂。
C：渗透压选择 不同发育阶段的胚有不同的渗透压要求，调节渗透压 可以控制胚的发育，筛选到较为一致的体细胞胚。如 球形胚的渗透压17.5％，心形胚的12.5％。
防病用抗生素。
• 微型包裹法 将碳水化合物和大量元素包裹在微型胶囊内， 然后再把微型胶囊和种胚一起包裹在海藻酸钠 中。
2、植物组织培养的应用：
现在已有胡萝卜、芹菜、柑橘、咖啡、棉花、玉米、 水稻、橡胶等几十种植物的人工种子转换
转换是指由体细胞胚发育成具正常表现型的 绿色植株的能力，转换率用来表示不同发育 阶段的体细胞胚发育为小植株的比率。
• 胚状体形成（embryoid formation）是
指从培养的组织或细胞中直接或间接形
成胚胎的生长方式。
• 直接形成胚胎是指在外植体上直接分化
出胚状体；
• 间接形成胚胎是指在外植体上先分化出
胚性愈伤组织，然后由胚性愈伤组织再
分化形成胚状体
第二节 人工种子
一、人工种子的定义
人工种子(artificial seed)：是指通过植物组织培养的方 法产生的体细胞胚包埋在含有营养成分和保护功能的 物质中，在适宜条件下可以发芽成苗的植物幼体。 Murashige1978年首次提出人工种子的概念，利用植物 组织培养中有体细胞胚胎发生的特点，把胚状体等组 织包埋在胶囊内形成球状结构，使其具有种子的机能
• 细胞特点：细胞大而不规则、高度液泡化、无次
生细胞壁和胞间连丝，整个组织结构比较松散；
表面以下5～10个细胞是细胞生长的中心，分生中
心的细胞明显小些，出现了胞间连丝和果胶质， 这些中心是愈伤组织的主要生长部位。随着愈伤 组织表层细胞分裂的减缓和停止，内部深处的生 长中心细胞不断分裂并形成像维管束或类似分生
花粉、原生质体等发生：
• 1、来源于外植体的表皮细胞；
• 2、来源于愈伤组织细胞； • 3、悬浮培养中由单细胞来源的胚状体 • 4、由花药花粉培养产生的单倍体胚状体； • 5、来源于原生质体的胚状体。
2、体细胞胚胎发生的同步化控制
为得到活力强、萌发率高的人工种子，制作要求胚状体的 形态上大小一致、发育进程相似。因此，对体细胞胚发生 要进行同步化控制和纯化筛选。控制胚状体的同步发育是 人工种子的重要条件。
D：机械分离过筛选择法 胚性细胞及悬浮液分别用80、53、40、27微米的滤网 过滤，可以按体积大小分开。 E：在悬浮培养中控制通气 在培养基中通入乙烯或氮气，使细胞分裂达到高峰。
3、人工种皮及人工胚乳研制及包埋
（1）人工种皮的研制 总的要求是：能保持胚状体的活力，利于萌发和贮藏。 所选材料要有韧性、耐压，对胚状体无毒害，含有胚状 体发芽生长所需的营养成分或植物激素，还应含有杀菌 剂以防止播种后土壤微生物的侵染。如海藻酸钠、明胶、 琼脂糖、淀粉、动物胶等。
二、人工种子的优越性与局限性
（一）、优越性 1、通过植物组织培养技术生产的胚状体具有数量多， 繁殖速度快，结构完整等特点，可短期内大量生产优 良种苗，比茎尖培养繁殖速率还高。
2、大量人工种子来源于同一植株的体细胞，不存在 遗传变异的问题,渴望获得整齐一致的植物苗，利于 农业生产的规范化、标准化和机械化管理。
组织的鸟巢状结构。
二、愈伤组织器官的发生
• 不定芽方式
• 胚状体形成的方式
• 不定芽方式（adventitious bud type）
是指愈伤组织培养物，通过形成不定 芽再生成植株。这是愈伤组织中常见
的器官发生方式。
• 愈伤组织通过不定芽方式再分化形成再生植株的方式 主要有四种：
• 1、在愈伤组织上分别形成根或芽器官，即形成无根 的芽或无芽的根； • 2、在愈伤组织上先产生芽，待芽伸长后再在其茎的 基部长出根而形成小植株，多数植物属于此种方式； • 3、在愈伤组织上先产生根，再从根基部分化出芽而 形成小植株，双子叶植物多属此种情况； • 4、先在愈伤组织的不同部位分别形成根和芽，然后 两者结合起来形成一株小植株，只有根和芽的维管束 是相通的才能得到成活的植株。
1、高质量体细胞胚发生系统的建立
大量形成高质量的体细胞胚是人工种子制作的前提 ╱二倍性
胚状体
╲单倍性 高质量的体细胞胚：体细胞胚具有发育成完整小植株 的能力，即要求体细胞胚在解剖结构上具有明显的胚
根、胚芽的双极性结构。人工种子能否成功的关键。
体细胞胚的发生方式：
• 胚状体可由表皮细胞、愈伤组织、悬浮细胞、
一、愈伤组织的诱导
• 起动期
• 分裂期 • 形成期
• 起动期:植物准备分裂的时期；
特征：细胞大小无明显变化；RNA含量迅 速明显增加；细胞核变大。
• 分裂期：细胞通过一分为二的方式不断
增生子细胞的过程。 • 特征：细胞分裂快、结构疏松、缺少组 织结构
• 形成期：外植体细胞经过诱导、分裂形成了无序 的愈伤组织的时期。
第七章 体细胞胚胎发生 和人工种子
教学目的和要求
• 掌握愈伤组织的发生方式；
• 掌握人工种子的定义； • 掌握人工种子的制备。
第一节 愈伤组织和体细 胞胚胎发生
• 体细胞 胚 胎发生(Somatic embryogenesis) 是 指单倍或双倍的体细胞或单个花粉在特定的条 件下，未经性细胞融合而通过与合子胚胎发生 类似的途径，即通过原胚期、球形胚期、心形 胚期、鱼雷形胚期和子叶期，发育成新个体的 形态发生过程，这种类合子胚结构称胚状体或 体细胞胚(Somatic embryo).
黄连
苜蓿
• 马铃薯的人工种子
思考题
• 如何实现体细胞胚的同步发育？
• 什么是人工种子？它是如何构建的？