第十二章 植物体细胞胚胎发生

体细胞胚，通常称花粉胚（pollen embryos），可发育成单倍 体植株。
单细胞悬浮培养 原生质体培养 组织器官培养
体 细 胞 胚
花粉培养 合子胚 无融合生殖胚
花 粉 胚
非 合 子 胚
非 合 子 细 胞
二 体细胞胚发生意义
**体细胞胚或花粉胚都是指在植物组织培养中起源于一个非合子细胞，
经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的胚状结构，包括以下几点含义：
A,C,E为离体培养6周后的体细胞 胚；B,D,F为离体培养5个月后形 成的体细胞胚 A:品种GK7 ，在添加83.0 mM centrophenoxine培养基上; B: 品种AT120，在添加124.4 mM centrophenoxine培养基上; C: 品种59-4144，在添加12.4 mM dicamba培养基上; D:品种 AT120，在添加83.0 mM dicamba 培养基上; E: 品种VC1，在添加83.0 mM picloram培养基上; and F:品种VC1，在添加124.4 mM picloram培养基上. 图 含不同种类和不同浓度生长 素固体培养基上成熟花生胚轴体 细胞胚诱导
第十二章 植物体细胞胚 胎发生
第一节 体细胞胚胎发生的方式 第二节 影响体细胞胚胎发生的因素 第三节 体细胞胚胎发生中基因表达与调控
第一节 体细胞胚胎发生的方式
植物体细胞胚（plant somatic embryos ）：在离体培 养过程中由植物外植体 或愈伤组织产生与受精 卵发育方式类似的胚胎 结构现象。
二、 外植体与体细胞胚发生的影响
不同基因型、外植体体细胞胚发生能力不同。如 胡萝卜子叶不同部位培养诱导的发育过程不同。只有 表皮下细胞具有真正细胞全能性和有能力直接产生体 细胞胚（胚胎发生区），而不用通过愈伤组织阶段的 诱导。
表皮下细胞
根发生区细胞 芽发生区细胞
胡萝卜子叶不同部位外植体示意图
三 光与体细胞胚发生
（1）、内源激素与体细胞胚发生
早在胡萝卜细胞悬浮培养体细胞胚发生中发现， 2，4-D在诱导胚性细胞早期是必需的，而且2，4D是通过影响IAA结合蛋白起作用，其实质是促进 IAA结合蛋白的形成，提高细胞对IAA的敏感性从 而诱导胚性细胞的形成。
（2）外源激素与体细胞胚发生
① 2，4-D与体细胞胚发生 2，4-D是诱导多种植物离体培养体细胞转变为胚性细胞的 重要激素。 单子叶植物和双子叶植物诱导体细胞胚胎发生时，所要求 的2,4-D的浓度不同，对单子叶植物而言，一般要求较高 浓度的2,4-D，其浓度范围为0.5-5mg/L，通常使用浓度为 2mg/L； 而对双子叶植物而言，一般要求较低浓度的2,4-D，其浓 度范围为0.02-1mg/L，通常使用的浓度为0.1mg/L。
（三）、体细胞胚发生过程中，存在着活跃的蛋白 质合成，而且这些蛋白质合成为体细胞胚发生和发 育奠定了分子基础
**有关体细胞胚发生中可溶性蛋白质含量的变化已有 大量研究报道，尽管有些结果不仅相同，但变化的趋 势是相近的。在可溶性蛋白质含量上，各类材料中胚
性愈伤组织的蛋白质含量和合成速率远高于非胚性愈 伤组织，表明前者代谢高于后者。
提供能量，或者与物质和信息的传递密切相关。
（二）、过氧化物酶和其它酶类 **体细胞胚发生和发育是大量酶特异性合成及参与代谢 的结果。 **体细胞胚发生和发育过程中具有较高的过氧化物酶活
性和较多的同工酶种类。
举例： **如过氧化物酶在小麦体细胞胚发生中起着重要的作用，特别 是C2、C6、C9三种三种同工酶带是胚胎发生的特异性酶带，被称 为小麦体细胞胚发生的标志酶。 **在大麦的形态发生中分析几种酶的同工酶，结果发现过氧化 物酶、酯酶和酸性磷酸酶同工酶的结合应用，可以作为体细胞 胚发生的标志酶。 **近年来在枸杞的体细胞胚发生中，还发现超氧化物歧化酶 （SOD）、过氧化物酶（POD或POX）和过氧化氢酶（CAT）等几 种抗氧化酶的活性在胚胎发生与发育过程中有特异性变化，表 明体细胞胚发生也与超氧化物自由基的清除有关。
(图 光对大豆不同品种子叶体 细胞胚发生的影响 )
第三节 体细胞胚发生的生化基础及影响 体细胞胚胎发生的因素
一、体细胞胚发生的生化基础
近年来，随着植物组织培养技术的提高，在植物体细胞胚 发生的全能性表达过程中，人们早已 不局限于形态学和细
胞胚胎学的直观描述，而是在这些观察的基础上，紧密结 合细胞胚胎学过程研究生理生化机制，以探讨体细胞胚发 生的分子基础，其中体细胞胚形成过程中蛋白质和酶的动 态变化，为最终揭示体细胞胚发生机制奠定基础。
② 其它生长激素与体细胞胚发生 除2,4-D外，ABA对植物体细胞胚的发生也起到重要的调控 作用。 研究表明，ABA具有促进苈蒿体细胞胚结构正常化的显著 效应。 在浓度适宜时，ABA能抑制多种异常体细胞胚的发生，而 且ABA加入培养基的时间愈早其效应也越明显。 较低浓度的ABA对保持籼稻愈伤组织的胚性结构具有重要 意义，可明显提高这种胚性愈伤组织分化出苗率。 在拐芹中ABA与NAA共同作用可诱导一些游离氨基酸含量的 变化和特异蛋白的形成。 ABA和PEG对胡萝卜(Daucus carota L.)体细胞胚发生具有 调控作用
2、生长素对基因表达的调控 **60年代初Key等人提出 “基因表达活化”假说，认为生长素 调解生长过程所必需的蛋白质合成的mRNA形成。 **最近有研究表明，植物生长素能诱导mRNA的合成，而且能调
控细胞内mRNA的含量水平。
**在苜蓿的体细胞胚发生的研究中,证明2,4-D可以诱导编码富 含脯氨酸的小分子蛋白质基因（ MsPRP5 ）的 表达，在脱分化 的 愈 伤 组 织 中 MsPRP5 mRNA 的 积 累 与 2,4-D 的 浓 度 有 关 ， 100μmol/L的2,4-D处理愈伤组织20min，mRNA的量开始增加， 处理24-48h mRNA的量达到高峰（Gyorgyeywenku.baidu.com，1997）。
于非胚性愈伤组织，而且mRNA种类丰富 mRNA种类丰富 mRNA种类丰富、不同发育时期mRNA种类
不同，因而转译形成多种蛋白质。此外，这些mRNA的cDNA文库是 研究胚胎发生与发育分子机制有效的分子探针。
**Sengupta等早在20世纪80年代初就发现，胡萝卜体细胞胚发生 中，RNA合成始于胚性细胞培养的2-4小时 RNA合成始于胚性细胞培养的 RNA合成始于胚性细胞培养的2 小时，两天后细胞分裂较快，
总RNA和蛋白质含量增加 ，而且在 胚性细胞中主要合成poly(A)+ mRNA，并认为它的出现是体细胞胚分化的重要遗传信息。
（六）、DNA代谢动态
DNA代谢动态与体细胞胚的形态学极性密切有关，
它的合成为细胞分裂奠定了物质基础，为细胞分化提 供了条件。
二、体细胞胚发生中基因表达的调控 **植物体细胞胚胎发生是一种特定细胞分化的结果，而特定细
（3） 多胺（腐胺、尸胺、亚精胺、高亚精胺、精胺等）和 乙烯与体细胞胚发生 **外源多胺对体胚发生的作用除了取决于植物种类及其内 源多胺的状况之外，还关系到它们如何被吸收、运输及降解 等问题。多胺与体细胞胚发生的关系在胡萝卜的研究中较多。
②
金属离子
**金属离子对体细胞胚的发生也有影响。 **在小麦愈伤组织诱导体细胞胚发生中也发现Zn2+、Cu2+、 Co2+、Mn2+等金属离子具有重要的促进作用，不仅可提高诱 导频率，而且还可以加速胚性愈伤组织的形成，因此，在 培养基中加入适合浓度金属离子可提高体细胞胚发生的频 率。 **有研究表明，金属离子可能是通过促进多胺合成而提高 体细胞胚发生频率。
1、体细胞胚是组织培养的产物，区别于无融合生殖的胚，只限于在组 织培养范围使用； 2、体细胞胚起源于非合子细胞，区别于合子胚； 3、体细胞胚形成经历胚胎发育过程，区别于组织培养的器官发生中芽 与根的分化。
植物体细胞胚胎发生和诱导器官发生相比 具有明显的特点： 1具有两极性 2存在生理隔离 3遗传性相对稳定 4重演受精卵形态发生的特性
2、植物激素与体细胞胚发生
**离体植物细胞在开始往往缺乏合成生长素和细胞分裂 素的能力，但是在大多数情况下，这些细胞的分裂和分 化以及形态建成过程中又必需生长素和细胞分裂素两种 激素的共同作用。 **在培养介质中添加不同种类或不同浓度的外源激素诱 导形态发生已受到广泛的重视。 **但最关键的是组织内部和体细胞胚发生部位的内源激 素代谢动态和平衡。
(三)、蛋白质磷酸化与基因表达 **蛋白质的磷酸化和去磷酸化在蛋白质因子的激活、基因转录 的调解中起重要作用。 **在植物的发育和代谢调控中，蛋白质的磷酸化起重要的作用， 蛋白质的磷酸化可通过蛋白质构象的变化来激活或改变蛋白质 的功能. Olah等（1989）发现苜蓿的培养物中有一种50kDa蛋白， 这种蛋白可被Ca2+和自身的磷酸化作用激活，这种蛋白是一种 Ca2＋依赖性的蛋白质激酶，但它的功能还不清楚。
胞分化则是基因选择表达或受控表达的结果。因此，基因表达
的调控是细胞正常生长、发育和分化的基础，也与生物体对环 境的适应有密切的关系。 **真核基因表达调控包括：1、转录前的调控，如基因扩增、 基因重排及DNA甲基化等；2、转录调控；3、转录后调控，如 RNA剪切、mRNA从细胞核向细胞质的选择运输、RNA编辑等；4、 翻译调控；5、翻译后调控，如蛋白质修饰等。
（一）、体细胞胚发生中基因表达的激素调控
**植物体细胞胚发生与激素关系密切，有些激素（2,4-D）对禾谷类 植物的体细胞胚发生具有决定性作用。 1、细胞分裂素对基因表达的调控 **有研究表明，细胞分裂素能直接调控细胞核基因的活性，此外，
还调控蛋白质的磷酸化以及调控蛋白质的翻译，进而调控体细胞胚 的形成。
一、体细胞胚胎发生（Somatic embryogenesis）的特点 **植物的胚胎发生是从合子开始的。 **单细胞悬浮培养、原生质体培养和花粉培养中都观察到体 细胞胚胎发生或花粉胚胎发生（pollen embryogenesis） **合子发育的胚胎为二倍体的体细胞产生的胚状结构 **体细胞胚胎是由小孢子或其分裂产物等单倍体细胞产生的
品种Jack Jack（光照强度 Jack 50-60 µE m2 s-1）
品种 Fayette Fayette（光照强度50-60 µE m2 s-1）
品种Jack Jack（光照强度5-10 Jack µE m2 s-1）
品种Fayette Fayette（光照强度 Fayette 5-10 µE m2 s-1）
（四）、体细胞胚发生中特异的胚性蛋白质的形成
**体细胞胚发生中不仅有蛋白质含量的变化，而且有特异
的胚性蛋白质的形成，推测这些胚性蛋白既可作为调控因 子，又可作为结构蛋白、贮藏蛋白和酶蛋白起作用。
（五）、RNA代谢动态
**RNA的合成是胚性细胞发生的分子基础，也是体细胞胚正常发育 的重要条件。在体细胞胚发生和发育过程中不仅RNA合成速率远高
第二节 影响体细胞胚胎发生的因素
1、基因型与体细胞胚发生 基因型是影响体细胞胚发生的重要因素，体细胞胚的诱 导率和每个胚性外植体上体细胞胚的发生率因基因型而异
（a）不同基因型体细胞胚诱导率； （b）不同基因型每个胚性外植体上体细胞胚的数目 图6.7 在相同培养基上Feijoa sellowiana Berg不同基因型体细胞胚诱导 （引自Miguel等，2001）
（一）、ATP酶活性的提高
**在枸杞的胚性细胞早期，ATP酶反应产物主要沉积于质 膜和液泡膜上，尤其是在质膜上的ATP酶活性高，且呈连 续分布。在胚性细胞后期，ATP酶活性从细胞质逐渐转入 细胞内，在细胞质、液泡和细胞核中均有ATP酶活性反应。 **进一步表明ATP酶活性是在胚性细胞发生过程中形成的。 **这种ATP酶活性的存在又可能为胚性细胞的分裂和发育
(A) 伸长期合子；(B) 合子经过第一次分裂, 产生1 个顶细胞(绿色)和一个 基细胞(粉红色)；(C) 四分体胚: 顶细胞经历2 次纵向分裂，产生含有4 个 细胞的胚体和2 个细胞的胚柄；(D) 16 细胞球形胚: 8 细胞胚的所有细胞经 过1 次平周分裂, 产生包含8 个细胞的表皮原和8 个细胞的内部组织；(E) 早期心形胚；(F) 心形胚: 子叶和胚根原基已经出现；(G) 成熟胚胎。 1: 顶细胞; 2 : 基细胞; 3: 胚根原细胞, 形成未来的ROC 和根冠中央区; RM: 根尖生长点; SM: 茎尖生长点 图6.2 双子叶植物拟南芥的胚胎发育过程