--第5章体细胞胚胎发生
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❖ 虽然对于胚胎发生来说，其他形式的还原态 氮都不如NH4＋有效，但水解酪蛋白、谷氨酰 胺和丙氨酸等也可用做可靠的代替品。
3.3 其他因子
❖ 钾的浓度：在野生胡萝卜中，高浓度的钾 （20 mmol／L）是胚胎发生所必需的。
❖ 溶解氧的含量：培养基中溶解氧的含量应低 于一个临界值（1.5 mg／L）。
❖ 第二步，将EC转移到极低水平生长素 (0.01～0.1 mg／L)或完全无生长素的培养基 （胚发育培养基）上，EC发育为成熟胚胎。
❖ 其它激素的作用：
❖ 细胞分裂素：BAP可促进胡萝卜愈伤组织的 细胞分裂，但抑制它的成胚潜力；ZT促进； 咖啡叶片愈伤组织要求激动素与生长素比例 高。
❖ 赤霉素：能抑制体细胞胚胎发生
（Dodds和Roberts， 1995）
❖ Kohlenbach关于胚的分类:
❖ (1)合子胚：由受精卵或合子形成的胚。 ❖ (2)非合子胚：由合子之外的细胞形成的胚。 ❖ 体细胞胚—由孢子体细胞（除合子外）离体
培养形成的胚。
❖ 非体细胞胚—即指芽、短枝、愈伤组织、花 粉胚、块茎、球茎等繁殖体。
❖ 例子2：咖啡体细胞胚的发育（p66）
❖ 例子3：对甜橙驯化愈伤组织的详细研究， 也证实了生长素对胚胎发生的重要作用 （p66～67） 。
❖ 最终结论：对于离体条件下体细胞胚胎发 生来说，一个最低限度的内源或外源生长 素是必不可少的。
❖ 成功诱导体细胞胚胎发生的步骤：
❖ 第一步，在生长素浓度高(2,4-D 0.5～1 mg ／L)的培养基（增殖培养基）上诱导和增殖 愈伤组织，高浓度生长素诱导愈伤组织局部 细胞形成的分生组织细胞，称为胚性细胞团 (EC)。
❖ 体细胞胚发生的实质是细胞分化，即细胞在 离体培养条件下，诱导部分基因开放，实现 遗传信息的表达。
3. 影响体细胞胚胎发生的因子
❖ 对于体细胞胚胎发生特别重要的是培养基中 的两种成分，即生长素和氮源。
3.1生长素
❖ 例子1：胡萝卜体细胞胚的发育（p65～66）
❖ 结论：在增殖培养基中生长素的存在，对于 胚性细胞团后来在成胚培养基上发育为胚是 必不可少的。因此，可把增殖培养基看成是 体细胞胚胎发生的“诱导培养基”。
❖ 间接途径：指外植体先脱分化形成愈伤组织， 再从愈伤组织的某些细胞，即重新“决定” 为胚性细胞的细胞分化出体细胞胚胎 (图4－ 3 C)。
图4－3 植物体细胞胚胎发生方式示意图 A．由外植体外层细胞直接产生体细胞胚；B．由外植体组 织内的细胞产生体细胞胚；C．愈伤组织表层细胞分化为 体细胞胚(引自王亚馥等，2000)
❖ ②成簇成团存在的体积小而细胞质致密的细 胞，具成胚潜力。
5.体细胞胚成熟和植株发育
❖ 用脱落酸处理，体细胞胚可以发育成熟。
❖ 高水平生长素能抑制茎尖分生组织发育，当 胚性细胞悬浮液转入缺乏生长素的培养基时， 胚胎常能发育成熟。
❖ 与ABA结合，加入低水平的细胞分裂素（玉 米素0.1µmol／L）可能有利于低密度细胞培 养的胚胎发生。
❖ 活性炭：培养基中加入活性炭也能提高胡萝 卜细胞胚胎发生的频率 。
❖ 某些挥发性和非挥发性物质：抑制愈伤组织 中的体细胞胚胎发生。
Hale Waihona Puke Baidu
4. 体细胞胚胎发生的解剖学和细胞学
❖ 在胡萝卜悬浮培养中，对愈伤组织形成和生 长的解剖学和组织学的研究表明，在培养中 存在着两种类型的细胞：
❖ ①自由分散在培养基中的大而高度液泡化的 细胞，一般不具胚胎发生潜力。
❖ 孤雌生殖胚—由未受精卵形成的胚。 ❖ 孤雄生殖胚—由雄配子体（小孢子花粉粒）
形成的胚。
2. 体细胞胚胎发生的途径
❖ 直接途径：指从培养中的器官、组织、细胞 或原生质体某些部位的胚性细胞直接诱导分 化出体细胞胚胎，中间不经过愈伤组织阶段 (图4－3 A，图4－3 B)。 这种“胚性细胞” 是在胚胎发生之前就已“决定”了的。
❖ 多数体细胞胚胎的形成是通过间接途径产生 的。它通常分两个阶段完成：
❖ ①胚胎发生丛（embryogenic clump，EC） 的形成。
❖ ②胚状体的发育。EC在转入降低或去除生长 素、降低还原氮的培养基后，才能完成胚状 体发育。
关于体细胞胚胎的起源：
❖ 体细胞胚胎究竟起源于单细胞还是多细胞， 目前仍然有争论。但研究结果发现，绝大多 数体细胞胚起源于单细胞（例子？）。但也 有人认为它们起源于一个以上的细胞（证 据？）
第5章 体细胞胚胎发生
❖ 1. 体细胞胚胎发生的概念
❖ 1.1 胚状体（embryoid，非合子胚）
❖ 在离体培养条件下，植物离体培养的细胞、 组织、器官也可以产生类似胚的结构，其形 成也经历一个类似胚胎的发生和发育过程， 这种类似胚的结构称为胚状体（图4－1）。
图4－1 胚状体
1.2 体细胞胚胎发生 （somatic embryogenesis）
❖ 欲使胡萝卜培养细胞形成体细胞胚，必须有 一个最低数量的内源NH4＋存在(每千克鲜重 的组织约5 mmol)。如果内源NH4＋达不到这 个临界值，细胞就不能进行胚胎分化。而要 使细胞内NH4＋达到这个水平，不但需要有很 少量的外源NH4＋存在(2.5 mmol／L)，还需 要供应相对浓度很高的NO3－(60 mmol／L)。
❖ 体细胞胚胎发生可能重复发生，从成熟体细 胞胚上又形成一些胚胎发生的新中心。
❖ 体细胞胚的萌发阶段受到体细胞胚高度不同 步发育的不利影响。
❖ 由单细胞（体细胞）或一群细胞被诱导不断 再生非合子胚，并萌发形成完整植株的发育 过程称为体细胞胚胎发生。
❖ 发生过程见图4－2（p61)。
图4－2 体细胞胚胎发 生的各个时期
单个细胞经过反复的细 胞分裂形成一个小细胞 团，它经历球形期、心 形期和鱼雷形期的发育 过程之后，最终由体细 胞胚长成一个小植株。
3.2 氮源
❖ 除生长素外，培养基中氮源的形态也会显著 影响离体条件下的胚胎发生。体细胞胚诱导 和成熟需要大量氮素，通常为还原态氮如铵 盐。
❖ 例子 1：野生胡萝卜体细胞胚诱导 ❖ 例子 2：栽培胡萝卜体细胞胚诱导 ❖ 培养基中还原态氮和硝酸盐(NH4Cl＋NO3－)
组合似乎更有利于许多培养体系的体细胞胚 胎诱导。
3.3 其他因子
❖ 钾的浓度：在野生胡萝卜中，高浓度的钾 （20 mmol／L）是胚胎发生所必需的。
❖ 溶解氧的含量：培养基中溶解氧的含量应低 于一个临界值（1.5 mg／L）。
❖ 第二步，将EC转移到极低水平生长素 (0.01～0.1 mg／L)或完全无生长素的培养基 （胚发育培养基）上，EC发育为成熟胚胎。
❖ 其它激素的作用：
❖ 细胞分裂素：BAP可促进胡萝卜愈伤组织的 细胞分裂，但抑制它的成胚潜力；ZT促进； 咖啡叶片愈伤组织要求激动素与生长素比例 高。
❖ 赤霉素：能抑制体细胞胚胎发生
（Dodds和Roberts， 1995）
❖ Kohlenbach关于胚的分类:
❖ (1)合子胚：由受精卵或合子形成的胚。 ❖ (2)非合子胚：由合子之外的细胞形成的胚。 ❖ 体细胞胚—由孢子体细胞（除合子外）离体
培养形成的胚。
❖ 非体细胞胚—即指芽、短枝、愈伤组织、花 粉胚、块茎、球茎等繁殖体。
❖ 例子2：咖啡体细胞胚的发育（p66）
❖ 例子3：对甜橙驯化愈伤组织的详细研究， 也证实了生长素对胚胎发生的重要作用 （p66～67） 。
❖ 最终结论：对于离体条件下体细胞胚胎发 生来说，一个最低限度的内源或外源生长 素是必不可少的。
❖ 成功诱导体细胞胚胎发生的步骤：
❖ 第一步，在生长素浓度高(2,4-D 0.5～1 mg ／L)的培养基（增殖培养基）上诱导和增殖 愈伤组织，高浓度生长素诱导愈伤组织局部 细胞形成的分生组织细胞，称为胚性细胞团 (EC)。
❖ 体细胞胚发生的实质是细胞分化，即细胞在 离体培养条件下，诱导部分基因开放，实现 遗传信息的表达。
3. 影响体细胞胚胎发生的因子
❖ 对于体细胞胚胎发生特别重要的是培养基中 的两种成分，即生长素和氮源。
3.1生长素
❖ 例子1：胡萝卜体细胞胚的发育（p65～66）
❖ 结论：在增殖培养基中生长素的存在，对于 胚性细胞团后来在成胚培养基上发育为胚是 必不可少的。因此，可把增殖培养基看成是 体细胞胚胎发生的“诱导培养基”。
❖ 间接途径：指外植体先脱分化形成愈伤组织， 再从愈伤组织的某些细胞，即重新“决定” 为胚性细胞的细胞分化出体细胞胚胎 (图4－ 3 C)。
图4－3 植物体细胞胚胎发生方式示意图 A．由外植体外层细胞直接产生体细胞胚；B．由外植体组 织内的细胞产生体细胞胚；C．愈伤组织表层细胞分化为 体细胞胚(引自王亚馥等，2000)
❖ ②成簇成团存在的体积小而细胞质致密的细 胞，具成胚潜力。
5.体细胞胚成熟和植株发育
❖ 用脱落酸处理，体细胞胚可以发育成熟。
❖ 高水平生长素能抑制茎尖分生组织发育，当 胚性细胞悬浮液转入缺乏生长素的培养基时， 胚胎常能发育成熟。
❖ 与ABA结合，加入低水平的细胞分裂素（玉 米素0.1µmol／L）可能有利于低密度细胞培 养的胚胎发生。
❖ 活性炭：培养基中加入活性炭也能提高胡萝 卜细胞胚胎发生的频率 。
❖ 某些挥发性和非挥发性物质：抑制愈伤组织 中的体细胞胚胎发生。
Hale Waihona Puke Baidu
4. 体细胞胚胎发生的解剖学和细胞学
❖ 在胡萝卜悬浮培养中，对愈伤组织形成和生 长的解剖学和组织学的研究表明，在培养中 存在着两种类型的细胞：
❖ ①自由分散在培养基中的大而高度液泡化的 细胞，一般不具胚胎发生潜力。
❖ 孤雌生殖胚—由未受精卵形成的胚。 ❖ 孤雄生殖胚—由雄配子体（小孢子花粉粒）
形成的胚。
2. 体细胞胚胎发生的途径
❖ 直接途径：指从培养中的器官、组织、细胞 或原生质体某些部位的胚性细胞直接诱导分 化出体细胞胚胎，中间不经过愈伤组织阶段 (图4－3 A，图4－3 B)。 这种“胚性细胞” 是在胚胎发生之前就已“决定”了的。
❖ 多数体细胞胚胎的形成是通过间接途径产生 的。它通常分两个阶段完成：
❖ ①胚胎发生丛（embryogenic clump，EC） 的形成。
❖ ②胚状体的发育。EC在转入降低或去除生长 素、降低还原氮的培养基后，才能完成胚状 体发育。
关于体细胞胚胎的起源：
❖ 体细胞胚胎究竟起源于单细胞还是多细胞， 目前仍然有争论。但研究结果发现，绝大多 数体细胞胚起源于单细胞（例子？）。但也 有人认为它们起源于一个以上的细胞（证 据？）
第5章 体细胞胚胎发生
❖ 1. 体细胞胚胎发生的概念
❖ 1.1 胚状体（embryoid，非合子胚）
❖ 在离体培养条件下，植物离体培养的细胞、 组织、器官也可以产生类似胚的结构，其形 成也经历一个类似胚胎的发生和发育过程， 这种类似胚的结构称为胚状体（图4－1）。
图4－1 胚状体
1.2 体细胞胚胎发生 （somatic embryogenesis）
❖ 欲使胡萝卜培养细胞形成体细胞胚，必须有 一个最低数量的内源NH4＋存在(每千克鲜重 的组织约5 mmol)。如果内源NH4＋达不到这 个临界值，细胞就不能进行胚胎分化。而要 使细胞内NH4＋达到这个水平，不但需要有很 少量的外源NH4＋存在(2.5 mmol／L)，还需 要供应相对浓度很高的NO3－(60 mmol／L)。
❖ 体细胞胚胎发生可能重复发生，从成熟体细 胞胚上又形成一些胚胎发生的新中心。
❖ 体细胞胚的萌发阶段受到体细胞胚高度不同 步发育的不利影响。
❖ 由单细胞（体细胞）或一群细胞被诱导不断 再生非合子胚，并萌发形成完整植株的发育 过程称为体细胞胚胎发生。
❖ 发生过程见图4－2（p61)。
图4－2 体细胞胚胎发 生的各个时期
单个细胞经过反复的细 胞分裂形成一个小细胞 团，它经历球形期、心 形期和鱼雷形期的发育 过程之后，最终由体细 胞胚长成一个小植株。
3.2 氮源
❖ 除生长素外，培养基中氮源的形态也会显著 影响离体条件下的胚胎发生。体细胞胚诱导 和成熟需要大量氮素，通常为还原态氮如铵 盐。
❖ 例子 1：野生胡萝卜体细胞胚诱导 ❖ 例子 2：栽培胡萝卜体细胞胚诱导 ❖ 培养基中还原态氮和硝酸盐(NH4Cl＋NO3－)
组合似乎更有利于许多培养体系的体细胞胚 胎诱导。