体细胞胚胎发生
体细胞胚胎发生及其基因表达的研究进展
２ ４Ｄ 含 量 为 ０ ５ ｇ Ｌ 并 不 含 ６ Ｂ 的 为 最 高 （ ６ ，－ ．ｍ／ －Ａ ９．
７ ） 。在 对 花 生 的体 胚 发生 研 究 中 ， 蓉 等发 现 ２４Ｄ ％ 周 ，－ 对 诱 导 花 生 体 胚 发 生 的作 用 明 显 ， 当 增 加 ２ ４Ｄ浓 度 适 ，－ 有利 于 提 高 体 胚 发 生 频 率 。但 ２ ４Ｄ有 时 也 会 对 体 胚 ，－ 的发 生起 抑 制 作 用 ， 如王 清 连 等 在 对 棉 花 的研 究 中 发 现 ， ２４ Ｄ对 棉 花 的体 细 胞 胚 胎 形 成 有 显 著 的抑 制 作 用 ， 附 ，－ 在 加 有 ２ ４Ｄ 的培 养 基 上 愈伤 组 织 仅 形 成 ２ ，－ ４个 体 细 胞 胚 是 对照 的 ２ ．％ ７３ 。关 于 ２ ４Ｄ 作 用 机 理 ， ａ Ｒ ｇ ａａ ，一 Ｖ ｌ ａｈｖｎ 认 为 其 可 诱 导 细 胞 增 殖 ， 胞 循 环 及 形 态 建 成 。 它 一 细
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辽宁农业科学
２０（ ）２ ０ ７ ５ ：３～２ ６
Ｌｉｏ ｉ ｇ Ａｇ ｉｕｌ ａ ｉ ｎ ｅ ａ ｎ ｎ ｒｃ ｔ ｌＳｃｅ ｃ ｓ ｕｒ
文 章 编 号 ：０ ２—１２ （０ ７ ０ ０ ２ １０ ７ ８ ２ ０ ）５— ０ ３—０ ４
从 ３０多 种 植 物 上 观 察 到 体 细 胞 胚 的 发 生 （ ａ ｊ ０ Ｂｊ ， ａ １９ ） 。植 物 体 细 胞 胚 胎 发 生 技 术 不 仅 成 为 植 物 快 速 ９５ …
繁 殖 的 最 重 要 的 手 段 ，而 且 在 该 过 程 中体 细 胞 还 可 发 生 变 异 产 生 突 变 体 ， 泛 应 用 于 农 作 物 育 种 。体 细 胞 胚 胎 广
植物体细胞胚胎发生研究
植物体细胞胚胎发生研究植物是一类非常特殊的生物, 它们具备能够进行无限生长的能力。
在植物生长和发育中，胚胎发生是一个至关重要的过程。
它能够使单个细胞逐步形成具有各种不同细胞类型的完整的植物。
因此，研究植物体细胞胚胎发生对于探究植物生长的本质和机制，以及植物育种具有非常重要的意义。
植物体细胞胚胎发生的定义植物体细胞胚胎发生可以理解为从单一的细胞发展为幼苗的过程。
在这个过程中，细胞经历了不同的细胞分化和发育，最终形成了植物的各种组织和器官。
植物体细胞胚胎发生的过程植物体细胞胚胎发生可分为两个主要阶段，第一个是发生，即单一的细胞开始分裂，最终形成组织和器官；第二个是发育，即利用分裂细胞发展特定的细胞、组织和器官，并形成成熟的植物。
植物体细胞胚胎发生的机制植物体细胞胚胎发生的机制非常复杂，与基因调控、细胞分化和信号传递等多种因素有关。
具体机制涉及一系列信号通路和表观遗传学调控。
当细胞开始分化时，特定的基因开始表达，并产生一系列的细胞信号分子或调节蛋白，进而控制细胞的命运和形态。
植物体细胞胚胎发生的应用植物体细胞胚胎发生对于探究植物生长的本质和机制，以及植物育种具有非常重要的意义。
例如，在植物育种过程中，研究植物细胞胚胎发生可以加深人们对植物遗传学和表观遗传学的认识，有助于培育更高产、抗病和适应环境的植物品种。
总结植物体细胞胚胎发生是一个复杂而重要的生物学过程，它关系到植物生长发育的本质。
研究其机制，有助于深入探讨植物的基本生物学问题，促进植物产业的发展。
在未来，有望利用最新的基因编辑技术和细胞培养技术，对于植物体细胞胚胎发生进行更深入的研究和应用。
第十二章植物体细胞胚胎发生
2、生长素对基因体现的调控
**60年代初Key等人提出“基因体现活化”假说，认为生长素 调解生长过程所必需的蛋白质合成的mRNA形成。
**近来有研究表明，植物生长素能诱导mRNA的合成，并且能 调控细胞内mRNA的含量水平。
**在苜蓿的体细胞胚发生的研究中,证明2,4-D能够诱导编码富 含脯氨酸的小分子蛋白质基因（MsPRP5）的 体现，在脱分化 的愈伤组织中MsPRP5 mRNA的积累与2,4-D的浓度有关， 100μmol/L的2,4-D解决愈伤组织20min，mRNA的量开始增 加，解决24-48h mRNA的量达成高峰（Gyorgyey等， 1997）。
（四）、体细胞胚发生中DNA的甲基化对基因体现的调控作用
第二节 影响体细胞胚胎发生的因素
1、基因型与体细胞胚发生
基因型是影响体细胞胚发生的重要因素，体细胞胚的诱导 率和每个胚性外植体上体细胞胚的发生率因基因型而异
（a）不同基因型体细胞胚诱导率； （b）不同基因型每个胚性外植体上体细胞胚的数目 图6.7 在相似培养基上Feijoa sellowiana Berg不同基因型体细胞胚诱导
**这种ATP酶活性的存在又可能为胚性细胞的分裂和发育 提供能量，或者与物质和信息的传递亲密有关。
（二）、过氧化物酶和其它酶类
**体细胞胚发生和发育是大量酶特异性合成及参加代谢的 成果。 **体细胞胚发生和发育过程中含有较高的过氧化物酶活性 和较多的同工酶种类。
举例：
**如过氧化物酶在小麦体细胞胚发生中起着重要的作用，特别 是C2、C6、C9三种三种同工酶带是胚胎发生的特异性酶带， 被称为小麦体细胞胚发生的标志酶。
研究表明，ABA含有增进苈蒿体细胞胚构造正常化的明显 效应。
在浓度适宜时，ABA能克制多个异常体细胞胚的发生，并 且ABA加入培养基的时间愈早其效应也越明显。
植物体细胞胚胎发生
植物体细胞胚胎发生正常情况下，植物胚胎发生是指受精后的一系列连续过程，即从合子（受精卵）到成熟胚的发生、发育的有规律变化，这种情况下形成的胚成为合子胚。
在离体培养条件下，植物离体培养的细胞、组织、器官也可以产生类似胚的结构，其形成也经历一个类似胚胎的发生和发育过程，这种类似胚的结构称为胚状体。
成熟的胚状体可以像合子胚一样长出根、芽，萌发再生植株。
植物离体培养细胞产生胚状体的过程称为体细胞胚胎发生，植物体细胞胚胎发生具有普遍性，已从200多种植物上观察到胚状体的发生，包括被子植物几乎所有重要的科和一些裸子植物。
在被子植物上，不仅能够从根、茎、叶、花、果实等器官的组织培养物中诱导产生二倍性胚状体，还能从花粉、助细胞和反足细胞中诱导产生单倍性胚状体，从胚乳细胞中诱导产生三倍性胚状体。
一、植物体细胞胚胎发生过程（一）体细胞胚胎发生过程虽然不同种类的植物体细胞胚胎发生的主要发育阶段的分划是不一致的，但一般可分为胚性愈伤组织诱导、体细胞胚胎诱导、体细胞胚胎早期分化发育、体细胞胚胎成熟、体细胞胚胎萌发和成苗五个阶段。
在双子叶植物上，体细胞胚胎发生经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷形胚和成熟胚阶段；在乔本科植物的成熟体细胞胚上，可以清楚的看到胚特有的结构，即盾片、胚芽鞘和胚根等。
体细胞胚与愈伤组织的维管系统没有连接，最后会从培养物的表面脱落下来。
（二）胚性和非胚性细胞或愈伤组织生理状态的差异胚性和非胚性细胞或愈伤组织生理状态有明显差异。
胚性细胞是一类独特的细胞，它与分生组织类似，通常较小，近圆形，具有较大的核和核仁并能高度染色，胞质浓厚。
多数典型的胚性愈伤组织的外表呈松脆颗粒状。
胚性与非胚性细胞或愈伤组织相比，DNA、RNA以及蛋白质的合成更为活跃，表现为含量和种类的增加、淀粉和可溶性糖含量增加、内源多胺含量升高、活性氧水平提高、同工酶谱和内源激素合成有明显变化等。
如胡萝卜胚性愈伤组织的淀粉含量高出非胚性愈伤组织的15～40倍，挪威云杉非胚性愈伤组织的乙烯生成速率比胚性愈伤组织高19～117倍，龙眼胚性愈伤组织的内源多胺和激素水平都高于非胚性愈伤组织。
体细胞胚发生
植物物种和品种基因型影响 愈伤组织的分化
• 程林梅等（2001）的研究表明，利用不同 基因型大豆品种的下胚轴作外植体进行组培时， 培养基对愈伤组织的影响不明显；细胞分裂素 （KT）和NAA的配比浓度对其愈伤组织的分 化影响显著；不同基因型大豆植株再生作用差 异明显；外植体取材时间和取材部位对再生植 株的形成也具有较大的影响，再生能力最强的 取材部位时从子叶节到下胚轴6mm区段,当下 胚轴长到2~3cm时取材最佳。
2 氮源 除生长素外，培养基中氮源的形态也会影响离 体条件下的胚胎发生。只有当培养基中含有一定量 的还原态氮时，才能出现胚胎发生过程。 在以KNO3为唯一氮源的培养基上建立起来的 愈伤组织，去掉生长素后不能形成胚。然而，若在 55mmol/LKNO3的培养基中加入少量的 (5mmol/L)NH4Cl形态的氮，胚胎发生过程就会出 现。
不同浓度的激素对烟草愈伤组织的影响
愈伤分化
器官分化的植物激素控制理论
• 大量的实验结果表明：
大多数植物组织或器官的再生作用符合器 官分化的植物激素控制理论。
即：生长素与细胞分裂素的比例小时则产 生苗，比例大时则生根，而两种激素的比例适中 时，则产生无结构的愈伤组织。
器官发生途径
外植体 脱分化 愈伤组织 再分化
• 1.4.1.2位置效应
1.4.2 器官分化信息传递
1.4.2.1 胞外信号分子
• 胞外通讯信号分子又称第一信使(first messenger)。在植物细胞外的通讯信号分子，， • 如植物激素主要通过维管束系统在细胞与器官间 进行调节。它在植株的某些发育阶段，于特， • 部位发生作用。植物激素信号由位于膜或其它部 位的受体所接收，进一步直接或间接地影响： • 因表达。当植物激素以直接的形式影响基因表达 时，就会产生在转录、翻译等水平上的不同， • 应，从而控制酶的合成，影响代谢变化，最终产 生某些生理反应。
第十二章 植物体细胞胚胎发生
(A) 伸长期合子；(B) 合子经过第一次分裂, 产生1 个顶细胞(绿色)和一个 基细胞(粉红色)；(C) 四分体胚: 顶细胞经历2 次纵向分裂，产生含有4 个 细胞的胚体和2 个细胞的胚柄；(D) 16 细胞球形胚: 8 细胞胚的所有细胞经 过1 次平周分裂, 产生包含8 个细胞的表皮原和8 个细胞的内部组织；(E) 早期心形胚；(F) 心形胚: 子叶和胚根原基已经出现；(G) 成熟胚胎。 1: 顶细胞; 2 : 基细胞; 3: 胚根原细胞, 形成未来的ROC 和根冠中央区; RM: 根尖生长点; SM: 茎尖生长点 图6.2 双子叶植物拟南芥的胚胎发育过程
品种Jack Jack（光照强度 Jack 50-60 µE m2 s-1）
品种 Fayette Fayette（光照强度50-60 µE m2 s-1）
品种Jack Jack（光照强度5-10 Jack µE m2 s-1）
品种Fayette Fayette（光照强度 Fayette 5-10 µE m2 s-1）
于非胚性愈伤组织，而且mRNA种类丰富 mRNA种类丰富 mRNA种类丰富、不同发育时期mRNA种类
不同，因而转译形成探针。
**Sengupta等早在20世纪80年代初就发现，胡萝卜体细胞胚发生 中，RNA合成始于胚性细胞培养的2-4小时 RNA合成始于胚性细胞培养的 RNA合成始于胚性细胞培养的2 小时，两天后细胞分裂较快，
总RNA和蛋白质含量增加 ，而且在 胚性细胞中主要合成poly(A)+ mRNA，并认为它的出现是体细胞胚分化的重要遗传信息。
（六）、DNA代谢动态
DNA代谢动态与体细胞胚的形态学极性密切有关，
它的合成为细胞分裂奠定了物质基础，为细胞分化提 供了条件。
动物学名词解释一
注:学完原生动物、多孔动物、腔肠动物、扁形动物、假体腔动物后完成名词解释(任选三个完成)1. 吞噬营养2. 渗透营养3. 伪足4. 包囊5. 伸缩泡6. 胞饮作用7. 细胞内消化8. 裂体生殖9. 孢子生殖10. 刺丝泡11. 生物发生律12. 真体腔13. 端细胞法(裂体腔法)14. 体腔囊法(肠体腔法)15. 中生动物16. 原口动物17. 后口动物18. 芽球19. 水沟系20. 两囊幼虫21. 福射对称22. 出芽生殖23. 消化循环腔24. 浮浪幼虫25. 细胞外消化26. 刺细胞27. 原肾管28. 焰细胞29. 幼体生殖30. 再生31. 两侧对称32. 梯形神经系统33. 皮肤肌肉囊34. 假体腔35. 蜕皮36. 非混交雌体37. 孤雌生殖38.咀嚼器39. 非需精卵1.吞噬营养:吞噬固体的食物颗粒或微小生物2.渗透营养:通过体表渗透吸收周围呈溶解状态的物质3.伪足:变形虫在运动时,由体表任何部位都可形成临时性的细胞质突起,称为伪足。
4.包囊:原生动物在不良环境下,虫体会分泌一种保护性胶质将自己包裹起来,形成包囊。
5.伸缩泡:原生动物细胞内的一个细胞器,用于调节水分平衡,收集细胞质中过多的水分(其中也有代谢废物),排入储蓄泡,再经过胞口排出体外。
6.胞饮作用:在液体环境中的一些分子(一般是大分子化合物)或离子吸附到质膜表面,使膜发生反应,凹陷下去形成管道,然后再管道内断下来形成一些液泡,移到细胞质中,与溶酶体结合形成多泡小体(在一个囊泡膜内可有几个胞饮小泡),经消化后营养物质进入细胞质。
7.细胞内消化:食物通过吞噬作用进入细胞内,与溶酶体结合,溶酶体的水解酶将食物分解,营养物质进入细胞质,废物排出体外。
8.裂体生殖:原生生物孢子纲的无性生殖方式。
细胞核先分裂成多个,称为裂殖体,然后细胞质随核而分裂,包在每个核的外面,形成许多小个体。
9.孢子生殖:疟原虫经有性生殖形成的合子在雌蚊胃壁基膜与上皮细胞之间形成卵囊,卵囊里的核及胞质进行多次分裂,形成数百至上万的子孢子,成熟后,卵囊破裂,子孢子出来到体腔里。
第三章 植物愈伤组织的诱导、继代及分化
⑶先芽后根：愈伤组织中产生多个分生细胞形成分生中心， 从中仅分化出芽，一般情况下待芽长到一定大小时，切下 移入生根培养基中，在其基部即可分化出根。
有些植物在分化芽的培养基上同时在芽器官基部分化出根， 形成完整的植株。大多数植物均属这类正常的分化途径， 这类苗移栽较易成活。
⑷先根后芽：有些植物外植体脱分化后在愈伤组织上先分 化出根，而后在靠近愈伤组织的根部上再分化出芽，有的 将根切下放入分化培养基，再于根上分化出芽器官，甚至 在根端也能分化出芽。
从单个细胞或外植体上脱分化形成典型的愈 伤组织，大致经历三个时期：
起动期：又称为诱导期,
是愈伤组织形成的起点。 外植体已分化的活细胞 在 外源激素的作用下，
通过脱分化起动而进入 分裂状态，并开始形成 愈伤组织。
起动期
分裂期
分裂期：外植体切口边缘开
始膨大，外层细胞通过一分 为二的方式进行分裂，从而 形成一团具有分生组织状态 细胞的过程。
二、从愈伤组织建立悬浮培养体系
多数悬浮培养物（suspension cultures）是将生长快、质地 疏松的愈伤 小块转移到与愈伤诱导含同样成分的液体培养 基里进行振荡培养而获得。
接种时必须有足够多的细胞块，以保证有较合适的细胞密 度。振荡速度一 般为 30-150rpm。
第一次继代时，应去掉开始时接入的大块细胞团——过滤。
第三节 愈伤组织分化与植株再生
体细胞胚胎发生：指从体细胞进行的类胚结构的生产。 体细胞胚是一个二极结构，不物理地附着于原组织，每一 个体细胞胚称为胚状体，它可以同 合子胚一样发育成植株。 器官发生：指从愈伤组织形成芽及根的过程，芽是一个单 极性结构，物理地同母体组织联结着。
细胞分化
无论是在离体还是在活体条件下，植物细胞分化 研究的重点是维管组织的分化，特别是木质部成 分的分化。
器官发生与体细胞胚胎发生
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影响体细胞胚胎发生的因素
——长期培养物形态发生潜力的丧失 诱导胚状体的形成 在自然界只有少数植物可以通过体细胞胚胎发生而产生胚状体，但在培养条件下，现在已知有30多个科、150多种植物可以产生胚状体。诱导胚状体时一般使用胚分生组织或生殖器官的组织作为外植体。在一个含有丰富还原态氮的基本培养基，在存在生长素，特别是2，4-D时诱导胚状体的发生，然后转移到降低浓度呀没有生长素的培养基上使胚状体成熟和生长。
胚状体方式(somatic embryo)
指由培养细胞诱导分化出具胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。 由外植体经胚状体形成完整植株可分三个不同发育阶段： 外植体细胞脱分化。外植体发生细胞分裂，或进而形成愈伤组织。这一阶段同不定芽方式一样。 胚状体形成 在植物有性生殖中，精于和卵子结合形成合子，合子进一步发育成胚。但在组织培养条件下胚状体的发育过程是：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。 胚状体再发育成完整植株 在外观上，这种方式和不定芽均有光滑、圆形突起的形状。
第七章 器官发生与体细胞胚胎发生
植物细胞全能性实现的过程:
发育成完整的植株
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器官发生
概念：离体培养的组织、细胞在诱导条件下经分裂和增殖再分化形成不定根和不定芽等器官的过程。 发生方式： 直接发生：（具有初生分生能力的）外植体直接分化成器官的过程。如落地生根. 间接发生：外植体（已分化的成熟组织）经脱分化形成愈伤组织再分化形成器官的过程。
第六章植物体细胞胚胎发生
第六章植物体细胞胚胎发生第一节体细胞胚胎发生特点及方式一、体细胞胚胎发生特点植物胚胎发生（Somatic embryogenesis）从合子开始。
自20世纪50年代末Steward等发现胡萝卜根细胞离体培养可通过体细胞胚胎发生形成再生植株以来，大量研究表明，大多数植物组织培养、单细胞悬浮培养、原生质体培养和花粉培养中都观察到体细胞胚胎发生或花粉胚胎发生。
其中体细胞胚为二倍体的体细胞产生的胚状结构；而花粉胚（Pollen embryos）是由小孢子或其分裂产物等单倍体细胞产生的体细胞胚，可发育成单倍体植株。
体细胞胚或花粉胚都起源于植物组织培养中一个非合子细胞，是经过胚胎发生和胚胎发育过程而形成的胚状结构。
体细胞胚是离体诱导过程中组织培养的产物，与无融合生殖胚明显不同，只限于组织培养范围使用；体细胞胚起源于非合子细胞，明显区别于合子胚；体细胞胚的形成经过胚胎发育过程，与组织培养器官发生途径中芽与根的分化不同。
植物体细胞胚胎发生和诱导器官发生相比具有明显的特点：①具有两极性：在体细胞胚胎发生早期就具有胚根和胚芽两极性的存在，胚性细胞第一次分裂多为不均等分裂，形成顶细胞和基细胞，继而由较小的顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，而较大的基细胞经过少数几次分裂成为胚柄部分，在形态上具有明显的极性，发育过程与合子胚相似。
体细胞胚一经形成，多数可生长为小植株，成苗率高。
因此，常将发育一定时期的体细胞胚制作成人工种子，以达到快速繁殖优良种质的目的。
不定芽和不定根则为单极性。
②存在生理隔离：体细胞胚形成后与母体植物或外植体的维管束系统较少连接，出现所谓生理隔离（Physiological isolation）现象，与器官发生途径完全不同（不定根或不定芽往往与愈伤组织的维管组织连接）。
③遗传性相对稳定：体细胞胚是由那些未经过畸变的细胞或变异较小的细胞形成，并可以实现全能性表达，通过体细胞胚形成的再生植株变异小于器官发生途径形成的再生植株。
体细胞胚胎发生名词解释
体细胞胚胎发生名词解释在体细胞胚胎发生的过程中，细胞可不都是一成不变的。
它们会根据周围的环境变化而不断调整，像极了我们生活中的百变大咖。
细胞们会不断地分裂、增殖，有点儿像你在聚会上见到老友，越聚越多，气氛越来越好。
每个细胞都有自己的角色，有的负责形成皮肤，有的负责形成心脏，甚至还有的专门来负责造血，真是各司其职，团队合作！你看，就算是细胞之间的默契都能让人忍不住想点赞，感觉比某些团队建设活动还要来得有效。
再来聊聊这个过程中的“细胞命运”吧。
它们从一开始的干细胞，像是一块未雕刻的璞玉，真是潜力无限。
干细胞就像是一张白纸，可以画出各种不同的图案，随着它们的发展，逐渐决定了自己要成为哪种细胞。
简直就像人生的选择，今天当个心脏细胞，明天又可以选择变成神经细胞，真是太有趣了。
它们在成长的过程中，不断接受“教育”，了解自己的任务，慢慢蜕变，形成一个完整的个体。
这就像我们在成长过程中，经历了无数选择，最终找到自己的方向。
这个过程不仅是细胞的转变，也是一个协调配合的完美舞蹈。
想象一下，细胞们就像在一场舞会中，随着音乐的节拍，优雅地转动、交错。
每一次分裂、迁移，都像是在跳动着生命的旋律。
各种信号、激素的参与，仿佛在指挥着这场舞蹈，确保每个细胞都能找到自己的位置，发挥最大的作用。
每一步都得精确无误，就像在表演芭蕾舞，稍微一个失误，可能整个舞蹈都会受到影响。
不仅如此，体细胞胚胎发生还受到了许多外界因素的影响。
这就像是你做饭时，材料的新鲜程度、调料的搭配都会直接影响菜的味道。
环境的变化、营养的供给，甚至是温度和湿度，都会对细胞的发育起到至关重要的作用。
细胞们在压力下会展现出超乎寻常的韧性，像是战斗机在逆境中成长，甚至能适应并茁壮成长。
说到这里，咱们也不得不提一下基因的角色。
基因就像是细胞的“老板”，指挥着它们的工作和发展方向。
每个细胞中都有一套自己的“工作手册”，上面写着它们该做什么、怎么做。
就像我们每个人都有自己的职业规划，细胞们也在根据这些基因信息，按部就班地进行发育。
培育胡萝卜实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解植物组织培养的基本原理和操作技术。
2. 掌握胡萝卜愈伤组织的诱导、继代增殖和细胞悬浮培养的方法。
3. 熟悉胡萝卜体细胞胚胎发生培养过程。
二、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜胡萝卜肉质根、MS培养基、植物激素、无菌水、75%酒精、无菌滤纸等。
2. 实验仪器：超净工作台、高压蒸汽灭菌器、电子天平、显微镜、移液枪、培养皿、培养箱等。
三、实验方法1. 胡萝卜愈伤组织的诱导- 将新鲜胡萝卜肉质根洗净，切成小块，用75%酒精消毒30秒，无菌水冲洗3次。
- 将消毒后的胡萝卜小块接种于诱导培养基（MS培养基+2,4-D 1mg/L+6-BA1mg/L）中，在无菌条件下进行培养。
- 观察胡萝卜小块的愈伤组织形成情况。
2. 胡萝卜愈伤组织的继代增殖- 将诱导出的愈伤组织切割成小块，接种于继代培养基（MS培养基+2,4-D0.5mg/L+6-BA 0.5mg/L）中。
- 在无菌条件下进行培养，观察愈伤组织的增殖情况。
3. 胡萝卜细胞悬浮培养- 将继代增殖后的愈伤组织用无菌水冲洗，剪碎，加入适量MS培养基和植物激素（2,4-D 0.1mg/L+6-BA 0.1mg/L）。
- 在无菌条件下进行搅拌，使愈伤组织细胞悬浮。
- 将悬浮细胞接种于细胞悬浮培养基（MS培养基+2,4-D 0.1mg/L+6-BA0.1mg/L）中，在无菌条件下进行培养。
- 观察细胞悬浮培养的生长情况。
4. 胡萝卜体细胞胚胎发生培养- 将细胞悬浮培养得到的愈伤组织细胞，用无菌水冲洗，剪碎，加入适量MS培养基和植物激素（NAA 0.1mg/L+KT 0.1mg/L）。
- 在无菌条件下进行搅拌，使愈伤组织细胞悬浮。
- 将悬浮细胞接种于体细胞胚胎发生培养基（MS培养基+NAA 0.1mg/L+KT0.1mg/L）中，在无菌条件下进行培养。
- 观察体细胞胚胎发生培养的生长情况。
四、实验结果与分析1. 胡萝卜愈伤组织的诱导- 经过诱导培养，胡萝卜小块表面逐渐出现愈伤组织，愈伤组织呈白色、半透明状，质地较软。
第十五章体细胞胚胎发生和人工种子
5）源于原生质体的胚状体，如玉米、黄瓜。
体细胞胚胎发生的同步控制
在培养中体细胞胚胎的发生一般是不同步的。控制胚状体的同步发育是人工种子的重要条件。
现在常用以下几种方法对体细胞胚的发生进行同步控制。
1）同步脱分化促进细胞的同步分裂 细胞培养初期加入DNA合成抑制剂（如五氨基脲嘧啶），使细胞DNA合成暂时停止。一旦除去DNA抑制剂，细胞开始进入同步分裂。
凝胶囊中直接加入大量元素、碳水化合物及防病用抗生素。
2）微型包裹法
首先将碳水化合物和大量元素包裹在微型胶囊内，然后再把微型胶囊和种胚一起包裹在褐藻酸钙（人工种子）中。目的是使人工胚乳的营养成分在人工种子内缓慢地释放，提高种子的存活时间。
2、人工种子的研究现状
人工种子具备了组培试管苗的全部优点，具有巨大的应用潜力：
1、愈伤组织的诱导
愈伤组织的形成大致要经过起动期、分裂期和形成期三个阶段。
1）起动期 当外植体已分化的活细胞在外源植物生长物质的作用下，通过脱分化起动而进入分裂时期，进而形成愈伤组织。此期的细胞大小无明显变化，胞内RNA含量迅速明显增加，细胞核变大。
2）分裂期 是指细胞通过一分为二的方式不断增生子细胞的过程。外植体的细胞一旦经过诱导，其外层细胞开始细胞分裂，使细胞脱分化。此期细胞分裂快、结构疏松、缺少组织结构。
图15.3 人工种子的结构
1 、人工种子的制备
A、体细胞胚的制备
体细胞胚的发生方式
体细胞胚胎（胚状体）可由表皮细胞、愈伤组织、悬浮细胞、花粉、原生质体等发生：
1） 来源于外植体的表皮细胞，如石龙芮、刺五加、芹菜等；
2） 来源于愈伤组织细胞，如玉米、西洋参桃等；
第6章 体细胞胚胎发生和人工种子
影响胚状体发生和发育的因素 1
1、供体植物的基因型 2、外植体的来源和培养物的生理状况 双子叶植物的下胚轴和子叶、禾谷类幼 胚的盾片和幼穗都是容易诱导胚状体的外植体
随着胚性愈伤组织继代培养次数的增加， 胚状体发生能力逐渐降低。而有些植物的愈伤 要经长期培养才产生胚状体。
影响胚状体发生和发育的因素 2
第二节 人工种子
人工种子（artificial seeds）：将植物组培产生的 胚状体包裹上用有机化合物和营养物质制作的 人工种皮。 人工种子制作要求：要求能够同步地、大规模地 产生成熟的体细胞胚状体；给胚状体包裹上高 质量的人工种皮；最后解步发育的方法： 1、用 DNA抑制剂处理细胞培养物 5-氨基尿嘧啶；低温处理抑制细胞分裂，再把温度提 高到正常的培养温度，也可达到部分同步化。 2、分离过筛 可获得大小均一的胚性细胞团，再转移到无激素培养基 上培养，可得到大小基本一致的胚状体。 3、利用气体调控胚状体的同步发生 间歇性地向悬浮培养物中通氮气或乙烯可达到胚状体发 生的同步化。 4、利用渗透压调控胚状体的同步生长 胚状体由小到大，其渗透压由高到低。可用高浓度的蔗 糖培养基来控制胚的发育，使其停留于某一阶段，然 后降低蔗糖浓度，使胚状体进入同步发育的状态。
影响胚状体发生和发育的因素 3
☆一般，赤霉素对胚状体的形成没有好处。 ☆脱落酸（ABA）对胚状体的后期发育有促进作用。 ☆腺嘌呤有利于胚状体的诱导。
5、培养基的氮源 还原性氮（铵态氮）高低直接影响胚状体的诱导效果 MS培养基有利于胚状体形成 有机氮源有利于胚状体发生。 脯氨酸对禾谷类胚状体发生有重要作用。 6、天然提取物与活性炭对胚状体形成作用 椰乳对胚胎发生最有效物质；活性炭吸附有毒有害物质。
植物体细胞胚胎发生
第六章植物体细胞胚胎发生第一节体细胞胚胎发生特点及方式一、体细胞胚胎发生特点植物胚胎发生（Somatic embryogenesis）从合子开始。
自20世纪50年代末Steward等发现胡萝卜根细胞离体培养可通过体细胞胚胎发生形成再生植株以来，大量研究表明，大多数植物组织培养、单细胞悬浮培养、原生质体培养和花粉培养中都观察到体细胞胚胎发生或花粉胚胎发生。
其中体细胞胚为二倍体的体细胞产生的胚状结构；而花粉胚（Pollen embryos）是由小孢子或其分裂产物等单倍体细胞产生的体细胞胚，可发育成单倍体植株。
体细胞胚或花粉胚都起源于植物组织培养中一个非合子细胞，是经过胚胎发生和胚胎发育过程而形成的胚状结构。
体细胞胚是离体诱导过程中组织培养的产物，与无融合生殖胚明显不同，只限于组织培养范围使用；体细胞胚起源于非合子细胞，明显区别于合子胚；体细胞胚的形成经过胚胎发育过程，与组织培养器官发生途径中芽与根的分化不同。
植物体细胞胚胎发生和诱导器官发生相比具有明显的特点：①具有两极性：在体细胞胚胎发生早期就具有胚根和胚芽两极性的存在，胚性细胞第一次分裂多为不均等分裂，形成顶细胞和基细胞，继而由较小的顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，而较大的基细胞经过少数几次分裂成为胚柄部分，在形态上具有明显的极性，发育过程与合子胚相似。
体细胞胚一经形成，多数可生长为小植株，成苗率高。
因此，常将发育一定时期的体细胞胚制作成人工种子，以达到快速繁殖优良种质的目的。
不定芽和不定根则为单极性。
②存在生理隔离：体细胞胚形成后与母体植物或外植体的维管束系统较少连接，出现所谓生理隔离（Physiological isolation）现象，与器官发生途径完全不同（不定根或不定芽往往与愈伤组织的维管组织连接）。
③遗传性相对稳定：体细胞胚是由那些未经过畸变的细胞或变异较小的细胞形成，并可以实现全能性表达，通过体细胞胚形成的再生植株变异小于器官发生途径形成的再生植株。
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心形胚
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第七章 植物体细胞胚胎发生
本章主要内容
体细胞胚胎的概念、特点和意义 影响体细胞胚发生的因素 体细胞胚胎发生的生物学 人工种子
一、体细胞胚胎的概念、特点和意义
概念
离体培养下没有经过受精过程，但经过胚 胎发生和胚胎发育过程所形成的类胚结构，称 为胚状体（embryoid）或体细胞胚（somatic embryo）。
饥饿；有丝分裂阻止
2、人工种子包埋
包埋材料： 海藻酸钠、明胶、果胶酸钠、琼脂、树胶
包埋方法： 液胶包埋法；干燥包埋法；水凝胶法
人工胚乳研制
木薯淀粉与海藻酸钠混合胚乳是目前比较理想 的材料，还可以在胚乳中加入激素（GA3等）、 缓释物（活性炭等）、固化剂（CaCl2等）、抗生 素、其他混合物等制作全能性人工胚乳。
人工种皮研制
壳聚糖、El-vax-4260（10％环己烷）等
三、人工种子转换实验
转换指人工种子在一定条件下，萌发、生长、 形成完整植株的过程。可以分为无菌条件下的转 换和土壤条件下的转换。
2、培养基的影响
碳源
碳水化合物的种类和浓度可以影响体细胞胚的生长 发育，蔗糖是体胚发生最有效的还原碳源。但在一些 试验中，某些糖的培养效果优于蔗糖。还可添加半乳 糖、可溶性淀粉等促进体胚的生长发育。
糖类还可作渗透调节剂对体胚发育或成熟起作用。
2、培养基的影响
其他重要离子
培养基中钾离子对体胚发生是必需的，它是维持 阴阳离子平衡的主要阳离子。铁也是一个重要元素， 一般以螯合态存在于培养基中。
马铃薯不同基因型体细胞胚形成能力比较
(Seabrook and Douglass, 2001)
2、培养基的影响
氮源
培养基中氮素的形态亦会显著影响离体条件下的 胚胎发生，体细胞胚的产生要求培养基中含有一定浓 度的还原态氮。多以NH4+的形式供给，椰乳、水解酪 蛋白、酵母提取物以及许多氨基酸也可作为还原氮源。
基础。
二、 影响体细胞胚发生的因素
外植体 植物生长调节物质
培养基 培养条件
1、外植体的影响
产生部位：
理论上取自任何部位的外植体都具有细胞全能性， 但许多研究表明某些植物只有某些区段组培效果较 好。目前多以一定发育阶段的合子胚为首选材料。
生理状态：
应采用外植体增殖能力较强时的状态
基 因 型 的 影 响
体胚发生必须是同步控制。 人工种皮的制造与生产，选用什么样的材料？ 人工胚乳的研制，在胶囊里加什么物质？ 如何进行机械操作，提高体胚产生正常植株的转换率。
二、人工种子的制作
1、获得高质量和高产量的同步化的体细胞胚
①物理方法 手工选择、过筛选择、不连续密度梯度离心、渗
透压分选法、植物胚性细胞分级仪淘选、低温处理 同步化。 ②化学方法：
不同类型的愈伤组织在氨基酸、乙烯释放量、金属 离子、氨态氮与硝态氮的比值上存在明显差异。
柑橘的胚性愈伤组织发育过程中，会出现细胞壁加 厚，酸性POD同工酶特异性表达的现象。
4、体细胞胚胎发生的分子生物学
体胚发生归根结底是启动了某些特异基因的表达， 而蛋白质作为基因表达的产物，通常可以作为某些 发育过程的标记。
1、体细胞胚发生的途径 2、体细胞胚的发育与结构特点 3、体细胞胚胎发生的生化与分子基础
1、体细胞胚发生的途径
直接 途径
间接 途径
（1）体细胞胚从外植体上直接发生
1.诱导阶段
2. 胚胎发育阶段
（兰草叶片体胚发生，Chen等，1999）
（2）体细胞胚间接发生途径
经过愈伤组织的体细胞胚形成
间 接 发 生
体胚发生的基因表达调控是一个相当复杂的过程， 目前已克隆出几十个与体胚发育相关的基因。研究 较清楚的基因主要有：编码晚期胚胎发生丰富蛋白 （LEA）基因；体细胞胚胎分泌蛋白基因；脂体跨 膜蛋白基因，ATP合成酶亚基的基因等。
胡萝卜体细胞胚形成相关的部分基因
基因
表达产物
表达时期
资料来源
DC8
DC59 DC3 EMB-1 ECP31 ECP40 EP2 EP3 DC2.1 DC7.1 DC9.1 EF1-a CEM1
活性炭
培养基中添加活性炭有利于体胚发育，这在椰枣、 胡萝卜、常春藤等植物的组培试验中都得到证实。
3、激素的调控作用
生长素
生长素对体胚发生具有重要的调控作用，2,4-D是 应用最为广泛的生长素，其次是NAA。2,4-D的作用 具有双重性，一般在体胚诱导阶段必须加2,4-D，在 体胚发生阶段需要降低或取出2,4-D。但有些植物也 并非如此，这与植物本身的内源激素状况有关。
特点
普遍性 两极性 生理隔离 遗传性相对稳定 重演受精卵形态发生过程
意义
研究细胞分化、细胞全能性机理的理想实验体系 人工种子的技术基础 体胚可长期保存，利于种质资源保存 遗传性稳定、再生频率高，是理想的遗传转化受体 间接体胚发生过程的无性系变异利于突变体的选择 做为制备原生质体的材料，为细胞分化和植株再生奠定
体积明显小于合子胚，体胚干物质的积累、蛋白质 合成和多糖含量明显少于相应的合子胚，组成上也 不同；
体胚中一般没有胚柄的分化，或胚柄不明显； 体胚的发芽率、生活力和转换率远低于合子胚，畸
形胚发生率高于合子胚。
类似于植物合子胚的发育
（咖啡，Fifueroa, 2002）
胚胎细胞 发生
早期原胚 发生
3、激素的调控作用
细胞分裂素
细胞分裂素对体胚的发生是必不可少的。但有 些外植体本身已含有足够的细胞分裂素，因此不必 外加也可满足生长需求。
许多植物的体胚诱导需要细胞分裂素和生长素 的配合使用。如檀香、桉属等。最常用的为BA，近 年又发现TDZ的活性更高，已成功在黑核桃、美国白 蜡等植物中诱导出体细胞胚。
球形胚 形成
完整胚 结构形成
结构特点——与器官发生比较
四、人工种子
1、人工种子概念
将组织培养中形成的体细胞胚或不定芽包裹在 能提供养分（人工胚乳）的胶囊里，再在胶囊外包 上一层具有保护功能的防止机械损伤的外膜（人工 种皮），造成一种类似于天然种子的结构。
1978年穆拉希格（Murashige）提出人工种子概 念，1986年Redenbaugh等就成功地利用藻酸钠 包埋单个体细胞胚，生产人工种子。
C: 水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体，大多数体细胞胚、 不定芽、茎尖等均需要先包埋在半液态凝胶中，再经人工种 皮包裹才能避免失水，从而维持良好的发芽能力。
据报道，目前已对26个科，36个属的植物进行了 人工种子研究。其研究范围显示出两大特点：
一是重要经济作物和粮食作物的人工种子报道日益 增多；
这一定义有以下几方面的界定：
① 体细胞胚是离体培养的产物，只限于离体培养 范围使用，以区别于无融合生殖的胚；
② 体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚； ③ 体细胞胚经历了胚胎发育过程，以区别于离体培
养中器官发生形成个体的途径。
植物体细胞胚发生的普遍性
愈来愈多的研究表明，植物体细胞在离 体培养中，通过体细胞发生途径形成再生植 株已是极其普遍的现象，并认为该发生途径 是植物体细胞在离体培养条件下的一个基本 发育途径。
Gea14 Gea 31 Gea41
LEA(Grp3)
Oleosin LEA(Grp3) LEA(Grp1) LEA(Grp4) LEA(Grp2) Lipid transfer Chintinase Pro-rich protein Gly-rich protein Gly-rich protein Elongation factor EF1-a
3、激素的调控作用
赤霉素
有些学者认为，赤霉素能抑制体细胞胚胎发 生，所以应用较少，但在有些植物中，赤霉素对于 胚的成熟、发根和次生生长有益。
脱落酸
ABA对体胚发生，尤其是对体胚的成熟非常重 要，还能防止畸形胚的产生，抑制体胚的过早萌 发，防止针叶树中裂生多胚现象。
3、激素的调控作用
乙烯和多胺
乙烯和多胺是分布在植物体内对植物的生长发 育有多种调节功能的生长调节物质。
根据包被的程度可将人工种子分为三大类：
A
裸露的或休 眠的繁殖体
B
人工种皮包 被的繁殖体
C
水凝胶包被 皮的繁殖体
A: 裸露的或休眠的繁殖体，如可以适当干燥的体细胞胚、 休眠的微鳞茎和微块茎等，它们在不加包被的情况下也具有 较高的成株率；
B: 人工种皮包被的繁殖体，一些体细胞胚、原球茎等虽不 能过度干燥，但只需人工种皮包被即可维持良好的发芽状 态，如胡萝卜体细胞胚；
De Vries等，1988；Sterk等，1991 De Jong等，1992 Aleith和Richter,1990
Apuya和Zimmerman，1992 Kawahara等，1992
Liu等，1996
5、体细胞胚与合子胚 两种胚胎发生体系的比较
合子胚有胚乳和种皮包被，而体胚没有胚乳，其培 养条件代替了胚乳的作用；子叶常不规范。
④ 在人工种子材料里，可加入农药、菌肥和激素等，有 利于抗病虫害，加速生长和发育。
⑤ 节省劳力，降低成本，而且种子外形均匀，便于播 种，出苗整齐，更适合现代化生产的需要。
⑥ 能够固定杂种、转基因优势，保持遗传稳定性。 ⑦ 与试管苗相比，便于运输和储存。
3、人工种子研制涉及的主要问题
体细胞胚必须是高频率诱导，不仅要求数量多，而且 质量高。