金属离子对牛小肠碱性磷酸酶的影响

十分昂源自文库 ,我们选择了碱性磷酸酶含量丰富且价格 较低的牛小肠作为原材料进行分离纯化并研究了不 同的金属离子对酶的影响 ,以期为制备碱性磷酸酶 试剂提供更多的理论指导 。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂 牛小肠 ( calf intestine) 购自四川省成都市郭家
桥农贸 市场 。对 硝基 苯磷 酸二 钠 ( pNPP ) 为 德 国 M erck产品 ;二乙基氨基乙基纤维素 (DEAE232 ) 为
ZHANG Ying, YU Tong, ZHAO Xin2p ing3 , GAO Ju
( School of L ife Sciences, Key Laboratory of B io2resources and Eco2environment M inistry of Education, Sichuan University, Chengdu 610065, China)
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四川动物 2009年 第 28卷 第 6期 S ichuan Journa l of Zoology Vol128 No16 2009
Sigma产品 ; 葡聚糖凝胶 ( Sephadex G2150 ) 为 Phar2 macia产品 ;甲叉双丙烯酰胺 (B is)为 Fluka产品 ;其 余化学试剂均为国产分析纯 。所有试剂均用蒸馏水 配制 。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 AL P的分离纯化 参照 ERNST等 ( 1974 ) 的方法略加修改 ,取新鲜的牛小肠 150 g在 4℃预冷 的蒸馏水中清洗干净 ,用纱布吸去表面水分 ,按照 1 ∶3 (M ∶V )的比例加入预冷的 0. 05 mol/L Tris2HC l缓 冲液 (pH9. 0) ,匀浆后于 4℃冰箱中抽提 4 h,加入预 冷正丁醇 150 m l, 4℃冰箱中抽提 2 h, 8000 r/m in离 心 15 m in,弃沉淀 ,向上清液加入硫酸铵使其浓度为 35% ,于 4℃冰箱中过夜 ,离心弃沉淀 ,收集上清液 , 向上清液中加入硫酸铵使其浓度为 75% ; 4℃条件 下静置 4 h,离心并收集盐析物 ; 用 0. 05 mol/L 的 Tris2HC l缓冲液 (pH9. 0)溶解沉淀 ;经充分透析 、离 心后上 DEAE232 柱 ( 2 cm ×20 cm ) ,用 0. 05 mol/L 的 Tris2HC l缓冲液 (pH8. 5)平衡 5个柱床体积 。上 样洗柱后用 0 ～1 mol/L 的线性梯度 NaCl溶液洗 脱 ,流速为 0. 5 m l/m in,每管收集 4 m l。测定每管的 ALP活性和蛋白含量 ,将活性较高的各管洗脱液收 集后进行超滤浓缩 。上 Sephadex G2150 柱 ( 1. 6 cm ×60 cm ) , 用 0. 05 mol/L 的 Tris2HC l缓冲 液 ( pH 8. 5)以 0. 2～0. 3 m l/m in速度洗脱 ,每管收集 3 m l, 分别测定每管的 ALP活性和蛋白含量 。合并酶活 峰 ,上 DEAE232柱 (2 cm ×20 cm ) ,收集酶活峰得到 酶样品 。 1. 2. 2 酶活力的测定 采用对硝基苯磷酸二钠 (pNPP)为底物的方法 (Xiao et a l. , 2002) 。
Abstract:A lkaline phosphatase (ALP, EC 3·1·3·1) is a non2specific phosphomononoesterase that functions through the phosphosery1 intermediate to p roduce a free group to other alcohols. ALPs have been extensively investigated and w idely used as biochem ical and diagnostic reagents, among which ALP from calf intestine is an ideal one for its extensive uses in genetic engineering. W e choose calf intestine as a resource of ALP for the purpose of app lying ALP to biochem ical and clini2 cal reagents. Calf intestine ALP was separated by extraction of n2butyl alcohol, amonanium sulfate p recip itation, ion ex2 change through DEAE232 chromatography column, gel filtration chromatography through Sephadex G2150 column and DE2 AE232 chromatography column. ALP was detected as one band through SDS2Polyacrylam ide gel electrophoresis, indicating its homogeneity in components. The ultimate specific activity of purified enzyme was measured as 48. 87 U /mg. Study of va2 rious metal ions demonstrates that the positive monovalent cations Na + , K+ had no effect on the enzymes; N i2 + , Co2 + had no obvious effect on the enzyme, M g2 + , M n2 + , Ca2 + activated the enzyme while Zn2 + , Cu2 + , Pb2 + , Cd2 + inhibited the enzym e. Key words: calf intestine; alkaline phosphatase; metal ions
收稿日期 : 2008212229 修回日期 : 2009203227 基金项目 :“十一五 ”国家科技支撑计划重点项目 ,项目编号 : 2006BAF07B01 作者简介 :张营 (1983～) ,男 ,硕士研究生 ,从事生物化学与分子生物学研究 , E2mail: zhangying831020@163. com 3 通讯作者 Corresponding author,女 ,副教授 ,从事生物化学与分子生物学研究 , E2mail: xinp ingzhao@ sohu. com 致谢 :本实验承蒙四川大学杜林方教授的大力支持和帮助 ,在此表示诚挚的谢意 !
四川动物 2009年 第 28卷 第 6期 S ichuan Journa l of Zoology Vol128 No16 2009
金属离子对牛小肠碱性磷酸酶的影响
张营 , 余同 , 赵欣平 3 , 高举
(四川大学生命科学学院 , 生物资源与生态环境教育部重点实验室 , 成都 610065) 摘要 :经 Tris2HCl缓冲液抽提 ,硫酸铵分级分离沉淀 , 2次 DEAE232柱层析和 Sephadex G2150凝胶过滤 ,从牛小 肠中得到碱性磷酸酶 (ALP) ,提纯倍数为 50. 69倍 ,比活为 48. 87 U /mg,酶液经十二烷基硫酸钠 2聚丙烯酰胺凝胶电 泳 ( SDS2PAGE)检测呈现单一条带 。该酶催化底物对硝基苯磷酸二钠 (pNPP)水解反应的最适 pH 值为 9. 7,最适温 度为 45℃。研究了多种金属离子对牛小肠碱性磷酸酶活性的影响 ,结果表明 :一价金属离子 Na + 、K+对酶活力没有 影响 ;不同的二价金属离子对酶的影响不同 ,过渡态金属离子中 , N i2 + 、Co2 + 对酶的活力影响不大 , M g2 + 、Ca2 + 、 M n2 +对酶有不同程度的激活作用 , Zn2 + 、Cu2 +对酶有抑制作用 ;重金属离子 Pb2 + 、Cd2 +对酶的活力起抑制作用 。
activity (U /mg)
正丁醇抽提 ( Extraction with n2butyl alcohol)
0. 35饱和度硫酸铵 ( 0. 35 (NH4 ) 2 SO4 )
0. 7饱和度硫酸铵 ( 0. 7 (NH4) 2 SO4 )
关键词 : 牛小肠 ; 碱性磷酸酶 ; 金属离子 中图分类号 : Q556 文献标识码 : A 文章编号 : 1000 - 7083 (2009) 06 - 0835 - 04
Effects of M eta l Ion s on A lka line Phospha ta se of Ca lf In testine
参照酶活力测定方法 ,在反应体系中分别加入 不同浓度的含各种金属离子的无机 盐溶 液 , 加入 100μL 酶液和 100 μL pNPP,用 Tris2HCL 缓冲液补 足至 2 mL ,于最适温度下反应 10 m in,用 1 mL 浓度 为 1 mol/L NaOH 终止反应 ,在 405 nm 处测定光吸 收值 ,以无金属离子反应体系为对照 ,计算各种金属 离子存在下的酶的相对活力 。选用的效应物分别为 N aCl、KC l、M gSO4 、CaC l2 、N iSO4、CoC l2 、M nSO4 、 CuC l2 、ZnSO4 、CdC l2 、Pb (NO3 ) 2 。
1. 2. 3 蛋白浓度的测定 采用紫外分光光度法 (Layne, 1957)和 B radford法 (B radford, 1976)测定 , 以牛血清白蛋白为标准样品 。 1. 2. 4 AL P纯度鉴定 采用 SDS2聚丙烯酰胺凝胶 (W ang & Fan, 2002)电泳进行纯度鉴定 。 SDS2聚丙 烯酰胺凝胶采用 5%的浓缩胶 、10%的分离胶 。 1. 3 AL P的最适 pH和最适温度
2 结果与分析
2. 1 AL P的提纯与鉴定 2. 1. 1 AL P的纯化 牛小肠匀浆液经过正丁醇抽 提 、硫酸铵分级分离沉淀 、透析后经过 DEAE232 离 子柱交换层析 、Sephadex G2150凝胶柱 、DEAE232离 子柱得到纯品 。整个纯化结果如表 1所示 。
纯化程序 Purification p rocedures
参照 唐 云 明 ( 1997 ) 的 方 法 以 20 mmol/L 的 pNPP为底物 ,将 ALP加入不同 pH 值缓冲液中 ,于 37℃条件下反应 , pH选择范围 7. 0～12. 0,测定其酶 活力 。最适温度的测定同上 ,将酶液在最适 pH、不 同温度条件下 (20～60℃)测定其酶活力 。 1. 4 金属离子对牛小肠 AL P的影响
碱性磷酸酶 (A lkaline phosphatase, EC 3·1·3 ·1, ALP)是一类在碱性条件下具有较高催化活性 、 能催化几乎所有磷酸单酯酶水解生成正磷酸和对应 醇 、酚和糖等物质的一组非特异性水解酶类 ( Fern2 ley, 1972) 。关于鱼类 (张继平 , 2005 ) 、软体动物 (万谦 , 1994) 、脊索动物 (颜思旭 , 1980 ) 、昆虫 (赵 欣平 , 2001)的 ALP的研究 ,国内已有报道 。以哺乳 动物器官为原材料制备碱性磷酸酶在国内报道不 多 ,国外商品 ALP多数是从大肠杆菌发酵和牛小肠 粘膜 、牛脾等动物脏器中提取制备 。鉴于进口试剂