C2-2 分子克隆的工具酶

E.coli 和T4DNA连接酶
E.coliDNA连接酶 催化连接底物 反应需辅因子 用途 DNA NAD 黏性末端的连接 T4DNA连接酶 DNA、RNA ATP 黏性末端 平末端的连接及切口 的连接 4～160C
连接温度 连接时间
4～160C 过夜； 4h
2.2.2.1 具黏性末端的DNA片段之间的连接
• 用途： 以单链RNA 为模板，以 olig(dT)15~20 、 随机寡聚核 苷 酸 （ 6~10 个 ） 或 基 因 特 异 引 物 合 成 cDNA ， 可 用 于 cDNA文库构建、探针标记或RT-PCR反应。
2.2.3 RNA 聚合酶 (RNA polymerase)
教材p33
• 以DNA为模板合成mRNA，不需引物，但必须 有启动子。 • 常用的RNA聚合酶来源与SP3、T3和T7噬菌体。 • 用途：体外转录用于体外翻译的底物或体外剪 接反应的底物； 用作RNA探针。
2.2.2 反转录酶 (reverse transcriptase)
• 依赖于RNA的DNA聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase)。 • 一般具有5’→3’DNA聚合活性以及很强的RNase H活性。 • 该酶无3’→5’外切酶校正作用，故存在错误碱基掺入;需高浓度 dNTP • 可以合成第一链cDNA，也可以自身序列为引物继续合成第二 链cDNA（效率低）。 • RNase H具有核酸外切酶活性，能按5’→3’和3’→5’方向特异地 降解RNA:DNA杂交分子中的RNA链，使其成为长4~20个碱基 的寡核甘酸。
特点 ： RNase 的非竞争性抑制剂，以非共价方式结 合在 RNase 上，需要 DTT 。对 RNase H 以及反转录 酶等不起抑制作用。 作用 ： 用于 RNase 活性的抑制 ，防止 RNase 对样品 RNA的降解。
2.4.2 甲基化酶（methylase）
• 存在广泛。甲基化酶是原核生物限制修饰系统中的一员。 • 大肠杆菌中主要有两种：Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶。
• 脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）
特点 ：来源于牛胰，可降解双链或单链 DNA 。 在 Mg2+ 存在下，作用于 dsDNA ， 产生 随机切口 ；在 Mn2+ 存 在 下 ， 在 两 条 链 的 大 致 同 一 位 置 切 割 dsDNA，产生平末端或1~2个核甘酸突出的切口。 用途：去除RNA样品中的DNA，还可用于切口平移 标记探针、DNA足迹分析、构建随机缺失突变体等。
(exonuclease VII)
DNA片段5’端脱磷酸化作用后连接
-p
防止载体 自我连接
2.2.2.4 DNA片段加连杆（linker）后的连接
• 连杆/衔接物（linker）：化学合成的8～12个核 苷酸组成的寡核苷酸片段。以中线为轴两边对 称，其上有一种或几种限制性核酸内切酶的识 别序列，酶切后可产生一定的黏性末端，便于 与具有相同黏性末端的另一DNA片段连接。 • 衔接头/接头（adaptor）：化学合成的寡核苷 酸，含有一种以上的限制性核酸内切酶识别序 列。其一端或两端具有一种或两种内切酶切割 产生的黏性末端。
• 用途： 对线性化的载体分子进行脱磷，防止载体自我环化，提高重组 DNA检出率；5’末端标记前的脱磷酸化。
碱性磷酸酯酶与DNA脱磷酸作用
复习思考题＋教材p38思考题
1.名词解释： 限制性核酸内切酶；回纹结构；同尾酶；同裂酶；黏性末 端；平末端；限制性核酸内切酶的酶活性单位（U）；限制 性核酸内切酶的星活性；连杆（linker）；衔接头（adaptor） 2. 限制性核酸内切酶反应体系的组成是什么？ 3. 引起限制性核酸内切酶星活性的可能因素有哪些？ 4. DNA片段之间的连接方式有哪些？ 5. 假设DNA片段A与DNA片段B的黏性末端非互补，试述连接A 片段与B片段的两种方式？ 6. DNA聚合酶、RNA聚合酶、反转录酶、末端转移酶、多核苷 酸激酶、碱性磷酸酯酶和核酸酶有哪些主要特性？它们在基 因工程中的主要用途分别是什么？
• 使DNA或RNA分子的5’-P末端脱磷转换成5’-OH末端 • 主要有两种：
CIP或CIAP（calf intestinal alkaline phosphatase，牛小肠碱性磷酸酶）， 其活性容易除去； BAP（bacterial alkaline phosphatase，细菌碱性磷酸酶），耐高温和去污 剂，其活性不易丧失。
• 核糖核酸酶 H（ribonuclease H， RNaseH）
特点 ：特异水解 DNA:RNA 杂交分子中 RNA 上的磷 酸二酯键。对单链核酸、dsDNA及dsRNA均不起作 用。许多酶附带有该酶的活性，如AMV反转录酶。 作用：降解DNA:RNA杂交双链分子中的RNA。
• S1核酸酶（S1 nuclease）
2.2.4 末端转移酶 (terminal transferase)
• 特性：不依赖于模板的DNA聚合酶；可在单链或双链 DNA（至少3个碱基）的3’-OH端（5’突出或平末端效 率低）添加一个或多个核苷酸。 教材p33 表2-6 同聚尾的长度 • 用途：给cDNA分子或载体末端加同聚尾；3′末端标记。
• 一 般 有 两 种 ： 禽 成 髓 细 胞 瘤 病 毒 AMV (avian myeloblastosis virus) 反转录酶以及M-MLV （ Moloney 鼠 白血病病毒）反转录酶。 • AMV与M-MLV的主要区别：
M-MLV的RNase H活性较弱，有利于合成较长的cDNA。 AMV 的反应温度较高（可达55℃），可用于基因比较复杂、 有二级结构或GC含量较高的RT反应。
双链DNA
2.3.1 DNA连接酶（DNA ligase）
• 催化双链DNA片段紧靠在一起的3’羟基末 端和5’磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键。 • 连接酶的种类：
T4 DNA连接酶 E.coli DNA连接酶 T4 RNA连接酶
T4DNA连接酶的活性单位
• Weiss单位：37°C 20min催化1 nmol 32P从焦磷 酸根置换到【γ，β 32P】ATP所需 的酶量。 • NEB：在20 μl反应体系中于16 °C ，使Hind III 切过的λDNA（300 μ g/ml, 0.12 μmol/L 5’末端） 在30 min内连接50％所需的酶量。 • 1 weiss unit=67 NEB连接单位
Dam甲基化酶识别GATC，使A*甲基化； Dcm甲基化酶识别CCAGG或CCTGG，使第二个C*甲基化。
• 不同限制酶对甲基化的敏感程度不同。 • 植物基因组甲基化程度高，酶切时应选用甲基化不敏感 限制酶。 • 用途：修饰（或保护）酶切位点；产生新的酶切位点。
2.4.3 T4多核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase)
同尾酶
2.2.2.2 具平末端DNA片段之间的连接
Baidu Nhomakorabea
G
产生新的酶切位点
2.2.2.3 DNA片段末端修饰后进行连接
• DNA片段末端同聚物加尾后进行连接 • 黏性末端修饰成平末端后进行连接 • DNA片段5’端脱磷酸化作用后连接
多聚C加尾
粘性末端加尾 多聚G
平末端与黏性末端
黏性末端修饰成平末端后进行连接
特 点 ： 来 源 于 米 曲 霉 ， 单 链 核 酸 酶 ， 降 解 单 链 DNA 或 RNA ， 产生 5’P- 单核苷酸或寡核苷酸。对双链DNA的突出 末端以及发夹环也起作用。单链区可小到只有一个碱基。 用途：移去单链尾巴以产生平末端，或打开cDNA合成中产 生的发夹环。
• 核酸酶抑制剂（RNase inhibitor）
• 催化 γ - 磷酸基团从 ATP 分子转移到 DNA 或 RNA 的 5’-OH末端，或与DNA分子的5’-磷酸基团置换。 • 不受底物分子大小的限制 • 用途： 对5’-OH末端的DNA或合成接头进行磷酸化； 对5’末端进行标记。
多核苷酸激酶的活性和DNA分子5′末端标记
2.4.4 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)
5’端脱磷
区别
• 核糖核酸酶A（ribonuclease A，RNase A）
特点：来源于牛胰，核酸内切酶，可特异攻击RNA 上嘧啶碱 基的 3’ 端，从而降解 RNA 。 比 DNase 耐 热 ，其活性不易丧失，故在配制 RNase 时，通过沸 水浴10~15分钟以去除DNase活性。 用途：广泛用于去除DNA样品中的RNA。也可用于 去除DNA:RNA杂交分子中未杂交的RNA单链区。