4常用分子克隆工具酶简介

1.1 Ecoli DNA polymerase I 分类： DNA pol I DNA pol Ⅱ DNA pol Ⅲ
DNA pol I特性： ⑴ 5‘-3'DNA聚合酶活性 ⑵ 3‘-5'外切酶活性 ⑶ 5‘-3'外切酶活性 （切口平移）
DNase I 作用特点
Mn 2+存在时
Mg2+存在时
λ外切酶、Bal31连用 2) DNA定序分析 3) S1作图法 4) 基因结构分析 5) tRNA 结构分析
5'
S1核酸酶活性
5' 5'
ExoIII 5' S1
S1
Poly(A) S1
Poly(A) S1 5'
S1
S1 5'
1.2 Bal 31 核酸酶
对单链DNA具有特异的内切酶活性，可 从3‘O端H 降解DNA。对于L-DNA，它表现 3'-5‘的外切酶活性和5'-3‘的外切酶活性，可 又有控制地从3'端和5‘端逐个水解除去单核 苷酸，产生缩短了的DNA分子。
3' 5'
热变性
3' 3'
5'
随机引物 ~~~~~~ ~~~~~~ ~~~~~~ ~~~~~~
退火
3' 3'
5'~~ 5'
? -32PdNTP
Klenow 酶
3' 3'
5' 5'~~ -------
1.3 T4 DNA polymerase
特点：
5' →3' 聚合酶活性 3'→5' 外切酶活性
外切酶活性 无dNTP
1.3 DNase I
用途 1) 切口移位，制备DNA探针 2) 制备RNA样品时除去DNA分子 3) 基因突变时产生切口
ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口
OH 3'
ATP
32P 5'
1.2 T4 多聚核苷酸激酶
用途： 1) DNA或RNA的5' 末端标记 2) 分子克隆过程中以获得5' -磷酸基末端，
便于连接酶反应
1.3 碱性磷酸酶
用途
1) 载体DNA的去磷酸化，防止自我连接，以增加 重组频率
2) 5' 端 核酸末端标记
碱性磷酸酶与T4 多聚核苷酸激酶活性
1 DNA polymerase分类
依赖于DNA的DNA聚合酶:
Ecoli DNA polymerase I
klenow片段 T4 phage DNA ploymerase T7 phage DNA ploymerase 耐热DNA聚合酶(Taq 酶) 依赖于RNA的DNA聚合酶: 反转录酶(reverse transcriptase)
聚合酶活性 dNTP
用途： ⑴补平反应 ⑵末端标记 ⑶抹平反应
1.4 Taq DNA polymerase
特点：
分离自水生栖热菌，分子量为 94,000，最适反应 温度75-80℃ 。
5' -3' 聚合酶活性 5‘-3' 外切酶活性
用途：
主要用于 DNA的体外扩增
5' 3'
5'
5' 3' 3'
3'-末端补齐 3'-末端标记
5' -ACGTTGCAA ACTG -3' 3' -TGCAACGTTTGAC…..5'
cDNA第二链合成
mRNA 3' -UGCAACGUUUGAC…..5' c DNA 5' -ACGTTGCAAACTG
GAC
5' 3' 5'
5' ~~ 5'
5' ---------~~ 5'
2 DNA ligase简介 2.1 T4 DNA ligase
连接类型： DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA dsDNA的黏性末端和平末端
2.2 大肠杆菌 DNA ligase
dsDNA 的黏性末端和平末端
3 DNA ligase 催化连接反应的特点 3.1 需要3-OH 和5-P 3.2 需要ATP或NAD+和Mg2+为辅助因子和激活
⑴ 反应特点
在酶的催化下将 dNTP 加到DNA分子的3‘OH末 端，催化作用不需要模板。
⑵ 用途
3' -加尾，便于两 DNA分子重组 3' -末端标记
1.2 T4 多聚核苷酸激酶
催化反应： 正向反应 催化5‘-OH 末端的磷酸化
交换反应
5' P 3'HO
OH 3' P 5'
5' 32P
[γ-32P]ATP 3' HO
DNaseI 与 Pol I 的 切口移位
HO P 5' 3' 5' 3'
DNaseI Pol I
5' 3'
1.2 Klenow片段 大肠杆菌DNA聚合酶I的枯草杆菌
蛋白酶水解产物。
活性：5' ? 3' 聚合酶 3' ? 5' 外切酶
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用途：
⑴ 3' -末端补平 ⑵ 3' -末端抹平 ⑶ cDNA第二链合成 ⑷ 双脱氧系统测序
5' P 3'HO
OH3' 5'HO
I
P 5'
3'HO
OH3' OH5'
5' P
II
3'HO
OH 3' P 5'
第四节 外切核酸酶
1 外切核酸酶概念 2 分类
按照酶对底物二级结构的专一性，分为： 作用于单链的外切核酸酶 作用于双链的外切核酸酶
第五节 单链内切核酸酶
1.1 S1核酸酶
特点： ss-DNA; ss-RNA; 双螺旋变性区 用途 1) 基因突变--缺失，常与外切酶，如ExoIII 、
Taq Pol 和PCR
3' 变性 5'
5'
3'
3'
5'
3' 5' 引物 3'
延伸 5'
5'
3'
3' 引物 5' 复性
3' 5' 3' 5'
1.5 反转录酶(reverse transcripase) 用途：
⑴ cDNA第一链的合成 ⑵补平反应 ⑶用于DNA测序
第三节 DNA 修饰酶
1.1 末端转移酶（TdT ）
因子
3.3 被连接的是dsDNA 3.4 只能封闭缺口
4 影响DNA ligase 连接反应的因素
4.1 温度
黏性末端 4-15℃
平末端
10-20℃
4.2 连接酶浓度
平末端 1-2个单位
黏性末端 0.1个单位
4.3 ATP浓度 4.4 DNA片段末端
第二节 DNA 聚合酶和反转录酶
DNA 聚合酶：在引物和模板的存在下， 把脱氧核糖单核苷酸连续地加到双链 DNA分子引物链的3′-OH 末端，催化 核苷酸的聚合作用。
常用工具酶简介
第一节 DNA连接酶(DNA ligase)
1 DNA Ligase 1.1 概念 1.2 分类
根据连接反应时所需能量辅助因子的不同： 依赖ATP的DNA ligase 依赖NAD+的DNA ligase
按照来源分： T4噬菌体DNA ligase 大肠杆菌DNA ligase 热稳定DNA ligase