第二章：分子克隆的工具酶.
基因工程复习资料
第二章分子克隆工具酶基因工程工具酶⏹限制性内切酶——主要用于DNA分子的特异切割⏹DNA甲基化酶——用于DNA分子的甲基化⏹核酸酶——用于DNA和RNA的非特异性切割⏹核酸聚合酶——用于DNA和RNA的合成⏹核酸连接酶——用于DNA和RNA的连接⏹核酸末端修饰酶——用于DNA和RNA的末端修饰⏹其它酶类——用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。
第一节限制性核酸内切酶(restriction enzyme)一、限制性内切酶的发现历史核酸酶：催化核酸酯键的水解核酸外切酶：作用于核酸链的末端(3′或5 ′),逐个水解核苷酸。
核酸内切酶：从核酸分子内部切断3′，5′磷酸二酯键。
限制性核酸内切酶：在细菌细胞内存在的一类能识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶。
1、细菌的限制——修饰现象细菌的限制——修饰作用发现细菌的限制（restriction）现象：寄主控制的专一性phageλKR-M 系统的作用:R-M 系统是细菌安内御外的积极措施。
保护自身的DNA不受制；破坏外源DNA使之迅速降解细菌R-M 系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA 的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA 则会被降解。
个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。
限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。
由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。
2、限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶(restriction endonuelease)是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。
它是可以将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。
第二章：分子克隆的工具酶
加几个和加哪几个的问题
/techinfo/re/restrdigpcrii.htm
比如设计引物5'端导入酶切位点的时候, 一般导入3–4 个;导入的碱基, 最好是A/G/C/T比较平均,并能部分平衡 整个引物的GC%和Tm;G/C为主,可以使引物5'形成所谓GC Clamp(有的软件,认为这样好). 别的就没什么了.
1. 现象
* 1975 EcoRI切割 phage (Lambda)中的5个 位点，并不是随机的，靠近右端的位点， 比分子中间的位点切割快10倍。
* 有4个 SacII位点 三个在中央 一个在右臂（Right-terminus）
at 40,386 中央三个快50倍
NEB检测了许多限制酶，有许多酶 的差异在10倍的范围上，但有许多 酶有较大的差异, 如
三、限制酶产生的末端种类 1.粘性末端
１）３’-端突起， ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
2. 平末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
5’-CCC 3’-GGG
GGG-3’ CCC-5’
在对称轴上同时切割DNA的两条链
HaeIII
GG↓CC
EcoRV GAT↓ATC
双酶切 PCR产物
AccI HindIII
EcoRI
CCGGTCGACCGG
2hr 20hr 00
CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG
00 00 10% 75%
GGAATTCC
>90 >90
PstI
GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA
AACTGCAG(N) 14 CTGCAG(N) 20
分子克隆
2
第一节 基因工程技术路线
载体和目的基因的分离； 载体和目的基因的切断； 载体和目的基因的重组； 重组DNA的转化和扩增； 重组DNA的筛选和鉴定。
3
第一节 基因工程技术路线
基因重组技术的两个基本目的：
1.直接利用基因 主导生长的基因、 作物的抗性基因、 基因诊断、基因治疗、 指纹图谱等。
2）可移动质粒（mobiliableplasmid）可以被传递，但不能使细菌接合。 3)自传递质粒（selftran missible plasmid）兼具1）2）两种功能因而可以自
40
第三节 分子克隆常用的载体
质粒发现和研究意义
1）理论意义 质粒能够复制、传递和表达遗传信息，从分子遗传学观点来看 是一种有机体，是比病毒更原始的生命形式，是生命起源研究的起一块体重要 基石。
2）实践意义 是基因工程的重要载体（vector），能把外源基因（目的基 因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。
医学分子生物学基础
分 子 克 隆
南京农业大学 动物医学院基础兽医系动物生化教研室
1
第五章 分子克隆
重组DNA技术（recombinant DNA technology）
是按照人的意愿、在体外对DNA分进行重组，再将 重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖， 以获得该DNA分子的大量拷贝。
克隆(clone)是指通过无性繁殖过程所产生的与亲
切平由核酸内切酶产的的3`粘性末端 DNA片段的同位素末端标记
29
第二节 分子克隆常用的工具酶
反转录酶 reverse transcriptase
1. 以RNA为模板，聚合形成cDNA链。 2. 双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链
基因工程复习总结
第二章分子克隆工具酶
1简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。
2.说明限制性内切核酸酶命名原则（举例）。
3.限制内切核酸酶的星活性是指什么？
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。
第三章分子克隆载体
1.基因工程载体应具备哪些特点？
能在宿主细胞中独立复制；
有一定的选择标记，易于识别和筛选；
有合适的限制酶位点，可插入一段较大的外源，而不影响其本身的复制;
最好有较高的拷贝数，便于载体制备。
2.作为一个最基本的载体，它必须具备哪些功能元件？
能独立复制的单链或双链;
选择标记基因；
合适的限制酶位点。
引物有哪些基本要求？
在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各1μM，即1μl，在100μl反应体系中相当于6x1013个分子。如果5%用于扩增1的片段，可得到3.3μg的产物，足以用于常规分析。
引物设计要考虑的几个问题
①长度：至少16，通常为18-30，更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。
c.包装蛋白制备过程较复杂，每批包装蛋白的包装效率不稳定。而且，购买包装蛋白的费用较高。
第五章表达载体
····1.以大肠杆菌为例，表达载体比克隆载体多了哪些功能元件，各有什么生物学功能？
2.简述利用T7噬菌体启动子的系列表达载体的工作原理。
····3.何为穿梭载体，在遗传结构上有何特点？
···4.将人的某个基因在大肠杆菌中表达应注意哪些问题？
4.黏粒载体具有哪些优缺点？怎样克服其缺点？
黏粒的优点
（1）同时具有λ噬菌体和质粒载体的特性
第二章 (用)分子克隆工具酶
W=A or T S=C or G
6：EcoRI HindIII
G AATTC A AGCTT
>6 Not I
GC GGCCGC 8
BbvCI CC TCAGC
7
PpuMI RG GWCCY 7
2.结构 ① 回文对称（旋转镜像对称） DNA两条链的对称位置。
切割位点在
EcoRI
GAATTC CTTAAG
化酶
酶
分子不在一起
4-6bp, 大多数 5-7bp 非对称 为回文对称结 构
在识别位点中 在识别位点下 或靠近识别位 游 24-26bp 点
分开的反应 同时竞争
限制作用是否 Yes
No
Yes
需用 ATP
类型II(type II)占93%
识别回文序列(palindromic sequence),
在回文序列内部或附近切割,产生带3’-OH和
•全部辅音按字母读,如pstⅠ
限制性酶和修饰酶的数量
早前上是限制性酶加R，是修饰酶加M,且菌株 号和序号小写 1968年 下半年 615R 98M 1998年 10000细菌 古细菌
3000种酶 200多特异性 到2006年2月为止,共发现3773种限制酶,810种 甲基化酶
到2011年？（查）
三、限制性核酸内切酶的类型
5’-P基团的DNA产物 需Mg2+,相应的修饰酶只
需SAM。
• EcoRI
GAATTC CTTAAG
识别序列(recongnition sequence)主 要为4-6bp,或更长且呈二重对称的特殊序 列。
但有少数酶识别更长的序列或简并序 列(degenerate sequence),切割位置因酶 而异,有些是隔开的。
第二章 分子克隆工具酶
2 分子克隆工具酶（4学时）概述限制性内切核酸酶甲基化酶（Methylase）DNA聚合酶（DNA polymerase Ⅰ）其他分子克隆工具酶工具酶的定义o在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。
o基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。
所以把这些酶称之为“工具酶”。
o工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。
o自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。
这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA 进而降解非己DNA的防御工具。
o本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。
常用的工具酶2.1 限制性内切酶(restriction enzyme)o限制与修饰（Restriction and modification）o限制酶识别的序列o限制酶产生的末端o DNA末端长度对限制酶切割的影响o位点偏爱（Site preference）o酶切反应条件o星星活性（star activity）o单链DNA 的切割o酶切位点的引入o影响酶活性的因素o酶切位点在基因组中分布的不均一性E.coli k 感染频率下降许多E .coli B 【E .coli B 限制λ（k ）】1. 限制与修饰现象①50年代后Luria 和Human(1952), Bertani 和Weigle (1953) 发现细菌的“限制”现象：2.1.1 限制与修饰（Restriction and modification ）E.coli B 修饰λ(k)*λ(k)感染E.coli(B)细菌如何对λ噬菌体进行限制和修饰?E.coli B对这些λ(K)进行了修饰。
表2-1 λ噬菌体不同感染株对E.coli 不同菌株的感染率111E.coli C 10-4110-4E.coli B10-410-41E.coli KλC λB λK λ噬菌体感染率E.coli 菌株细菌的限制—修饰系统①1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是在λPhage的DNA上。
分子克隆技术常用的工具酶
已分离到与许多Ⅱ类限制酶相对应的甲基化酶。其命名是在 对应II类限制酶名称前加一个M表示。
如M．EcoR I是能使EcoR I识别序列中(GAATTC)3’-端的A甲
基化(GAm6ATTC)的酶
识别序列中某些碱基甲基化对II类限制酶的影响至 少有3种：
①敏感的，甲基化后不能再切割；
DNA用的乙醇。
2）甲基化
识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。 限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，会 阻碍限制酶的酶解活性。 受甲基化影响的酶在商品说明书中都会有标示。
所用符号为：m4C表示N4-甲基化胞嘧啶，m5C为C5-甲基胞嘧啶。
3）底物性状
随底物的不同而活性发生改变
仅2003年1-4月份就有150余种新的酶被登录入网，至2003年 04月19日, REBASE (The Restriction Enzyme Database) 收集的 编号已有7096种；其中Ⅱ类酶有3845种．
根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等， 一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大类。
②不敏感的．甲基化后仍可切割；
③依赖于甲基化的，只有甲基化后才能切割。
一、大肠杆菌DNA聚合酶 I
1 三种酶活性 1 ）DNA聚合活性
5' A T
||| |
3' T A C G dTTTP
5'
5’ 5’
引物
2）核酸外切酶活性
5’ A G C T T C A G G A T A
(-) 放线菌素D (-)
DNA合成
RNA
DNA(前病毒)
RNA
逆转录酶的应用:
应用于基因工程
第二章 分子克隆工具酶题目
第二章分子克隆工具酶一、选择题1.有关基因工程的叙述正确的是（）A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用B.重组质粒的形成在细胞内完成C.质粒都可作运载体D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料2.限制性内切酶EcoRⅠ在野生型的λ噬菌体DNA中有5个切点，Hind Ⅲ有7个切点。
调整这些酶切位点的数量，主要通过（）。
A.体内突变B.完全酶切后连接C.部分酶切D.先用甲基化酶修饰后再酶切二、填空题1.如果用限制性内切核酸酶切割双链DNA产生5‟突出的黏性末端，则可以用__________进行3‟末端标记。
如果用限制性内切核酸酶切割DNA产生的是3‟突出的黏性末端，可以用__________________ 进行3‟末端标记。
2.可用T4 DNA聚合酶进行平末端的DNA标记，因为这种酶具有____________和_______的活性。
三、判断题1. pBR327是在pBR322的基础上去掉了1089bp的片段，留下了ampR和tetR的完整片段。
pBR327比pBR322有更高的拷贝，每个细胞中含有30-45个拷贝。
同时pBR327具有接合能力，能直接转入其他细胞（）四、名词解释1. DNA聚合酶2. 限制性内切酶3. 甲基化酶4. T4-DNA连接酶5. 核酸酶6. Klenow酶7. T4 DNA聚合酶8. Taq DNA聚合酶9. 逆转录酶10. 同裂酶11. 核酶五、简答题1.限制性内切酶分为哪几大类，各有什么特点？2. DNA修饰酶主要有哪些，各有什么作用？3.简述Klenow聚合酶的用途。
4.比较E.coli DNA 连接酶和Taq DNA 连接酶的作用特点。
5.限制性内切酶I 的识别序列和切点是——GATCC G ↓，限制性内切酶II 的识别序列和切点是——GATC ↓。
在质粒上有酶I 的1个切点，在目的基因的两侧各有l 个酶II 的切点。
用上述两种酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA 。
分子克隆工具酶及其应用
命名
EcoR I
Escherichia coli RY13株
大肠杆菌 RY13株的第一种酶
属种 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
限制酶的特点
识别顺序和酶切位点 ---识别4~8个相连的核苷酸
限制酶的用途
• DNA重组 • 限制酶（物理）图谱绘制 • 突变分析（RFLP分析）
几个在分子克隆中应注意使用内切酶：
Dpn I:
CH3
GA TC CT AG
Sap I: GCTCTTCNNNN CGAGAAGNNNN
CH3
DNA 甲 基 化 酶
(DNA Methylase)
甲基化酶的种类与识别顺序
--切点大多数在识别顺序之内，也有例外
--限制酶切后产生两个末端: 5’-P和3’-OH
3’-端突起
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’
5’-端突起
EcoR I 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
5’-CTGCAOH 3’-GP
5’-GOH 3’-CTTAAP
识别序列* GG(A/T)CC(A/T)GG
TGATCA GATCGAT CC(A/T)GG GGTGATC
GATC GATCGCGA GGNCC(A/T)GG CC(A/T)GG AGGCCTGG
GATCGA TCTAGATC
甲基化酶 dcm dam dam dcm dam dam dam dcm dcm dcm
RE
RE
RE
CH3
用于cDNA的连接
RE 甲基 化酶
《基因工程》----考试重点总结
第一章基因工程概述第一节基因操作与基因工程基因操作（gene manipulation）：指对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。
基因工程（gene engineering）：通过工具酶，在体外将目的基因、基因片段或其它DNA元件进行切割，与适当的载体进行连接和重组，导入相应受体细胞，并使外源基因进行复制和表达，定向改造受体生物性状或获得表达产物。
基因操作与基因工程的关系：基因操作的核心是基因重组（gene recombination）技术，基因工程是基因操作、基因重组的核心内容和主要目的。
基因工程的遗传学效果：受体生物发生遗传信息或遗传性状的变化并能稳定遗传给下一代。
第二节基因工程是生物科学发展的必然产物一、基因是基因重组的物质基础遗传因子、基因：是遗传信息的基本单位。
从物质结构上看，基因是染色体组核酸分子。
基因（gene）是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段并具有遗传学功能，可以是连续的，也可以是不连续的，可以是DNA也可以是RNA，可以存在于染色体上，也可存在于染色体之外（如质粒、噬菌体等）。
基因工程的理论基础：⑴. 明确了遗传信息的携带者—基因的载体是DNA，明确了遗传的物质基础。
⑵. DNA分子的双螺旋结构和半保留复制模型得以阐明，解决了基因的自我复制和传递问题。
⑶. 中心法则、操纵子学说的提出以及遗传密码子的破译，解决了遗传信息的流向和表达问题。
(4). 遗传物质基础和中心法则的通用性决定了基因工程原理和技术在生物界普遍适用，尤其是可以实现跨越任何物种界限的遗传成分转移。
自此，从理论上讲，基因工程已有可能成为现实基因工程的技术基础：⑴. DNA体外切割和连接技术（限制性内切核酸酶和DNA连接酶的发现与应用，标志着DNA重组时代的开始）。
⑵. 克隆载体的发展与应用。
⑶. 大肠杆菌转化体系的建立。
⑷. 琼脂糖电泳技术的应用。
⑸. DNA测序技术的应用。
⑹. 核酸杂交技术的应用。
分子克隆常用工具酶
离纯化的依赖DNA的DNA聚合酶，最适温度75℃-80℃ 需要Mg2+(10 mmol／L)，在低浓度Mn2+(2 mmol/L)中有 低活性，Ca2+使其完全失活，一价阳离子高至0.1 moI ／L对活性无影响，而最适浓度NaCl为40 mmol/L，KCl 为60 mmol/L 最适pH7.8(Tris-HCl)，与大肠杆菌DNA聚合酶相比，其 最大特性是耐高温和无核酸酶活性
第二章 分子克隆常用工具酶
Tel: 87286939 Office: 园林楼620
DNA 的基本结构
Structure and features
• 每一单链具有 5’-3’极性
• 两条单链间以氢键连接 • 两条单链，极性相反，反向平行 • 以中心为轴，向右盘旋
植物基因工程
植物基因工程
Replication
2)平末端DNA片段的连接
a. 直接用T4 DNA连接酶连接：效率不高，较少采用。 b. 同聚物加尾连接平末端DNA片段：先用末端核苷酸转
移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA 连接酶进行连接 c. 用衔接物连接平末端DNA分子：目的是在平末端分子 上构建限制性核酸内切酶酶切位点，经酶切后产生 特异的粘性末端，从而与具有互补末端的DNA连接
以RNA分子为模板合成互补的cDNA链
将同聚物尾巴加到线性双链 或单链DNA分子的3'-OH末端或DNA的3'-末 端标记dNTP 降解单链DNA或RNA，产生带5'磷酸的单核苷酸或寡聚核苷酸，同时也 可切割双链核酸分子的单链 能在高温（72℃）下的单链DNA为模板，从5'→3'方向合成新生的互补 链
第二章基因工程中常用的工具酶
第二章 基因工程中常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA 分子的特异切割分子的特异切割DNA 甲基化酶—用于DNA 分子的甲基化分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA 和RNA 的连接的连接核酸聚合酶—用于DNA 和RNA 的合成的合成核酸酶—用于DNA 和RNA 的非特异性切割的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA 和RNA 的末端修饰的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
§2-1 核酸内切限制酶定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。
双链结构的核酸内切酶。
到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。
种以上不同的核酸内切限制酶。
核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）一 、限制修饰系统的种类（图）限制修饰系统的种类（图）二、 限制性内切酶的定义、命名1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II 型限制酶。
型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
例如：Hin d Ⅲ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae ，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
表示分离到的第三个限制酶。
Eco RI RI——Escherichia coli RI RI Hin d Ⅲ—Haemophilus influensae d ⅢSac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA 分子中的特定序列，但它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少1000bp 的地方可以随机地切割DNA 分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。
基因工程原理作业及答案
基因工程原理作业及答案第一章绪论1、请谈谈它的基本步骤？①源DNA 片段与载体连接论和技术两个方面谈谈础？稳定地繁殖。
理论基础：①在40因的分子载体是DNA 传的物质基础问题；②在50递的问题；③在50技术基础：①60年代-70接酶解决了对DNA ④60移杂交技术对DNA 3、基因克隆、基因操作、基因重组、基因工程的概念及其相互联系。
基因克隆（Genecloning）：是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节。
基因工程：是通过基因操作，将目的基因或DNA 片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。
基因操作：对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。
基因重组：不同来源DNA 分子通过共价连接（磷酸二酯键）而组合成新的DNA 分子的过程。
2、哪些酶可用于DNA 片段的末端标记？Klenow DNA 聚合酶和T4或T7DNA 聚合酶在对DNA 片段进行末端补平反应或末端的置换反应时可引入标记的核苷酸。
3、DNA 聚合酶有哪些类型，各有什么活性？① E.coliDNApolI：5’-3’DNA 聚合酶活性；5’-3’DNA 外切酶活性；3’-5’DNA 外切酶活性。
心相印图文工作室整理luqiu910② E.coliDNApolI大片段（Klenow酶）：5′→3′DNA聚合酶活性；3′→5′DNA外切酶活性；5’-3’DNA外切酶活性。
③T4噬菌体DNApol：5′→3′DNA聚合酶活性（与Ｋlenow酶相似）；3′→5′外切酶活性（Ｋlenow酶×200）：在无dNTP时只有该活性。
（常用于填平dsDNA的3′缩进末端及水解dsDNA的3′突出末端。
）④T7噬菌体DNApol酶活性;1000）。
第2章 分子克隆工具酶
（2）同尾末端的连接。
不同的同尾酶切割 DNA 产生的末端再相互连 接时，可产生新的酶切位点，同时原来的酶切 位点却消失。 例如 BamHⅠ（G↓AATCC）+ BclⅠ （T↓GATCA）→ AlwⅠ（GGATC 4/5），又如 XbaⅠ（T↓CTAGA）+AvrⅡ，或 NheⅠ 或 SpeⅠ 或 StyⅠ（CCTAGG）→ BfaⅠ（C↓TAG） 也产生了新的酶切位点
2. 反应温度
大多数为 37℃ ，一部分为 50-65℃ ，少数 2530℃ 高温作用酶在 37℃ 下的活性会下降，多数仅 为最适条件下的 10-50%
3. 反应时间
反应时间通常为 1 小时或更多，许多酶延长反 应时间可减少酶的用量 EcoRⅠ 若反应 16 小时，所需酶量为正常酶切 时间的 1/8 HindⅢ为1/8；KpnⅠ为1/4；BamHⅠ为1/2
属名 种名 株名
嗜血流感杆菌d株
Haemophilus influenzae d H i n d III
H i n d III
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
Escherichia
Coli
Ry13
EcoR I
属名 种名 株系 编号
若种名头2个字母相同 则其中一个可用种名的第一和第三个字母。
6. 归位内切酶——I-prefix 和 pI-prefix 系列酶
有些线粒体、叶绿体、核 DNA 、T 偶数噬菌 体含有一些编码内切酶的内含子，有些 intein （protein splicing element） 也有内切酶的活性， 这两类内切核酸酶称为 I-prefix 和 pI-prefix 系 列内切酶，它们识别的序列很长。 I-prefix 是由在 RNA 水平上剪切和编码的
分子克隆工具酶(1)
1
体外重组DNA技术所 需的基本条件？
A. 用于核酸操作的工具酶 B .用于基因克隆的载体 C. 用于基因转移的受体菌或细胞
用于核酸操作的工具酶有哪些？
精品医学ppt
2
第二章 分子克隆工具酶 Enzymes Used in Molecular
Cloning
精品医学ppt
3
在基因工程的实际操作中，工具酶 的使用是一项基本技术。
限制酶是一类能够识别双链DNA分子中 的某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA双链结构的核酸水解酶。
限制酶存在于细菌中，也存在于一些病 毒中，真核生物中没有限制酶。
精品医学ppt
17
一、限制酶的命名与分类
1、命名
1973年H.O. Smith和D. Nathams首次提出命名原则， 1980年Roberts在此基础上进行了系统分类
主要特性
Ⅱ型
Ⅰ型
Ⅲ型
酶分子 内切酶与甲基化酶不在 三亚基双功能酶 二亚基双功能酶
一起
识别位点 4-6bp，多为回文序
二分非对称
5-7bp非对称
列
切割位点 识别序列内或附近特异 无特异性，距识别序 距识别序列下游24-
切割
列1kb外
26bp处
在体外对DNA进行分离纯化、连接 重组或者修饰合成等，都会涉及一 系列酶促反应。
用于基因工程的工具酶种类繁多， 根据其功能可粗略分为限制酶、连 接酶、聚合酶和修饰酶4类。
精品医学ppt
4
基因工程的操作，是在分子水平上 的操作，是依赖一些酶 (如限制性 核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶 等)作为工具对基因进行人工切割， 拼接和扩增等操作。所以把这些酶
精品医学ppt
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2. 限制酶的发现
60年代，限制内切酶和限制酶的概念
1968年 首次从E.coli K中分离限制性内切酶 需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等 有特定的识别位点 但没有特定的切割位点 切割位点远离识别位点1000bp以上
1970年 美国约翰· 霍布金斯大学 H.Smith 偶然发现
流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae） 能迅速降解外源的噬菌体DNA 细胞提取液可降解E.coli DNA
CC↓TCAGC GGAGT↑CG Bbvc I
3、Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割方式 切点大多数在识别顺序之内 限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ
三、限制酶产生的末端种类 1.粘性末端
１）３’-端突起， ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
2. 平末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCC 3’-GGG GGG-3’ CCC-5’
E.coli K
E.coli B
E.coli C
K B C
E.coli K
E.coli B
E.coli C
K B C
1 10-4
-4 10
10-4 1
-4 10
1 1 1
说明K和B菌株中存在一种限制系统
可排除外来的DNA
10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果
甲基化：A N6甲基-腺膘呤 C 5’甲基-胞嘧啶
III类 识别位点严格专一（不是回文序列）：
切点不专一，往往不在识别位点内部。
NEB；Invitrogen公司；promega 普洛麦格； TakaRa.
பைடு நூலகம்
二、限制酶的识别序列
1、限制酶识别序列长度4，5，6个碱基对。
4 碱基酶识别位点在DNA分子中的频率
6 碱基酶 稀有切割限制酶 2、识别特定碱基顺序： 2、1 回文对称序列（ palindrome，从两个方 向阅读其序列相同的序 列）。
EcoRI
3. 限制酶的命名
• • •
宿主 属名第一字母、种名头两个字母
菌株或型号 序号 罗马字 EcoRI
HindII
例如：Hin d Ⅲ
Haemophilus influenzae（流感嗜血杆菌），
ｄ：表示菌系为ｄ型血清型； Ⅲ：表示分离到的第三个限制酶。 Eco RI—Escherichia coli RI EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上 Hin dⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ Sac I(II)—Streptomyces achromogenes I (Ⅱ)
在对称轴上同时切割DNA的两条链 HaeIII GG↓CC EcoRV GAT↓ATC XmnI GAANN↓NNTTC
3. 非对称突出端
① 来自非对称识别序列 CCTCAGC GGAGTCG BbvCI
② 简并序列
AccI GTATAC GTAGAC GTCTAC GTCGAC GT/MKAC
第一节 限制性内切酶
Restriction endonuclease
一、限制与修饰 Restriction and modification
50年代初，发现 host controlled specificity 噬菌体具有代表性和普遍性 其在不同宿主中的转染频率，在感染某一宿主 后，再去感染其它宿主时受到限制的现象。
③ 间隔序列
DraIII CACNNNGTG
EarI
CTC T TC (1/4) GAGAAG
4. 同裂酶 1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多 种限制酶 2. 特点：1）识别相同顺序 2）切割位点的异同
KpnI SstI GGTAC C CCGC GG Asp718 G GTACC SacI CCGC GG
4、限制性内切酶的分类：
第Ⅰ类酶（切割部位无特异性）：
如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较 大(约300000)，作用时需ATP、Mg++等辅助因子
第Ⅱ类酶（切割部位有特异性）：
如EcoR I(大肠杆菌)、Hind Ⅲ(嗜血杆菌)，分子量较小(约 20000-100000)，作用时需Mg++存在
第二章 分子克隆工具酶
切割位点可为获得DNA的物理图的 特殊的标记
利用限制性内切酶切割产生特殊 DNA片段的能力使得纯化那些DNA 片段成为可能 获得的限制性DNA片段可作为DNA 操作中的基本介质
任何物种都有 排除异物保护自身的防御机制
免疫系统 细菌的限制与修饰系统
限制性内切酶 修饰酶
R=A or G M=A or C S=C or G
Y=C or T K=G or T W=A or T
H=A or C or T
V=A or C or G
B=C or G or T
D=A or G or T
N=A or C or G or T
EcoRI
5’-G A A T T C-3’ 3’-C T T A A G-5’
① 同序同切 这些酶识别序列和切割位置都相同 HindII HincII GTY/RAC
HpaII
MobI
HapII
Sau3AI
C/CGG
/GATC
② 同序异切
识别的序列是相同的，但它们的切割位点不同
KpnI Acc65I
GGTAC/C G/GTACC
Asp718I G/GTACC
AatII
BsaHI
但不能降解自身DNA
即HindII酶
5’ ...G T Py Pu A C... 3’ 3’…C A Pu Py T G... 5’
GTCGAC G T TAA C G T C AA C GTTGAC
Y R
Py表示嘧啶，Pu表示嘌呤
5’ ...G A A T T C... 3’ 3’…C T T A A G... 5’
④ 其它
SalI AccI HincII G/TCGAC GT/MKAC GTY/RAC
GACGT/C
GR/CGYC
③ “同功多位” EcoRI ApoI HpaI HincII G/AATTC R/AATTY GTT/AAC GTY/RAC
许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。如 EcoRⅠ 识别和切割位点为 G↓AATTC ， ApoⅠ 识别和切割位 点为 R↓AATTY ，后者可识别前者的序列。