分子克隆工具酶及其应PPT课件

CCGGN’N’N’N’N’CCGG
Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突
起
２2021）/3/7 富含ＧＣ
7
３）对称性—双对称
EcoRI 5’-G A A T T C-3’
3’-C T T A A G-5’
４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外
５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是
５’-Ｐ和３’-ＯＨ
2. 末端种类
１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸
Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA
G-3’
3’-GACGTC-5’ 3’-G
ACGTC-5’
２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
EcoRI 5’-GAATTC-3’ 2021/3/7 3’-CTTAAG-5’
化、检测等。
2021/3/7
2
第一节
限制性内切核酸酶
2021/3/7
3
一 . 限制性内切酶的发现
1. 细菌限制修饰系统的发现
Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I 型限制酶。
2. 限制酶HindII的发现
H．O．Smith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血 杆菌（H. influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。
BamHI + BglII A/G GATCT/C
不同末端的连接特性: 除第4种末端不能进行不同DNA分
子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余4种
末端2可021/以3/7 相互连接。
10
五. 异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）
1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多
种限制 酶
5’-GOH 3’-百度文库TTAAP
PAATHTOGC--538’’
３） 平齐末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’
5’-CCC
3’-GGGCCC-5’
3’-GGG
４）非互补的粘性末端
GGG-3’ CCC-5’
ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI
Fok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’
5’-GGATG(N)9
2. 特点：1）识别相同顺序
2）切割位点的异同
KpnI GGTAC C
Asp718 G GTACC
SstI CCGC GG
SacI CCGC GG
六.限制酶的星反应（star activity）
七. 1. 特点: 限制酶识别序列特异性降低
2. 发生星反应的限制酶和条件（见下页）
2302.1/3星/7 反应的利用和避免
11
表1 具有星反应的限制性内切酶与条件
限制酶
诱发星活性的条件a
识别序列
AvaI
1, 2, 4
BamHI
1 - 5, 8
G GATCN, G PuATCC
BstI
2, 4
BsuI
2, 4, 6
EcoRI
1, 2, 4 - 6
N AATTN
HaeⅢ
2, 4
HhaI
2, 4, 7
HindⅢ
6
HpaI
1, 2, 4
个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、
SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。
2. II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ.
coli中这两种基因位于质粒上。
3. III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基
因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。
上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具
PstI
1, 2, 4, 7
PvuⅡ
2, 4
SalI
1, 2, 4, 7
ScaI
4 - 6, 8
SstⅡ
2, 4
XbaI
2, 4, 7
a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μg)；
5：2M021n/+3+/7代替Mg++；6:pH8.5; 7:二甲基亚砜(8%); 8:无NaCl。
血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制
酶。
EcoRI—Escherichia coli RI
Hi2n02d1/3Ⅲ/7 —Haemophilus influensae d Ⅲ
6
四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点
１）识别４-8个相连的核苷酸
MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC
3’-CCTAC(Ｎ)13-5’
3’-CCTAC(N)13
ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI
AvaI 5’-CPyCGPuG-3’
CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG
2021/3/7
9
５）相容性末端
如：BamHI
G GATCC
BglII
A GATCT
MboI, Sau3AI N GATCN
3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制
D. Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制
酶谱。
2021/3/7
4
二 . 限制修饰系统的种类
1. I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS
（host specificity for DNA restriction
modification and specificity）位于染色体上，三
上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组
分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识别机率
只有1/16。
BamHI + MboI A/C/G/T GATCT/C/G/A BamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不 能为两种酶所识别和酶切。
分子克隆工具酶及其应用
2021/3/7
1
分子克隆工具酶及其应用
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯
有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于
基20因21/3/工7 程中。
5
三. 限制性内切酶的定义、命名
1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；
狭义指II型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、
菌系编号、分离顺序。
例如：HindⅢ 前三个字母来自于菌种
名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型