第三章 分子克隆工具酶
第三章 分子克隆工具酶
常用的工具酶
主 要 功 能
(续上表格)
工具 酶 名 称
碱性磷酸酶 去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基团 BAP or CIP 核酸外切酶III 降解DNA3’－OH末端的核苷酸残基 exonuclease III 降解酶S1 降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或 nuclease S1 寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链 核酸酶Bal 31 降解双链DNA,RNA的5’及3’末端，高专一性单链核苷酸 nuclease Bal31 Taq DNA 聚合酶 能在高温（72℃）下的单链DNA为模板， Taq DNA polymerase 从5’→3’方向合成新生的互补链 核糖核酸酶 专一性降解RNA RNase 脱氧核糖核酸酶 内切核酸酶，水解单链或双链DNA DNase
3 分子克隆工具酶（4学时）
概述 限制性内切核酸酶 甲基化酶（Methylase） DNA聚合酶（DNA polymerase Ⅰ） 其他分子克隆工具酶
工具酶的定义
在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于 DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转 录等有关的各种酶系统称为工具酶。 基因工程的操作，是在分子水平上的操作， 是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶， DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割， 拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为 “工具酶”。
2.1.5 同尾酶
许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的， 且是对称的，即它们可产生相同的黏性突出末端。这 些酶统称为同尾酶（isocaudarner）。这些酶切割 DNA得到的产物可进行互补连接。 EcoRⅠ G↓AATTC SpeⅠ A↓CTAGT T↓CTAGA BamHⅠ G↓GATCC
常用分子克隆工具酶简介
精品医学ppt
43
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
四种不同补平反应
BamHI
5’-G
GATCC-3’
3’-CCTAG
G-5’
dNTP
dGTP dGTP/dATP
5’-GGATC 5’-GG 3’-CCTAG 3’-CCTAG
5’-GGA 3’-CCTAG
dGTP/dATP/dTTP
klenow片段 T4 phage DNA ploymerase T7 phage DNA ploymerase 耐热DNA聚合酶(Taq 酶) 依赖于RNA的DNA聚合酶: 反转录酶(reverse transcriptase)
精品医学ppt
12
1.1 Ecoli DNA polymerase I 分类：
的 RNA区域
精品医学ppt
41
1.2 RNase H
特异地降解DNA:RNA杂合链中的RNA 部分，产生不同长度的具有3’OH和5‘P端的 寡核苷酸，它不能降解单链或双链的DNA （或RNA).
精品医学ppt
42
切平反应和补平反应
5’—AAGCTT—3’ HindIII 5’—A AGCTT—3’
λ外切酶、Bal31连用 2) DNA定序分析 3) S1作图法 4) 基因结构分析 5) tRNA结构分析
精品医学ppt
34
5'
S1核酸酶活性
5' 5'
ExoIII
5' S1
S1
Poly(A) S1
Poly(A)
精品医学ppt
S1 5'
S1
S1
5'
35
第三章 基因工程工具酶
（3）牛血清蛋白 (BSA)
BSA 是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化学品导致 是酶稳定剂，可避免热、表面张力、 的酶变性。过量 BSA 会引起电泳拖尾。 的酶变性。 会引起电泳拖尾。
Ⅱ类 R-M 系统由限制性核酸内切酶和甲基化酶两 种酶分子组成。大多数限制酶都已分离出相应的甲 基化酶。 甲基化酶也称修饰酶 (modification enzyme)，用 来修饰限制酶的识别序列，在该序列位点的胞嘧啶 （C）5- 氨基上加一个甲基，使得该序列可以被限 制性内切酶识别而免于切割。
甲基化酶分两类： 甲基化酶分两类：
第三章 基因工程工具酶
基因工程工具酶
基因工程的操作，是在分子水平上的操作， 基因工程的操作，是在分子水平上的操作， 是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶， 是依赖一些酶 如限制性核酸内切酶，连接酶， 如限制性核酸内切酶 DN聚合酶等 作为工具对基因进行人工切割， 聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割 聚合酶等 作为工具对基因进行人工切割， 拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“ 拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工 具酶” 工具酶是对野生菌株（ 具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如 酵母）进行改造、优化、 酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产 品。
DNA连接酶（ligase） 连接酶（ 连接酶 ）
能够催化 DNA 中相邻的 3’-羟基和 5’-磷酸 基末端之间形成3′，5′-磷酸二酯键; T4DNA 连接酶 可连接带匹配粘性末端的 DNA 分子，也可 使平端的双链 DNA 分子相互连接。 大肠杆菌 DNA 连接酶 只能连接带匹配粘末端的 DNA 分子.
分子克隆中常用的四种工具酶及其应用
分子克隆中常用的四种工具酶及其应用分子克隆是利用分子生物学技术对目标DNA进行扩增及克隆的过程。
在分子克隆的过程中，常常需要使用许多酶类工具来完成不同的任务。
以下介绍了分子克隆过程中最常用的四种酶类工具及其应用。
1. 限制性内切酶限制性内切酶（Restriction endonuclease）又称限制酶，是一类可特异性切割DNA特定序列的酶。
它可以在DNA的特定位置切割成不同的碎片，而不会破坏DNA的结构。
因此，限制酶被广泛应用于DNA的纯化、分析和重组等领域。
在分子克隆中，限制酶通常用于切割DNA的特定序列，以获得所需的DNA片段。
同时，也可以用于制备载体DNA的端部修饰，方便插入外来DNA片段。
此外，限制酶还可以用于分析DNA序列的变异和同源性等特征。
2. DNA连接酶DNA连接酶（DNA ligase）是一种催化DNA连结软帽酶，用于连接具有互补末端的DNA片段。
连接酶广泛应用于DNA重组、引物连接、克隆和测序等领域。
在分子克隆中，DNA连接酶通常使用于将外来DNA片段连接到载体 DNA 上。
此外，为了克隆具有完整DNA序列的目标基因，连接酶还可以用于连接PCR扩增出来的目标DNA序列。
3. PCR酶聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）是一种快速、有效、敏感的DNA扩增技术。
在PCR过程中，通过PCR酶催化下的DNA扩增反应，能够在很短的时间内扩增目标DNA的数量。
在分子克隆中，PCR酶通常用于扩增目标DNA片段。
利用PCR技术，可以选择性增加目标DNA的数量并在容易处理的基本DNA片段之间产生特定的限制酶切断部位，为后续分子克隆实验提供方便。
4. 接头酶接头酶（T4 DNA ligase）是一种针对DNA单链断裂或缺口进行修复和连接的酶。
在分子克隆中，接头酶主要用于将外来DNA片段和载体DNA粘到一起。
在分子克隆的过程中，外来DNA片段和载体DNA之间通常存在一些不兼容的末端或过于短的重叠部分。
分子克隆工具酶及其应用
表2
限制酶 AvaⅡ BclⅠ ClaⅠ EcoRⅡ HphⅠ MboⅠ NruⅠ Sau96Ⅰ SauFⅠ StuⅠ TagⅠ XbaⅠ
对甲基化敏感的限制性内切酶
甲基化酶 dcm dam dam dcm dam dam dam dcm dcm dcm dam dam
识别序列* GG(A/T)CC(A/T)GG TGATCA GATCGAT CC(A/T)GG GGTGATC GATC GATCGCGA GGNCC(A/T)GG CC(A/T)GG AGGCCTGG GATCGA TCTAGATC
第一节
限制性内切核酸酶
一
. 限制性内切酶的发现
Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I
1. 细菌限制修饰系统的发现
型限制酶。
2. 限制酶HindII的发现
H．O．Smith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血
杆菌（H. influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。
识别序列a
AGmCT
GGATmCC ATCGmAT GmATC c CCA/TGG c GAmATTC GCNGC GGmCC GGmCC GmCGC CmCGG TmCACC mCCGG CTGCmAG TCGmA
a.标在碱基的左上角的m表示该碱基被甲基化; b.所列出的限制酶均已商品化; c.参见表2; d.M.HI分离自噬菌体污染的细菌细胞，它可识别两个序列，GCNGC•的甲基化位点尚未确定。
分子克隆工具酶及其应用
分子克隆工具酶及其应用
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯 化、检测等。
酶分子克隆过程
酶分子克隆过程嘿，你想知道酶分子克隆是怎么一回事吗？这可真是个超级有趣又超级神奇的过程呢！我有个朋友叫小李，他就在做这方面的研究。
我跟着他可算是对酶分子克隆有了些了解。
这就像一场微观世界里的奇妙冒险。
要开始酶分子克隆啊，首先得找到我们的“主角”——酶的基因。
这就好比你要做一道绝世好菜，得先找到那些独特的食材一样。
我们得在生物的基因库里到处寻觅。
有时候这就像大海捞针，真的是很头疼呢！但是科学家们可不会轻易放弃，就像探险家在丛林里寻找宝藏一样，充满着热情和执着。
找到基因之后呢？我们得把这个基因从它原来的“家”，也就是染色体上切下来。
这时候就需要用到一种特殊的“分子剪刀”——限制性内切酶。
哇，这名字听起来就很厉害对吧？这就像是一个超级精准的小工匠，只在特定的位置把基因切下来。
我当时就问小李：“这东西怎么能这么精准呢？”小李笑着说：“这就是科学的奇妙之处啦，它就像一把有着特殊密码锁的剪刀，只有遇到对应的密码才能剪断。
”切下来的基因可不能就这么放着呀，得给它找个新的“家”。
这个新的“家”就是载体。
载体就像是一艘小飞船，可以带着我们的基因去新的地方旅行，然后在那里安家落户。
常见的载体有质粒，这质粒啊，就像一个小小的环状的“移动城堡”。
把基因和载体连接起来可不容易呢，这就需要另一种神奇的东西——DNA连接酶。
这DNA连接酶就像是一个超级胶水匠，能把基因和载体完美地粘在一起。
我当时还打趣说：“这不会粘歪了吧？”小李白了我一眼说：“这可不是你手工课上的胶水，人家可是非常精准的。
”然后呢，我们就把这个带着新基因的载体送进宿主细胞。
宿主细胞就像是一个小小的工厂，或者说像一个热闹的小社区。
当这个载体进入宿主细胞后，就会在里面开始复制、表达。
这个过程有点像一颗种子种进了土里，然后开始生根发芽。
宿主细胞里的各种“小助手”，比如各种酶和蛋白质因子等，就会围绕着这个新的基因忙起来。
有的负责转录，就像一个小秘书把基因的信息抄下来；有的负责翻译，就像一个翻译官把抄下来的信息变成蛋白质。
《分子克隆中所用酶》PPT课件
识别序列在DNA分子中出现的频率 :
如果四种碱基按完全随机分布的原则，则某种限制性内切
III型：有专一的识别顺序。它在识别顺序下游约25bp处 几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则
是任意的。
II型：识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内或附近的固 定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的
核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA 片段，并能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合 DNA分子。
精品医学
2
工具酶
常用的工具酶：
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
DNA聚合酶Ⅰ 反转录酶
切割DNA 生成3′- 5′磷酸二酯键 探针标记、补平3′末端
cDNA合成
多聚核苷酸激酶 末端转移酶
5′磷酸化、探针标记 3′末端多聚尾
碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
精品医学
3
一把特殊的剪刀 _______限制性内切酶
精品医学
15
E coR I的识别顺序为：
5’……GAA | TTC……3’ 3’……CTT | AAG……5’
垂直虚线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC 或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。
精品医学
16
recognition sequence
5＇ GTT AAC 3＇ 3＇ CAA↓TTG 5＇
5＇ G↓AATTC 3＇ 3＇ CTTAA↑G 5＇
5＇ A↓AGCTT 3＇ 3＇ TTCGA↑A 5＇
5＇ G↓GATCC 3＇ 3＇ CCTAG↑G 5＇
5＇ C↓TGCAG 3＇ 3＇ GACGT↑C 5＇
enzymes Hpa Ⅰ blunt end EcoRⅠ 5’protruding end HindⅢ 5’protruding end BamHⅠ 5’protruding end PstⅠ 3’protruding end
分子克隆工具酶
同尾酶(Isocaudamers）
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如 BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等。
BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
Bgl Ⅱ 5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’
Bcl I 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’
完全同裂酶 识别位点和切点完全相同。 如Hind Ⅲ 和Hsu I。
Hind Ⅲ Hsu I
5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
不完全同裂酶
识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。
Xma I Sma I
5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
限制（Restriction）
限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA 切成小片断。
修饰（Modification）
细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修 饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别 切割。
① Dam甲基化酶 GATC腺嘌呤N6位置引入甲基。
② Dcm甲基化酶
CCAGG或CCTGG序列在第二个 C上C5位置上引入甲基。
ATP、Mg2+、 SAM GAGCC CAGCAG
距识别序列下游 24-26bp处
I型限制性内切酶
I型酶属复合功能酶，兼具限制、修饰两 种功能。核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和 DNA解旋酶4种活性。
显著特点：识别位点与切割位点不一致。 酶分子首先由M. Meselson和R. Yuan在 1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。 代表：EcoB和 EcoK。
分子克隆技术常用的工具酶
已分离到与许多Ⅱ类限制酶相对应的甲基化酶。其命名是在 对应II类限制酶名称前加一个M表示。
如M．EcoR I是能使EcoR I识别序列中(GAATTC)3’-端的A甲
基化(GAm6ATTC)的酶
识别序列中某些碱基甲基化对II类限制酶的影响至 少有3种：
①敏感的，甲基化后不能再切割；
DNA用的乙醇。
2）甲基化
识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。 限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，会 阻碍限制酶的酶解活性。 受甲基化影响的酶在商品说明书中都会有标示。
所用符号为：m4C表示N4-甲基化胞嘧啶，m5C为C5-甲基胞嘧啶。
3）底物性状
随底物的不同而活性发生改变
仅2003年1-4月份就有150余种新的酶被登录入网，至2003年 04月19日, REBASE (The Restriction Enzyme Database) 收集的 编号已有7096种；其中Ⅱ类酶有3845种．
根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等， 一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大类。
②不敏感的．甲基化后仍可切割；
③依赖于甲基化的，只有甲基化后才能切割。
一、大肠杆菌DNA聚合酶 I
1 三种酶活性 1 ）DNA聚合活性
5' A T
||| |
3' T A C G dTTTP
5'
5’ 5’
引物
2）核酸外切酶活性
5’ A G C T T C A G G A T A
(-) 放线菌素D (-)
DNA合成
RNA
DNA(前病毒)
RNA
逆转录酶的应用:
应用于基因工程
分子克隆工具酶—限制和修饰PPT教案
CTTAG CTGAG CTCAG
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5 限制酶产生的末端
切割位点：
DNA在限制酶的作用下，使多聚
核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置。
一般用“/”或“ ”表示。
具体位置：在识别序列内部或两
侧。
例：
G GATCC
AT CGAT
GATC
CATC
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黏性末端(sticky end)：DNA分子 在限制酶的作用下形成的具有互补 碱基的单链延伸形成的末端结构， 它们能通过互补碱基间的配对而重 新连接起来。
分子克隆工具酶—限制和修饰
会计学
1
进行基因工程操作，首先要获得 需要重组和能够重组的DNA片段。 （如何获得？）
用相应的酶进行切割，就可以获 得含有完整基因片段、复制起始位 点、转录启动子或转录区等具有特 定功能的DNA片段。
那么，如何将需要的DNA片段切 割和连接呢？
第1页/共36页
1 限制酶的发现
第13页/共36页
偶数核苷酸组成的识别序列， 以中线为轴，两侧核苷酸互补对 称。
E. coR I GAATTC
CTTAAG 奇数核苷酸组成的识别序列， 以N
N 为轴，两侧核苷酸互补对称。
GTNAC
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根据识别序列的规律性，找可能的识 别序列。
偶数序列，先找GC、CG、AT、TA， 然后找其两侧的核苷酸。
λ（B）
λ（C）
K
1
10-4
10-4
B
10-4
1
10-4
C
1
1
1
第3页/共36页
说明： K菌株和B菌株中有一种限
分子克隆工具酶
5、同尾酶(isocaudarner) 不同的 限制酶切割DNA产生的末端是相同的， 且是对称的，即它们可产生相同的黏性末端。
BamH I : G ↓ GATCC Bgl II : A ↓ GATCT
6、归位内切酶(homing endonuclease) 内含子编码的内切酶。
四、DNA末端长度对限制酶切割的影响
H in d I Haemophilus influenzae
REBASE(The Restriction Enzyme Database) New England Biolabs
3.限制与修饰系统的种类
酶分子 识别位点 切割位点
II（93%） 内切酶与甲基化酶 分子不在一起
3、非对称突出末端
许多限制酶切割DNA产生非对称突出端。当识别 序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端
是 不 同 的 ， 如 BbvCⅠ ， 它 的 识 别 切 割 位 点
CC↓TCAGC GGAGT↑CG
有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几
种是非对称的。如AccⅠ，它的识别切割位点如
下，GT↓AT/CGAC CATA/GC↑TG
4-6位点
限制反应与 分开的反应 甲基化反应
限制反应是 否 否需要ATP
I（1%） 三亚基双功 能酶 二分非对称
无特异性， 在识别位点 外1000bp 互斥
是
III（1%） 二亚基双功 能酶
5-7bp非对 称
在识别位点 下游2426bp 同时竞争
是
5‘内切酶 3‘内切酶
AAC(N)6GTGC和GCAC(N)6GTT序列中A的N6 位置。
4、Sss I甲基化酶，来源于原核螺原体，可使CG
序列中的C在C5位置上甲基化。
第三章分子克隆工具酶-13级
用来保护宿主不受外来DNA的感染，可降解外来的 DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。
限制酶的种类 Ⅰ型酶 (种类很少，只占1%)
单链多肽，其RNaseH活性弱，有利于合成较长的 cDNA 用途：以mRNA为模板合成cDNA ；5′突出DNA的补 平和标记；DNA测序等。
末端转移酶(terminal transferase)
来源于小牛胸腺，是一种不依赖于模板的DNA聚 合酶。
在Co2+/Mg2+存在下，末端转移酶催化dNTP加于 DNA分子的3'-OH端。 作用
三亚基双功能酶，分子量较大，反应需Mg2+、ATP 有特异识别位点但没有特异切割位点
Ⅱ型酶 (占90%以上)
分子量较小，反应只需Mg2+； 识别位点是一个回文对称结构，切割位点在回文对 称结构上； 多数Ⅱ型酶切割DNA后形成粘性末端
Ⅲ型酶 (种类更少，不到1%)
二亚基双功能酶，能识别特定顺序，在该顺序的3’ 端24~26 bp处切开DNA，切割位点没有特异性。
限制酶降解外源 DNA，维护宿主遗 传稳定的保护机制
识别自身遗传 物质和外来遗 传物质
A→N6-MeA C→5'-MeC
限制酶的发现
美国约翰.霍布金斯大学的H.Smith于1970年偶然发现，流感 嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)能迅速降解外源的噬菌体 DNA，其细胞提取液可降解E.coli DNA，但不能降解自身 DNA，从而找到Hind II限制性内切酶。
分子克隆工具酶部分答案
分子克隆工具酶答案（选择和判断）题1关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当。
B. 这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶题目2Ⅱ型限制性内切核酸酶：( )D. 限制性识别非甲基化的核苷酸序列题目3Ⅲ型限制性内切核酸酶：( )E. 不同亚基的识别位点甲基化和限制活性相互排斥：MS亚基促使甲基化，R亚基促使限制题目4限制性片段长度多态性(RFLP)是：( )E. 物种中的两个个体限制性图谱间的差别题目5下面有关限制酶的叙述哪些是不正确的?( )E. 限制酶是外切酶而不是内切酶题目6因研究λ噬菌体的限制与修饰现象的本质而获得诺贝尔奖的科学家是：( )C. WArber题目7第一个被分离的Ⅱ类酶是：( )A. HindⅡ题目8双链DNA中一段自我互补的序列被称为回文序列，这种序列不具有下列特征：( )B. 可增强基因的表达题目9在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制那一项最好?( )B. 酶量酶量题目10在下列试剂中，那一种可以螯合Ca2＋离子?( )A. EGTA题目11在下列工具酶中，那一种可以被EGTA抑制活性?( )C. Bal 31核酸酶题目12限制性内切核酸酶可以特异性地识别：( )B. 双链DNA的特定碱基序列题目13限制性内切核酸酶的星号活性是指：( )B. 在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性。
题目14下面哪一种不是产生星号活性的主要原因?( )C. 酶切反应时酶浓度过低题目15关于回文序列，下列各项中，( )是不正确的B. 是高度重复序列题目16关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当D. 这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶题目17T4DNA连接酶是从T4噬菌体感染的E．coli中分离的，这种连接酶( ) B. 既能催化平末端连接又能催化黏性末端连接题目18DNA连接酶在体内的主要作用是在DNA复制、修复中封闭缺口，( )A. 将双链DNA分子中的5，磷酸基团同3，-OH末端重新形成磷酸二酯键题目19在长模板链的指导下引物延伸合成长的DNA互补链时应选用( )A. T7DNA聚合酶题目20末端转移酶是合成酶类，( )D. 在C0 2＋的存在下，可以在3’突出末端延长DNA链题目21在基因工程中，可用碱性磷酸酶( )B. 防止DNA的自身环化题目22从E．coli中分离的连接酶：( )C. 需要NAD作辅助因子题目23下列酶中，除( )外都具有磷酸酶的活性C. λ核酸外切酶题目24下列哪一种酶作用时需要引物? ( )D. 反转录酶题目25S1核酸酶的功能是( )B. 以上有两项是正确的题目26Klenow酶与DNA聚合酶相比，前者丧失了( )的活性C. 5’-3’外切酶题目27用Bal31核酸酶作系列缺失突变时，( )A. 需要Ca 2＋作辅助因子题目28在cDNA技术中，所形成的发夹环可用( )A. 用S1核酸酶切除题目29可以在切口部位起作用的酶是( )A. S1核酸酶题目30T4RNA连接酶：( )A.作用时不需要模板题目31限制性内切核酸酶在DNA中的识别／切割位点的二级／三级结构也影响酶切效率。
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识别序列不是对称的
AccBSⅠ CCG↓CTC BssSⅠ C↓TCGTG
GGC↑GAG
GAGCA↑C
识别多种序列
AccⅠ GT↓MKAC，M=A或C, K=G或T
识别的序列呈间断对称
AlwNⅠ CAGNNNC↓TG DdeⅠ C↓TNAG
GT↑CNNNGAC
GANT↑C
3．限制酶切割的位置
限制酶对DNA的切割位置大多数在内部，但也 有在外部的。在外部的，又有两端、两侧和单 侧之别。
2．限制酶识别序列的结构
限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在 DNA两条链相对称的位置。
特例：（见下页举例） 识别序列不是对称的 识别多种序列 识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意 碱基。
EcoRⅠ G↓AATTC HindⅢ A↓AGCTT
CTTAA↑G
TTCGA↑A
2.1.1 限制与修饰（Restriction and modification）
1.限制性内切酶的发现
1968年，Meselson从E.coli K株中分离出了第一个限制酶 Eco K，同年Linn和Aeber从 E.coli B株中分离到限制酶 Eco B。 1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限 制性酶HindⅡ，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核 酸酶。
DNA polymerase I 裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性与3’→5’及5’→3’外切酶活性
多核苷酸激酶
催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的
DNA polymerase kinease 5’－OH末端上
反转录酶
以RNA或DNA链为模板合成互补的cDNA链
reverse transcriptase
DNA末端转移酶
将rminal Deoxynuc 或单链DNA分子的3’－OH末端或DNA的3’－末端
leatidy transferase
表格)
(接下
常用的工具酶
工具 酶 名 称
主要功 能
(续上表格)
碱性磷酸酶
去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基团
BAP or CIP
Ⅱ
Ⅰ
Ⅲ
酶分子
内切酶与甲基化酶 三亚基双功能酶(R， 二亚基双功能酶
分子不在一起
M，S亚基)
识别位点
切割位点
限制反应与 甲基化反应 限制作用是 否需用 ATP
4-6bp, 大多数为回 文对称结构 在识别位点中或靠 近识别位点
分开的反应
No
非对称
无特异性，至少在识 别位点外 1000bp
互斥
Yes
5-7bp 非对称 在识别位点下游 24-26bp 同时竞争
Escherichia
Coli
Ry13
E c o RⅠ
属名 种类 株系 编号
2.限制与修饰系统的种类
根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和 是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少 可分为四类。
在已纯化分类的3000多种限制性内切酶 中，已发现了超过250种的特异识别序列。
表3-2 各种限制与修饰系统的比较
3 分子克隆工具酶（4学时）
概述 限制性内切核酸酶 甲基化酶（Methylase） DNA聚合酶（DNA polymerase Ⅰ） 其他分子克隆工具酶
工具酶的定义
在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于 DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转 录等有关的各种酶系统称为工具酶。
基因工程的操作，是在分子水平上的操作， 是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶， DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割， 拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为 “工具酶”。
核酸外切酶III
降解DNA3’－OH末端的核苷酸残基
exonuclease III
降解酶S1
降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或
nuclease S1
寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链
核酸酶Bal 31
降解双链DNA,RNA的5’及3’末端，高专一性单链核苷酸
nuclease Bal31
HindⅡ 限制性内切酶位点和切割位点如下：
5 '… GTPy ↓ PuAC … 3 ' 3 '… CAPu ↑ PyTG … 5 '
限制性内切酶的命名P63
条目 基本原则 首字母 第2字母 第3字母
第4字母
顺序号
要点 3-4个字母组成, 方式是:属名+种名+株名+序号 取属名的第1个字母, 且大写 取种名的第1个字母, 小写 ①取种名的第2个字母, 小写; ②若种名有词头, 且已 命名过内切酶, 则取词头后的第一字母代替 若有株名, 株名则作为第4字母, 是否大小写, 根据原 来的情况而定 若在同一菌株中分离了几个限制性内切核酸酶, 则按 先后顺序冠以I、II、III,.....等
常用的工具酶
工具酶 名称
主要功能
限制性核酸内切酶
在DNA分子内部的特异性的
restriction endonucleases 碱基序列内部进行切割
DNA连接酶 DNA ligase
将两条以上的线性DNA分子或片段 催化形成磷酸二酯键连接成一个整体
DNA聚合酶I
通过向3’端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链
Yes
2.1.2 限制酶识别的序列
1．限制酶识别序列的长度
限制酶识别序列的长度一般为4-8个碱基，最常见的为 6个碱基。
当识别序列为4个和6个碱基时，它们可识别的序列在 完全随机的情况下，平均每256个和4096个碱基中会出 现一个识别位点（44=256，46=4096）。
注意：识别位点存在的概率不同！
Taq DNA 聚合酶
能在高温（72℃）下的单链DNA为模板，
Taq DNA polymerase 从5’→3’方向合成新生的互补链
核糖核酸酶
专一性降解RNA
RNase
脱氧核糖核酸酶
内切核酸酶，水解单链或双链DNA
DNase
2.1 限制性内切酶 (restriction enzyme)
限制与修饰（Restriction and modification） 限制酶识别的序列 限制酶产生的末端 DNA末端长度对限制酶切割的影响 位点偏爱（Site preference） 酶切反应条件 星星活性（star activity） 单链 DNA 的切割 酶切位点的引入 影响酶活性的因素 酶切位点在基因组中分布的不均一性