第三章 分子克隆工具酶

2.1.1 限制与修饰（Restriction and modification）
1.限制性内切酶的发现
1968年，Meselson从E.coli K株中分离出了第一个限制酶 Eco K，同年Linn和Aeber从 E.coli B株中分离到限制酶 Eco B。 1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限 制性酶HindⅡ，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核 酸酶。
DNA polymerase I 裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性与3’→5’及5’→3’外切酶活性
多核苷酸激酶
催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的
DNA polymerase kinease 5’－OH末端上
反转录酶
以RNA或DNA链为模板合成互补的cDNA链
reverse transcriptase
Ⅱ
Ⅰ
Ⅲ
酶分子
内切酶与甲基化酶 三亚基双功能酶(R， 二亚基双功能酶
分子不在一起
M，S亚基)
识别位点
切割位点
限制反应与 甲基化反应 限制作用是 否需用 ATP
4-6bp, 大多数为回 文对称结构 在识别位点中或靠 近识别位点
分开的反应
No
非对称
无特异性，至少在识 别位点外 1000bp
互斥
Yes
5-7bp 非对称 在识别位点下游 24-26bp 同时竞争
Yes
2.1.2 限制酶识别的序列
1．限制酶识别序列的长度
限制酶识别序列的长度一般为4-8个碱基，最常见的为 6个碱基。
当识别序列为4个和6个碱基时，它们可识别的序列在 完全随机的情况下，平均每256个和4096个碱基中会出 现一个识别位点（44=256，46=4096）。
注意：识别位点存在的概率不同！
DNA末端转移酶
将寡聚物尾巴加到了线性双链
DNA terminal Deoxynuc 或单链DNA分子的3’－OH末端或DNA的3’－末端
leatidy transferase
表格)
(接下
常用的工具酶
工具 酶 名 称
主要功 能
(续上表格)
碱性磷酸酶
去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基团
BAP or CIP
HindⅡ 限制性内切酶位点和切割位点如下：
5 '… GTPy ↓ PuAC … 3 ' 3 '… CAPu ↑ PyTG … 5 '
限制性内切酶的命名P63
条目 基本原则 首字母 第2字母 第3字母
第4字母
顺序号
要点 3-4个字母组成, 方式是:属名+种名+株名+序号 取属名的第1个字母, 且大写 取种名的第1个字母, 小写 ①取种名的第2个字母, 小写; ②若种名有词头, 且已 命名过内切酶, 则取词头后的第一字母代替 若有株名, 株名则作为第4字母, 是否大小写, 根据原 来的情况而定 若在同一菌株中分离了几个限制性内切核酸酶, 则按 先后顺序冠以I、II、III,.....等
识别序列不是对称的
AccBSⅠ CCG↓CTC BssSⅠ C↓TCGTG
GGC↑GAG
GAGCA↑C
识别多种序列
AccⅠ GT↓MKAC，M=A或C, K=G或T
识别的序列呈间断对称
AlwNⅠ CAGNNNC↓TG DdeⅠ C↓TNAG
GT↑CNNNGAC
GANT↑C
3．限制酶切割的位置
限制酶对DNA的切割位置大多数在内部，但也 有在外部的。在外部的，又有两端、两侧和单 侧之别。
常用的工具酶
工具酶 名称
主要功能
限制性核酸内切酶
在DNA分子内部的特异性的
restriction endonucleases 碱基序列内部进行切割
DNA连接酶 DNA ligase
将两条以上的线性DNA分子或片段 催化形成磷酸二酯键连接成一个整体
Fra Baidu bibliotek
DNA聚合酶I
通过向3’端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链
Escherichia
Coli
Ry13
E c o RⅠ
属名 种类 株系 编号
2.限制与修饰系统的种类
根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和 是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少 可分为四类。
在已纯化分类的3000多种限制性内切酶 中，已发现了超过250种的特异识别序列。
表3-2 各种限制与修饰系统的比较
核酸外切酶III
降解DNA3’－OH末端的核苷酸残基
exonuclease III
降解酶S1
降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或
nuclease S1
寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链
核酸酶Bal 31
降解双链DNA,RNA的5’及3’末端，高专一性单链核苷酸
nuclease Bal31
3 分子克隆工具酶（4学时）
概述 限制性内切核酸酶 甲基化酶（Methylase） DNA聚合酶（DNA polymerase Ⅰ） 其他分子克隆工具酶
工具酶的定义
在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于 DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转 录等有关的各种酶系统称为工具酶。
基因工程的操作，是在分子水平上的操作， 是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶， DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割， 拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为 “工具酶”。
Taq DNA 聚合酶
能在高温（72℃）下的单链DNA为模板，
Taq DNA polymerase 从5’→3’方向合成新生的互补链
核糖核酸酶
专一性降解RNA
RNase
脱氧核糖核酸酶
内切核酸酶，水解单链或双链DNA
DNase
2.1 限制性内切酶 (restriction enzyme)
限制与修饰（Restriction and modification） 限制酶识别的序列 限制酶产生的末端 DNA末端长度对限制酶切割的影响 位点偏爱（Site preference） 酶切反应条件 星星活性（star activity） 单链 DNA 的切割 酶切位点的引入 影响酶活性的因素 酶切位点在基因组中分布的不均一性
2．限制酶识别序列的结构
限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在 DNA两条链相对称的位置。
特例：（见下页举例） 识别序列不是对称的 识别多种序列 识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意 碱基。
EcoRⅠ G↓AATTC HindⅢ A↓AGCTT
CTTAA↑G
TTCGA↑A