分子克隆酶

1970年 美国约翰· 霍布金斯大学 H.Smith 偶然发现
流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae） 能迅速降解外源的噬菌体DNA 无细胞提取液可降解E.coli DNA
但不能降解自身DNA
即HindII酶
5’ ...G T Py Pu A C... 3’ 3’…C A Pu Py T G... 5’
2006-02-21
Other Kinds of Enzymes: Homing Endonucleases Nicking Enzymes Control Proteins Specificity Subunits 74 33 36 78
Distinct Specificities: prototypes Type I REs 34 Type II REs 259 Type III REs 5 Homing Endos 58 Type II Methylases 189 Orphan Methylases 23 Type IV 0 total 68 3692 10 74 625 109 3
Restriction Enzymes
Type I Type II Type III Methyl-Directed 49 3470 10 4
3529
/
2003
Enzymes:
Restriction Enzymes 3601 Type I 51 Type II 3540 Type III 10 Methyl-Directed 4 Weirdo REs 1 Putative REs 631
Methylases 696 Type I 45 Type II 550 Type III 12 Orphan Methylases 89 Weirdo Methylases 0 Putative Methylases 900
Other Kinds of Enzymes: Homing Endonucleases 62 Nicking Enzymes 22 Control Proteins 33 Specificity Subunits 59
获得的限制性DNA片段可作为DNA 操作中的基本介质
第一节 限制性内切酶
Restriction endonuclease
一、限制与修饰(restriction an modification) 二、限制性内切酶识别的序列
三、限制性内切酶产生的末端 四、末端长度对切割的影响 五、位点偏爱 (site preferences) 六、酶切反应条件 七、星星活性(star activity) 八、单链DNA的切割
一、限制与修饰 Restriction and modification
50年代初，发现寄主控制的专一性( host controlled specificity) 噬菌体表现的现象具有代表性和普遍性
其在不同宿主中的转染频率：在感染某一宿
主后，再去感染其它宿主时受到限制的现象
1. 现象
/cgi-bin/statlist Restriction Enzymes 3773 Type I 68 Type II 3692 Type III 10 Type IV 3 Weirdo REs 1 Putative REs 1939 --------------------------------Methyltransferases 810 Type I 64 Type II 625 Type III 12 Orphan Methylases 109 Weirdo Methylases 0 Putative Methylases 3283
分子克隆酶
第二章 分子克隆工具酶
Enzymes used in molecular cloning
切 割 位 点 可 为 获 得 DNA 物 理 图 (physical map)的特殊标记 利 用 限 制 性 内 切 酶 (Restriction endonuclease) 切割产生特殊 DNA 片 段的能力使得纯化那些 DNA 片段成 为可能
Commercial Availability:
2002 2003
Restriction Enzymes: 583 568 Methylases: 18 17 Homing Endonucleases: 6 5 Nicking Enzymes: 7 8 Distinct Type II RE specificities: 207 213
pfu plaque forming unit 空斑形成单位 EOP Efficiency of plate 感染率
E. coli K
EOP=10-4
EOP=1
EOP=1
E. coli C
Байду номын сангаас
EOP=1
E.coli K
E.coli B
E.coli C
K B C
E.coli K
E.coli B
E.coli C
K B C
1 10-4
-4 10
10-4 1
-4 10
1 1 1
说明K和B菌株中存在一种限制系统
可排除外来的DNA
10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果
甲基化：A N6甲基-腺膘呤 C 5‘甲基-胞嘧啶
2. 限制酶的发现
60年代，限制内切酶和限制酶的概念
1968年 首次从E.coli K中分离限制性内切酶 需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等 有特定的识别位点 但没有特定的切割位点 切割位点远离识别位点1000bp以上
第一节 限制性内切酶
Restriction endonuclease
任何物种都有 排除异物保护自身的防御机制
• 人的免疫系统(immunity system)
• 细菌的限制与修饰系统
(restriction and modification system)
限制性内切酶 修饰酶(modification enzyme)
GTCGAC G T TAA C G T C AA C GTTGAC
Y R
5’ ...G A A T T C... 3’ 3’…C T T A A G... 5’
EcoRI
3. 限制酶的命名
• • •
宿主 属名第一字母、种名头两个字母
菌株或型号 序号 罗马字 EcoRI
HindII
早前 加R, or M 菌株号和序号小写 1986年下半年 615R 98M 1998年 10000细菌 古细菌 3000种酶 200多特异性