分子克隆酶

Commercial Availability:
2002 2003
Restriction Enzymes: 583 568 Methylases: 18 17 Homing Endonucleases: 6 5 Nicking Enzymes: 7 8 Distinct Type II RE specificities: 207 213
获得的限制性DNA片段可作为DNA 操作中的基本介质
第一节 限制性内切酶
Restriction endonuclease
一、限制与修饰(restriction an modification) 二、限制性内切酶识别的序列
三、限制性内切酶产生的末端 四、末端长度对切割的影响 五、位点偏爱 (site preferences) 六、酶切反应条件 七、星星活性(star activity) 八、单链DNA的切割
Restriction Enzymes
Type I Type II Type III Methyl-Directed 49 3470 10 4
3529
http://rebase.neb.com/
2003
Enzymes:
Restriction Enzymes 3601 Type I 51 Type II 3540 Type III 10 Methyl-Directed 4 Weirdo REs 1 Putative REs 631
http://rebase.neb.com/cgi-bin/statlist Restriction Enzymes 3773 Type I 68 Type II 3692 Type III 10 Type IV 3 Weirdo REs 1 Putative REs 1939 --------------------------------Methyltransferases 810 Type I 64 Type II 625 Type III 12 Orphan Methylases 109 Weirdo Methylases 0 Putative Methylases 3283
分子克隆酶
源自文库
第二章 分子克隆工具酶
Enzymes used in molecular cloning
切 割 位 点 可 为 获 得 DNA 物 理 图 (physical map)的特殊标记 利 用 限 制 性 内 切 酶 (Restriction endonuclease) 切割产生特殊 DNA 片 段的能力使得纯化那些 DNA 片段成 为可能
第一节 限制性内切酶
Restriction endonuclease
任何物种都有 排除异物保护自身的防御机制
• 人的免疫系统(immunity system)
• 细菌的限制与修饰系统
(restriction and modification system)
限制性内切酶 修饰酶(modification enzyme)
1970年 美国约翰· 霍布金斯大学 H.Smith 偶然发现
流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae） 能迅速降解外源的噬菌体DNA 无细胞提取液可降解E.coli DNA
但不能降解自身DNA
即HindII酶
5’ ...G T Py Pu A C... 3’ 3’…C A Pu Py T G... 5’
E.coli C
K B C
1 10-4
-4 10
10-4 1
-4 10
1 1 1
说明K和B菌株中存在一种限制系统
可排除外来的DNA
10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果
甲基化：A N6甲基-腺膘呤 C 5‘甲基-胞嘧啶
2. 限制酶的发现
60年代，限制内切酶和限制酶的概念
1968年 首次从E.coli K中分离限制性内切酶 需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等 有特定的识别位点 但没有特定的切割位点 切割位点远离识别位点1000bp以上
pfu plaque forming unit 空斑形成单位 EOP Efficiency of plate 感染率
E. coli K
EOP=10-4
EOP=1
EOP=1
E. coli C
EOP=1
E.coli K
E.coli B
E.coli C
K B C
E.coli K
E.coli B
一、限制与修饰 Restriction and modification
50年代初，发现寄主控制的专一性( host controlled specificity) 噬菌体表现的现象具有代表性和普遍性
其在不同宿主中的转染频率：在感染某一宿
主后，再去感染其它宿主时受到限制的现象
1. 现象
GTCGAC G T TAA C G T C AA C GTTGAC
Y R
5’ ...G A A T T C... 3’ 3’…C T T A A G... 5’
EcoRI
3. 限制酶的命名
• • •
宿主 属名第一字母、种名头两个字母
菌株或型号 序号 罗马字 EcoRI
HindII
早前 加R, or M 菌株号和序号小写 1986年下半年 615R 98M 1998年 10000细菌 古细菌 3000种酶 200多特异性
Methylases 696 Type I 45 Type II 550 Type III 12 Orphan Methylases 89 Weirdo Methylases 0 Putative Methylases 900
Other Kinds of Enzymes: Homing Endonucleases 62 Nicking Enzymes 22 Control Proteins 33 Specificity Subunits 59
2006-02-21
Other Kinds of Enzymes: Homing Endonucleases Nicking Enzymes Control Proteins Specificity Subunits 74 33 36 78
Distinct Specificities: prototypes Type I REs 34 Type II REs 259 Type III REs 5 Homing Endos 58 Type II Methylases 189 Orphan Methylases 23 Type IV 0 total 68 3692 10 74 625 109 3