核酸物理化学性质
核酸理化性质讲义
核算理化性质-讲义目录1.一般物理性质；2.核酸的紫外吸收；3.变性；4.复性；5.杂交；教学目的：了解核酸的一般物理性质及DNA序列的测定方法，掌握核酸的紫外吸收特性、变性和复性及核酸的分离、提纯和定量测定。
教学重点：核酸的紫外吸收及变性和复性；教学难点：核酸的变性和复性1.一般物理性质1.1形态DNA —— 白色纤维状固体 RNA —— 白色粉末状固体1.2溶解性微溶于水；不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂；用乙醇可以沉淀核酸。
RNA核蛋白体(RNP)易溶于0.14mol/L NaCl溶液；DNP可溶于1~2mol/L的NaCl溶液；RNA在碱性溶液中不稳定； DNA在碱性溶液中稳定。
显色反应：利用核糖和脱氧核糖不同的显色反应鉴定DNA与RNA。
核糖与地衣酚（3,5-二羟甲苯）试剂反应呈鲜绿色。
脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，而核糖无此反应。
1.3粘度DNA溶液粘度极高 (因其分子直径小而长度大)RNA溶液粘度要小得多★核酸变性或降解后，粘度降低1.4两性解离概念：核酸为两性电解质，因核苷酸含有磷酸基与碱基，磷酸基和碱基可以解离，在不同pH条件下解离程度不同，在一定条件下可形成兼性离子，表现为两性离子状态，通常表现为酸性。
效果：由于磷酸基团的酸性很强，所以pI（等电点）较低，整个分子相当于多元酸。
应用：利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液的pH来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。
2. 紫外吸收性质2.1机理：嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸收紫外光。
2.2性质1：在260nm处有最大吸收峰。
对于纯的DNA或RNA，可以通过测得A260来推测其核酸含量。
A260/ A280值可以反映核酸的纯度。
性质2：纯的DNA：A260/ A280 =1.8 纯的RNA：A260/ A280 =2.02.3.定义：增色效应(hyperchromic effect)是变性后DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。
第5章核酸的化学 第四节 核酸的性质
食品生物化学
图5-15 RNA紫外吸收曲线
波长nm
食品生物化学
四、核酸的变性与复性
当核酸在某些理化因素（如有机溶剂、酸、碱、尿素、加 热及酰胺等）作用下，互补碱基对间的氢键断裂，双螺旋结构 松散，变成单链的过程称为变性(denaturation)。变性使核酸的 二级结构、三级结构改变，但核苷酸排列顺序不变。变性后的 核酸理化性质改变，生物学活性丧失。
核酸是相对分子质量很大的高分子化合物，高分子溶液比 普通溶液黏度要大得多，高分子形状的不对称性愈大，其黏度 也就愈大，不规则线团分子比球形分子的黏度大，线形分子的 黏度更大。由于DNA分子极为细长，因此即使是极稀的溶液也 有极大的黏度，RNA的黏度要小得多。
二、核酸的酸碱性质
核酸和蛋白质一样，也是两性电解质，在溶液中发生两性 电离。因磷酸基的酸性比碱基的碱性强，故其等电点偏于酸性。 利用核酸的两性解离能进行电泳，在中性或偏碱性溶液中，核 酸常带有负电荷，在外加电场力作用下，向阳极泳动。利用核 酸这一性质，可将相对分子质量不同的核酸分离。
DNA的变性是可逆的。变性DNA在适当条件下，变性的两 条互补链重新结合，恢复原来的双螺旋结构和性质，这个过程 称为复性(renaturation)。热变性的DNA经缓慢冷却（称退火处 理）即可复性。最适宜的复性温度比Tm值约低25℃，这个温度 又叫退火温度。
食品生物化学
图5-16 两种不同来源的DNA在260nm的吸收值与温度变化的关系
食品生物化学
DNA的解链过程发生于一个很窄的温度区内，DNA的变性 过程是爆发式的，有一个相变过程，把A260达到最高值的一半时 对应的温度称为该DNA的解链温度或融解温度，用Tm表示。 Tm值大小与DNA碱基组成有关，由于G-C之间的氢键联系要比 A-T之间的氢键联系强得多，故G＋C含量高的DNA其Tm值越高。 通过测定Tm值可知其G＋C碱基的含量。
3 核酸性质
离心机示意图
2.2核酸的沉降特性
2.3沉降系数（沉降常数）
概念：指单位离心力场的沉降速度。对于一个特定的分子而 言是一个定值： 沉降速度 S= 沉降系数和 离心加速度 分子量之间 可以进行换 算（沈同、王
镜岩« 生物化学 » 200-204页），
在表示分子 大小时常用 沉降系数表 示。如：
3核酸的紫外吸收 3.1原理 嘌呤和嘧啶碱基含有共轭双键结构，因而核酸有紫外吸收 特性，最大吸收波长为260nm。 3.2分光光度计的原理 光源 待测物质溶液 检测系统
5.2 电泳 带电粒子在电 场中向与自身所 带电荷相反的电 极移动的现象. 移动速度与分 子的大小和形状 等因素有关.
负 极
1 2 3 4 5
正极 介质 缓冲溶液
样品
6核酸的提取
植物基因组DNA提取---CTAB法 1） 称取0.6-0.8克样品，加液氮，迅速研磨成细粉末，转入10毫 升离心管。 2） 向离心管中加入3毫升经65℃预热的提取缓冲液，混匀。 3） 65℃水浴30分钟，其间不时颠倒混匀样品。 4） 4℃，12000rpm离心20分钟，取上清液。 5） 上清液中加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），颠倒混匀， 12000rpm离心15分钟，取上清液。 6） 上清液中加入2倍体积的-20℃的无水乙醇，轻轻混匀，室温静 置30分钟，可见DNA析出。 7） 用去尖枪头轻轻将白色絮状DNA挑出，放入1。5毫升离心管， 70%乙醇清洗沉淀2次。 8） 沉淀室温干燥，500μL 1×TE充分溶解，无色透明。4℃储存备 用 9） 质量和浓度检测
第三节 核酸的性
1一般物理性质 质 DNA为白色纤维状固体,RNA为白色粉末状固体,都微溶于 水,但钠盐在水中的溶解度较大。不熔于乙醇、乙醚和氯仿等 有机溶剂。两种核蛋白在盐溶液中溶解度不同。 A B C 2沉降特性 2.1离心技术 离心时，大于溶液密度的 组分如细胞碎片、大分子等 向离心管底部移动（沉降）。 由于各组分的分子大小、 形状等不同，造成沉降速度 不同，经过一段时间后不同 组分实现分离。
15 核酸的物理化学性质-王镜岩生物化学(全)
（3）低盐变性：<0.01mol/l时，由于 磷酸基的静电斥力，可以配对的碱 基无法相互靠近。 （4）变性剂：尿素 、甲醛 ，可以打 开氢键
2. 核酸变性的特点
• （1）一系列物化性质也随之发生改变 ： 紫外吸光度值升高，粘度降低，浮力密 度升高，酸碱滴定曲线改变等 • （2） 变性作用发生在一个很窄的温度 范围内 。 • 通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失去 一半时的温度称为该DNA的熔点或熔解温 度，用Tm表示。DNA的Tm值一般在82— 95℃之间
(3) 限制性内切酶
限制性核酸内切酶：存在于细菌体内的，专门降
解外源 DNA ，是一类能够识别双链 DNA 分子中的某种
特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内 切酶。 往往与一种甲基化酶同时成对地存在。识别相 同的碱基序列，当内切酶作用位点上的某一些碱基
被甲基化修饰后，限制酶就不能再降解这种DNA了。
1. 引起核酸变性的因素
（1）热变性：加热使氢键断裂，碱基分子内 能升高，碱基堆积力减小，使用最广泛。缺 点是高温可能引起酯键断裂，得到长短不一 的单链DNA；80～100℃ （2）酸碱变性：在pH<4.5或pH>11即可引起变 性。在制备单链DNA时优先采取pH=11.3的碱 变性，全部氢键都被淘汰。
（2）、有足够的温度以破坏无规则的
链内氢键，但又不能太高，否则配对碱 基之间的氢键又难以形成，一般用比Tm低
20--25℃的温度。
将热变性的DNA骤然冷却时，DNA不可能
复性。缓慢冷却时，可以复性---退火。
（3）、DNA的性质也影响复性
DNA的片段越大，复性越慢。
DNA的浓度越大，复性越快。
重复序列越多，复性越快。
第十五章 核酸的物理化学性质和研究方法答案法答案
第十五章核酸的物理化学性质和研究方法答案一．选择题1-7 ③③②④①④二．判断题1-4是否否否5-9 是是是是是三．名词解释cot：是DNA复性的动力学常数，数值上等于单链DNA初始浓度Co和复性完成一1.12半所需时间的乘积，其大小代表DNA顺序的复杂程度。
2 增色效应：由于DNA变性引起的光吸收增加称增色效应,也就是变性后DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。
四．问答题1、RNA比DNA更不稳定，为什么？RNA的磷酸酯键易被碱水解，因为RNA的核糖上有2 ’-OH,在碱作用下形成磷酸三酯，磷酸三酯极不稳定，随即水解产生核苷2’，3’-环磷酸酯。
该环磷酸酯继续水解产生2’-核苷酸和3’-核苷酸。
DNA的脱氧核糖没有2 ’-OH，不能形成碱水解的中间产物，故对碱有一定抗性。
2、何谓变性？是否所有能引起蛋白质变性的因素都能引起核酸变性，或者引起核酸变性的因素都能引起蛋白质变性？变性作用是指核酸双螺旋结构被破坏，双链解开，从而核酸的天然构象和性质发生改变，但共价键并未断裂。
3、何谓Southern杂交？何谓Northern杂交？它们的原理和用途是什么？Southern杂交是将凝胶电泳分开的DNA限制片段转移到硝酸纤维膜上进行杂交。
其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。
该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA 指纹分析和PCR产物判断等研究中。
Northern杂交将变性的RNA转移到硝酸纤维膜上，通过分子杂交以检测特异的RNA。
原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
4、琼脂糖凝胶电泳对核酸研究有何用途？分离DNA分子大小从上百kb到数百bp, 凝胶电泳后可以用嵌合荧光染料显色，凝胶电泳后核酸样品可用多种方法自凝胶上回收。
核酸的理化性质
线
尿嘧啶核苷酸
pK1 = 1.0 第一磷酸基
pK3 = 6.4 第二磷酸基
烯醇式羟基
21
pH
由于核苷酸含磷酸与碱基，为两性电解质，它们在不 同pH的溶液中解离程度不同，在一定条件下可形成兼性离 子。
在第一磷酸基和含N环解离曲线的交叉处，带负电荷的 磷酸基与带正电荷的含N环数目相等，此时pH即为核苷酸 的等电点：
完全水解 完全水解
嘧啶碱回收率高
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二、碱水解
RNA的磷酸酯键对碱敏感、因此RNA易被碱水解， 产生核苷酸。 在室温，0.3～1mol/L KOH，24h，就可将RNA完全水 解，得到2′-或3′-核苷酸的混合物。
DNA无2′-OH，因此对碱有一定抗性：
生理意义： DNA更稳定 ，是遗传信息的载体。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。
3.链球菌脱氧核糖核酸酶类
是一个内切酶，作用于DNA，产物为5’磷酸为末端的碎片，长度 不一，最适PH为7，需镁离子参与。
Dase只作用于DNA 12
4.限制性内切酶：
在细菌中发现有这类酶，主要降解外源DNA，第一个发现的限制 性内切酶是从大肠杆菌(E.coli.)中发现的(1968年)。
限制性内切酶的命名（以EcoR I 为例）：
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三、酶水解
（一）核酸酶的分类
①按底物专一性分类：
RNase（核糖核酸酶） DNase（脱氧核糖核酸酶）
核酸内切酶 ②按对底物作用方式分类： 核酸外切酶
小球菌核酸酶：内、外切均可 ③按磷酸二酯键断裂方式分类：
3′-OH与磷酸基之间断裂 如 蛇毒磷酸二酯酶
5′-OH与磷酸基之间断裂 如 牛脾磷酸二酯酶
磷酸基（含两个羟基）的解离
核酸的理化性质PPT
由于磷酸基团的酸性很强，所以pI较低 ，整个分子相当于多元酸。
利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶
液的pH来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸
。
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三. 紫外吸收性质
嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸 收紫外光。在260nm处有最大吸收峰。对于纯 的DNA或RNA，可以通过测得A260来推测其核 酸含量。
核酸的理化性质
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一.一般的物理性质
1. 形 态
➢ DNA —— 白色纤维状固体 ➢ RNA —— 白色粉末状固体
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一.一般的物理性质
2. 溶 解性
➢ 微溶于水
➢ 不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂
➢ RNA核蛋白体(RNP)易溶于0.14mol/L的NaCl溶液
这是由于变性的DNA双螺旋解体，藏于螺旋内 部的碱基暴露出来。
增色效应常可用来衡量 DNA变性的程度。
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4. 热变性曲线(熔解曲线)
(一) 变 性
在DNA发生热变性的过程中，A260随温度的变化曲线。
变性百分率 A260
不 同 DNA 的 熔 解
100
曲线不同，但很
类似。都是 —
A260/ A280值可以反映核酸的纯度。
纯的DNA：A260/ A280 =1.8 纯的RNA：A260/ A280 =2.0
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(一) 变 性
1. 变性的概念
四.变性与复性
核酸在某些物理或化学因素的作用下，其空 间结构发生改变，从而引起理化性质的改变及生 物活性的降低或丧失。
A260值升高 粘度下降
核酸的理化性质
限制性内切酶
原核生物(及病毒)中存在着一类能识别外源DNA双螺旋中 4-8个碱基对所组成的特异的具有二重旋转对称性的回文序列， 并在此序列的某位点水解DNA双螺旋链，产生粘性末端或平末 端，这类酶称为限制性内切酶（ristriction endonuclease）。 山东落花生花落东山 帘卷晚晴天，天晴晚卷帘 Was it a cat I saw?
二、核酸的酸碱性质
1、碱基的解离
2、核苷的解离
3、核苷酸的解离
结合及释放 质子的能力
第 1、碱基的解离 14 章 碱基：含氮碱基，杂环化合物（很多生物碱的结构） 核 1）、具有芳香环的结构特征，呈平面或近乎平面 酸 含有共轭双键体系，紫外区有吸收（260nm）。 的 物 2）、氮原子位于环上或取代氨基上 弱碱性来自于环上氮原子，pKa约9.5，倾向于接受H 理 取代氨基（或曰碱基环外的氨基）碱性很弱，生理 化 条件下不能被质子化。 学 性 质
核酸的物理化学性质
一、核酸的水解 二、核酸的酸碱性质 三、核酸的紫外吸收性质 四、核酸的变性、复性及杂交
一、核酸的水解
（一）酸水解 糖苷键比磷酸二酯键 更易被酸水解 嘌呤碱基的糖苷键比 嘧啶碱基的糖苷键对 酸更不稳定
NH 2
酯键
O
N N O
N 9 N
5' HO P O CH2 O
-
糖苷
1' H H 2' OH
H
H OH
腺苷酸
（二）碱水解 RNA的磷酸酯键易被碱 水解，产生核苷酸。 由于RNA的核糖上有2’OH基，在碱作用下形成 磷酸三酯。 磷酸三酯极不稳定，随 即水解产生，产生 2’,3’-环磷酸酯，再水 解成2’-核苷酸及3’-核 苷酸
15-核酸的理化性质和研究方法
1Biochemistry. LuJie陆婕Lujie.jane@华中科技大学生命科学与技术学院生物物理与生物化学研究所生物化学BiochemistryBiochemistry. LuJieChapter 15Nucleic Acids:Properties and Techniques核酸的理化性质和研究方法2Biochemistry. LuJie核酸的化学结构和作为高聚物决定其理化性质：核酸的糖苷键和磷酸二酯键：可被水解；磷酸基和碱基：酸碱性质；碱基：紫外吸收特性；双螺旋结构：变性和复性。
3Biochemistry. LuJie核酸的性质溶解度：溶于水酸碱性：生理pH带负电荷分子量和形状：DNA 108~1012，d/l=10-7，“柔性棒”——高黏度不对称性——正旋光性紫外吸收——260nm有最大光吸收核酸的离心沉降DNA 的变性与复性4Biochemistry. LuJie一、核酸的水解二、核酸的酸碱性质三、核酸的紫外吸收四、核酸的变性、复性及杂交五、核酸的分离和纯化六、核酸序列的测定七、核酸的化学合成八、DNA微阵技术5Biochemistry. LuJie（一）酸水解糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解，产生嘌呤和嘧啶碱（二）碱水解: RNA→2’-核苷酸，3’-核苷酸RNA的磷酸酯键更易被碱水解（RNA的核糖上有2’-OH，在碱作用下形成磷酸三酯，极不稳定易水解，产生核苷2’，3’-环磷酸酯，继续水解产生2’-核苷酸和3’-核苷酸）（三）酶水解（消化）专一水解核酸的磷酸二酯键的酶称为核酸酶(nuclease)。
能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称为限制性核酸内切酶（限制酶）。
67Biochemistry. LuJie限制性DNA 内切酶: 专一性的核酸内切酶，能识别双链DNA 分子的特定序列，并可在该位置或其附近同时切断双链DNA 。
Biochemistry. LuJie核酸外切酶（endonuclease）：从多核苷酸链的末端开始,逐个将核苷酸切下的酶，如：♦3’→5’外切酶(蛇毒磷酸二酯酶)：在3’-OH与磷酸基之间断裂，其产物是5’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（1）；♦5’→3’外切酶(牛脾磷酸二酯酶)：在5’-OH与磷酸基之间断裂，其产物是3’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（2）。
第15章-核酸的物理化学性质和研究方法
4.密度梯度超速离心纯化RNA或不同构象的 DNA
超螺旋DNA或
（五） 核酸的凝胶电泳 p254
核酸研究中最常用的方法 优点：简单、快速、灵敏、成本低。
通过凝胶电泳 （1）可进行核酸分离，知道核酸的纯度。 （2）测定分子大小。 （3）估计核酸的构象。
1．琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）
总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛） 研究对象是mRNA，探针一般是DNA。
（3）Western blotting
将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝 酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素标 记的特定蛋白质的抗体进行反应，这种 技术叫做Western蛋白质杂交技术。
原理：抗原和抗体结合
测定核酸的ε(P)可判断DNA制剂是否发生变性或降解。
一般天然DNA的ε(P)为6 600，RNA为7 700—7 800。 单链多核苷酸的ε(P)值比双螺旋结构多核苷酸的 ε(P)值要高。
核酸发生变性时，ε(P)值升高，此现象称为增色 效应。（这是因为双螺旋结构使碱基对的π电子云 发生重叠，因而减少了对紫外光的吸收）
2.密度梯度超速离心测定DNA的G-C含量
G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系
ρ=0.1 xG-C + 1.658 xG-C = （ ρ-1.658）× 10
但是5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低， 低于理论值。
3.密度梯度超速离心研究核酸的构象
RNA＞DNA 变性DNA＞双链DNA ＞蛋白质， 变性程度越大，浮力密度越大
碱 基
（一）核酸的酸水解
水解特点：
戊
糖
1.糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解
核酸的物理化学性质
核酸的碱水解
RNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。 DNA的磷酸酯键则不易被碱水解。这是因为RNA 的核糖上有2’－OH，在碱作用下形成磷酸三酯。 磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷2’，3’ －环磷酸酯。该环磷酸酯继续水解产生2’－核苷 酸和3’－核苷酸。
DNA一般对碱稳定，若在1mol/L NaOH中加 热至100℃ 4h，可以得到小分子的寡聚脱氧核苷 酸。
ON H
pK1' 9.5 N-
H
ON H
O
NH
ON H
O
CH3
CH3
pK1' 9.9 N-
H
ON H
NH2
NH2
NH2
HN+ N
N pK1' 4.15 N H
NH
O NH+
HN
H2N
N
NH
N
pK
' 2
9.8
N
NH
H
O
pK1' 3.2
HN
H
H2N
N
N N
N
N-
N
pK2' 9.6
H
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 降解：核苷酸骨架上3’，5 ’-磷酸二酯键的断裂
3、变性因素
高温（一般＞75℃）— 热变性 强酸、碱 — 酸碱变性 甲醛（Agarose中RNA ） 尿素（PAGE中DNA ）
4、变性后理化性质变化
OD260增高 比旋度下降
粘度下降 浮力密度升高
酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失
• 减色效应（低色效应） —— 复性时紫外吸收减少的现象
(三) 核酸的杂交
变性
核酸性质
核酸的凝胶电泳
核酸的序列测定 DNA聚合酶链反应 DNA的化学合成
第十五章 核酸的研究方法
一 核酸的分离、提纯和定量测定
核酸制备
总的要求：防止核酸的降解和变性，要尽量保
持其在生物体内天然状态
注意的事项：条件温和，防止过酸、过碱、避
免剧烈搅拌，防止核酸酶作用
P513
第十五章 核酸的研究方法
（一）DNA的分离
Chapter14
核酸的物理化学性质
四
核酸的变性、复性及杂交
（三）、核酸的杂交
2. 常见杂交的类型
（1）Southern blotting （2）Northern blotting （3）Western blotting
（1）. Southern印迹杂交
将在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的 滤膜上，然后通过与标记的单链DNA或RNA探针的杂 交作用检测这些被转移的DNA片段
经验式: (G-C)%=(Tm-69.3)×2.44
(3)介质中的离子强度 一般在较高的离子强 度时，DNA的Tm值较高，而且熔解过程发生在 一个较小的温度范围之内。
P509
Chapter14
核酸的物理化学性质
四
核酸的变性、复性及杂交
（二）、复性 (renaturation)
变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成为双螺 旋结构，这过程称复性 1. DNA复性的特点：
一、 核酸的水解
二、核酸的酸碱性质
三、核酸的紫外吸收
四、核酸的变性、复性及分子杂交 五、核酸的沉降特性
502
Chapter14
核酸的物理化学性质
生物化学-生化知识点_核酸的物理化学性质
7-3 核酸的物理化学性质上册P502一一一核酸的水解：所有糖苷键和磷酸酯键都能被水解。
一1一酸水解：糖苷键比磷酸二酯键易被水解，嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱更易水解。
一2一碱水解：磷酸酯键易水解，RNA比DNA易水解，因为RNA核糖上有2‘-OH，水解过程见P502。
一3一酶水解：为水解磷酸二酯键的酶，专一水解核酸的为核酸酶。
1.核酸酶的分类：按底物专一性分为RNase（核糖核酸酶）和DNase（脱氧核糖核酸酶）。
按对底物作用方式分为内切酶（作用点在核糖核酸酶内部）和外切酶（作用点在末端）。
2.RNase：如牛胰核糖核酸酶（EC 2.7.7.16），内切酶，作用位点为嘧啶核苷（Py）-3‘-磷酸与其他核苷酸之间的连键。
3.限制性内切酶：为DNase。
剪裁DNA的工具，可用于核酸测序和基因工程。
在细菌中发现，目前已找到限制性内切酶数千种。
限制性内切酶往往与甲基化酶成对存在，自身酶作用位点的碱基被甲基化，内切酶不再降解，因而可识别和降解外源DNA。
断裂位点处常有二重旋转（轴）对称性（回文结构，正读反读相同），在特定位点两条链切断后形成粘末端或平末端。
限制性内切酶命名：如E. coRⅠ，第1个字母E(大写)，为大肠杆菌(E.coli)属名的第一个字母，第2、3两个字母co（小写）为种名头两个字母，第4个字母R，表示菌株，最后一个罗马字为该细菌中已分离这一类酶的编号。
一一一核酸的酸碱性质：核苷和核苷酸都是兼性离子，碱基和磷酸基均能解离，见P505，具有酸碱性。
由于DNA酸碱变性，使酸碱滴定曲线不可逆。
一一一核酸的紫外吸收：嘌呤环与嘧啶环具有共轭双键，核苷和核酸的吸收波段在240~290nm，最大吸收值在260nm附近（蛋白质最大吸收值280nm）。
一1一可用于测样品纯度（测吸光度A）：A260/A280比值，纯DNA应大于1.8，纯RNA应达到2.0，若样品混有杂蛋白，比值明显降低。
对于纯样品，从260nm的A值即可算出含量。
13 核酸的物理化学性质和研究方法
按底物专一性可分为DNA水解酶（DNases）和RNA水解 酶（RNases）。 根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶。
举例1. 蛇毒磷酸二酯酶和脾磷酸二酯酶
举例2. 胰核糖核酸酶A（RNase A）
举例3. 脱氧核糖核苷酸酶（DNases）
5’ 3’
3’ 5’
a型
DNase I
2.酶水解
CH3
H
N H O N H
O
C(胞嘧啶)解离为N3-H（pK1=4.6); U和T环上无NH2， N3-H解离分别为（pK1=9.5； pK1=9.9)
二、核酸的酸碱性质
1. 碱基的解离 鸟嘌呤解离为： N7-H（pK1=3.2); N1-H （pK2=9.6); N9-H （pK3=12.4) 腺嘌呤解离为： N1-H （pK1=4.15); N9-H （pK2=9.8)
限制性内切酶和限制性图谱
目前所用的限制性内切酶都是来自细菌，可分为两类， 类型I：是一种多功能酶，既能降解DNA又能修饰DNA， 具有ATP酶的功能。 类型 II ：是一种较为简单的酶，这种酶不表现出修 饰（甲基化）的活性，能识别DNA分子上特殊的序列， 如果该序列没有被修饰，即可切断DNA分子。一般识 别的是 4-6bp 的回文结构。切断 DNA 分子可产生粘性 末端和平头末端。
0.2 0.1
0 220 240 260 280 300 320 340
Wavelength (nm)
分光光度法测定核酸的浓度和纯度
1. 核酸浓度测定
OD260 = 1.0 相当于
50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸
A260 260cL A Mass(mg ) 260 M n V r 260
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(三) 核酸的杂交
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Chapter13 核酸的物理化学性质
如果受到某些理化因素的破坏，其三维结构就要改变， 从而引起理化性质及生物学功能的改变，这种现象称 为核酸的变性。
变性核酸将失去其部分或全它的一级结构(碱基顺序)保持不变。 能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、甲醛和 尿素等的存在均可引起核酸的变性。
DNA一般对碱稳定，RNA对碱不稳定。
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Chapter13 核酸的物理化学性质
一、核酸的水解
（二）核酸的酶水解
生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核 苷酸链中的磷酸二酯键。 以DNA为底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA为底物 的RNA水解酶（RNases）。 根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶。 核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3′端或5′ 端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式刚 好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点 切断磷酸二酯键。 在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶。 这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。
变性与降解的区别：是否涉及共价键的断裂和分子量的改变。
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Chapter13 核酸的物理化学性质
四、核酸的变性、复性及分子杂交
核酸的变性的特征
DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内 完成。因此，通常将引起DNA变性的温度称为融点， 用Tm表示。
一般DNA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值与 分子中的G和C的含量有关。
Chapter13 核酸的物理化学性质
一、核酸的水解
（一）核酸的酸水解或碱水解
核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。 DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。
例如，在0.1 mol/L NaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解， 生成2′或3′磷酸核苷；DNA在同样条件下则不受影响。这种水 解性能上的差别，与RNA核糖基上2′-OH的邻基参与作用有很 大的关系。在RNA水解时，2′-OH首先进攻磷酸基，在断开磷 酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。
G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映 DNA分子中G, C含量，可通过经验公式计算：
（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44
影响DNA Tm大小的因素：DNA的均一性；G—C的 含量；介质中的离子强度。
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Chapter13 核酸的物理化学性质
四、核酸的变性、复性及分子杂交
限制性内切酶已成为基因工程最重要的工具酶。如 EcoRI
（请看教材503—504页）
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Chapter13 核酸的物理化学性质
二、核酸的分子量、溶解性、粘度和酸 碱性质
1、 分子量在数百至数百万之间；微溶于水，不溶于 有机溶剂；变性时粘度降低； 2、核酸的碱基、核苷和核苷酸均能发生解离。在一 定的条件下可形成兼性离子，为两性电解质，具有等 电点。
这样形成的新分子称为杂交DNA分子。DNA单链与 互补的RNA链之间也可以发生杂交。
核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要 意义。
Southern blotting （Southern印迹法）：DNA-DNA杂交 Northern blotting （Northern印迹法）：DNA-RNA杂交 Western blotting （Western印迹法）：抗原-抗体结合
当DNA的稀盐溶液加热到80-100℃时，双螺旋结构即发生解 体，两条链彼此分开，形成无规线团。
DNA变性后，它的一系列性质也随之发生变化，如紫外吸收 (260 nm)值升高, 粘度降低等。
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Chapter13 核酸的物理化学性质
四、核酸的变性、复性及分子杂交
(二) 核酸的复性(renaturation) 核酸的复性:变性DNA在适当的条件下，两条彼此分
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(二) 核酸的复性(renaturation)
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Chapter13 核酸的物理化学性质
四、核酸的变性、复性及分子杂交
(三) 核酸的杂交(hybridization)
热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA 互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互 补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构，叫核酸杂交。
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Chapter13 核酸的物理化学性质
三、核酸的紫外吸收
在核酸分子中，由于 嘌呤碱和嘧啶碱具有 共轭双键体系，因而 具有独特的紫外线吸 收光谱，最大吸收峰 波长（λmax）在 260nm处，可以作 为核酸及其组份定性 和定量测定的依据。
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Chapter13 核酸的物理化学性质
三、核酸的紫外吸收
摩尔磷消光系数 508页
增色效应：核酸发生变 性时，摩尔磷消光系数 增加 的现象。
减色效应：复性后，摩 尔磷消光系数 又降低的效应。
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Chapter13 核酸的物理化学性质
四、核酸的变性、复性及分子杂交
(一) 核酸的变性(denaturation) 核酸的变性:维系核酸三维结构的碱基堆积力和氢键
开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称 为复性。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是 生物活性一般只能得到部分的恢复。 DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。 将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复 性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性。分子 量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外， DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。
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Chapter13 核酸的物理化学性质
一、核酸的水解
（二）核酸的酶水解
脱氧核糖核酸酶类
1、牛胰脱氧核糖核酸酶(DNaseI)：从5′磷酸末端切下寡聚核苷酸。 2、牛脾脱氧核糖核酸酶(DNaseII) ：从5′磷酸末端切下寡聚核苷 酸。 3、限制性内切酶：存在于细菌体内，用于专一性地降解外源的DNA，