第十五章 核酸的物理化学性质和研究方法答案法答案

第十五章核酸的物理化学性质和研究方法答案

一．选择题

1-7 ③③②④①④

二．判断题

1-4是否否否

5-9 是是是是是

三．名词解释

cot：是DNA复性的动力学常数，数值上等于单链DNA初始浓度Co和复性完成一1.

1

2

半所需时间的乘积，其大小代表DNA顺序的复杂程度。

2 增色效应：由于DNA变性引起的光吸收增加称增色效应,也就是变性后DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。

四．问答题

1、RNA比DNA更不稳定，为什么？

RNA的磷酸酯键易被碱水解，因为RNA的核糖上有2 ’-OH,在碱作用下形成磷酸三酯，磷酸三酯极不稳定，随即水解产生核苷2’，3’-环磷酸酯。该环磷酸酯继续水解产生2’-核苷酸和3’-核苷酸。DNA的脱氧核糖没有2 ’-OH，不能形成碱水解的中间产物，故对碱有一定抗性。

2、何谓变性？是否所有能引起蛋白质变性的因素都能引起核酸变性，或者引起核酸变性的因素都能引起蛋白质变性？

变性作用是指核酸双螺旋结构被破坏，双链解开，从而核酸的天然构象和性质发生改变，但共价键并未断裂。

3、何谓Southern杂交？何谓Northern杂交？它们的原理和用途是什么？

Southern杂交是将凝胶电泳分开的DNA限制片段转移到硝酸纤维膜上进行杂交。其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA 指纹分析和PCR产物判断等研究中。

Northern杂交将变性的RNA转移到硝酸纤维膜上，通过分子杂交以检测特异的RNA。原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。

4、琼脂糖凝胶电泳对核酸研究有何用途？

分离DNA分子大小从上百kb到数百bp, 凝胶电泳后可以用嵌合荧光染料显色，凝胶电泳后核酸样品可用多种方法自凝胶上回收。

5、为制备变性胶，常在琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中添加什么变性剂？它们有何用途。

为制备变性胶，常在琼脂糖凝胶中添加氢氧化甲基汞或甲醛，RNA在变性凝胶中电泳时，相对分子质量的对数才与迁移率成反比。

在聚丙烯酰胺凝胶中添加8mol/L尿素或98%甲酰胺，DNA和RNA的二级结构已被破

坏，其电泳迁移率与单链Mr的对数呈理想的反比关系。

6、为什么羟基磷灰石柱呈析能分开单链和双链核酸？

由于核酸的磷酸基可与羟基磷灰石的钙离子作用，从而被吸附其上，这种吸附力决定于核酸的性质，受分子大小的影响较小。双链核酸分子刚性较强，呈伸展状态，其磷酸基有效分布在表面；而变性或单链核酸分子较柔软，呈无规线团结构，有些磷酸基折叠在分子内。因此，双链核酸的吸附力比单链强，双链DNA的吸附力比双链RNA强，而DNA-RNA杂交分子的吸附力介于两者之间。

7、简要说明oligo(dT)柱制备poly(A)+mRNA的原理和主要操作步骤。

真核生物细胞的mRNA在3’端通常带有poly(A)尾巴，利用与固体支持物相偶联的寡聚脱氧胸甘酸（oligo(dT)）与poly(A)结合，即可将poly(A)+mRNA从总RNA中分离出来。步骤：①在高浓度盐的TES缓冲液中将RNA样品上柱，使poly(A)与oligo(dT)结合，洗掉柱上非特异吸附的RNA。②用不含盐的TES缓冲液将mRNA洗脱。

8、提取DNA和RNA主要应注意什么？目前常用的方法有哪些？

提取DNA时应尽量避免核酸酶和机械切力对DNA的降解作用。目前较长用的方法是在细胞悬液中直接加入2倍体积含1﹪SDS的缓冲液，并加入广谱蛋白酶最后浓度达100 g/mL，在65℃保温4h,使细胞蛋白质全部降解，然后用苯酚抽提，除净蛋白酶和残留的蛋白质。含DNA的水相在有盐存在的条件下加二倍体积的乙醇，低温放置使DNA沉淀出来。DNA制品中含有的少量RNA可用不含DNase的RNase分解除去。氯化铯密度梯度离心也是实验室制备高质量DNA常用的方法。

制备RNA特别需要注意三点：（1）所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温烘烤，塑料用具经高压灭菌，不能高压灭菌的用具要用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)处理，再煮沸以分解和除净DEPC.试验者应戴消毒手套。（2）在破碎细胞的同时加入强的蛋白质变性剂使RNase 失活。（3）在RNA反应体系中加入RNase的抑制剂。现在常用于制备RNA方法有两个：（1）用酸性胍盐、苯酚、氯仿提取。（2）用胍盐/氯化铯法。

9、Sanger提出的酶法测定DNA序列的原理是什么？有何划时代的意义？

Sanger提出的酶法测定DNA序列的原理是利用DNA聚合酶，将待测序DNA样品作为模板，在引物和底物（dNTP）其中一种用放射性同位素标记），共分为四组，每组按一定比例加入一种底物类似物（ddNTP）。它能随机参入合成的DNA链，一旦惨入后DNA合成立即终止。于是各种不同大小片段的末端核苷酸必定为该种核苷酸，片段的长度也可以代表相应核苷酸的位置。将各组样品同时进行含变性剂的聚丙烯酰胺凝胶电泳，从放射自显影的图谱可以直接读出DNA的核苷酸序列。

该方法简单快捷，极大的简化了DNA测序的方法。许多物种的DNA序列得以知道，有利于进一步研究和基因治疗等方面。现在测序技术的改进现已无需制备单链模板，只需有特异引物，可以直接用双链DNA进行测序。

10、何谓DNA芯片？DNA芯片有何用途？

DNA芯片或称DNA微阵，是以硅、玻璃、微孔滤膜等材料作为承载基片，通过微加工技术，在其上固定密集的不同序列DNA微阵列，一次检测即可获得大量的DNA杂交信息。

DNA芯片的用途十分广泛，它是分析基因组或是其表达信息的重要技术，归纳起来有以下几点: (1)测定基因型、基因突变和多态性