第十五章 核酸的物理化学性质和研究方法答案法答案
第十五章 核酸的物理化学性质和研究方法答案法答案
第十五章核酸的物理化学性质和研究方法答案一．选择题1-7 ③③②④①④二．判断题1-4是否否否5-9 是是是是是三．名词解释cot：是DNA复性的动力学常数，数值上等于单链DNA初始浓度Co和复性完成一1.12半所需时间的乘积，其大小代表DNA顺序的复杂程度。
2 增色效应：由于DNA变性引起的光吸收增加称增色效应,也就是变性后DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。
四．问答题1、RNA比DNA更不稳定，为什么？RNA的磷酸酯键易被碱水解，因为RNA的核糖上有2 ’-OH,在碱作用下形成磷酸三酯，磷酸三酯极不稳定，随即水解产生核苷2’，3’-环磷酸酯。
该环磷酸酯继续水解产生2’-核苷酸和3’-核苷酸。
DNA的脱氧核糖没有2 ’-OH，不能形成碱水解的中间产物，故对碱有一定抗性。
2、何谓变性？是否所有能引起蛋白质变性的因素都能引起核酸变性，或者引起核酸变性的因素都能引起蛋白质变性？变性作用是指核酸双螺旋结构被破坏，双链解开，从而核酸的天然构象和性质发生改变，但共价键并未断裂。
3、何谓Southern杂交？何谓Northern杂交？它们的原理和用途是什么？Southern杂交是将凝胶电泳分开的DNA限制片段转移到硝酸纤维膜上进行杂交。
其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。
该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA 指纹分析和PCR产物判断等研究中。
Northern杂交将变性的RNA转移到硝酸纤维膜上，通过分子杂交以检测特异的RNA。
原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
4、琼脂糖凝胶电泳对核酸研究有何用途？分离DNA分子大小从上百kb到数百bp, 凝胶电泳后可以用嵌合荧光染料显色，凝胶电泳后核酸样品可用多种方法自凝胶上回收。
核酸问题及答案
核酸问题及答案定义类1、什么是核酸。
核酸（Nucleic Acids）是一种主要位于细胞核内的生物大分子，其充当着生物体遗传信息的携带和传递。
DNA分子含有生物物种的所有遗传信息，为双链分子，其中大多数是链状结构大分子，也有少部分呈环状结构，分子量一般都很大。
RNA主要是负责DNA遗传信息的翻译和表达，为单链分子，分子量要比DNA小得多。
核酸存在于所有动植物细胞、微生物和病毒、噬菌体内，是生命的最基本物质之一，对生物的生长、遗传、变异等现象起着重要的决定作用。
核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内、生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。
不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。
根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸，简称RNA和脱氧核糖核酸，简称DNA。
DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础，RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用，其中转移核糖核酸，简称tRNA，起着携带和转移活化氨基酸的作用；信使核糖核酸，简称mRNA，是合成蛋白质的模板；核糖体的核糖核酸，简称rRNA，是细胞合成蛋白质的主要场所。
2、核酸的性质?a.化学：①酸效应：在强酸和高温，核酸完全水解为碱基，核糖或脱氧核糖和磷酸。
在浓度略稀的的无机酸中，最易水解的化学键被选择性的断裂，一般为连接嘌呤和核糖的糖苷键，从而产生脱嘌呤核酸。
②碱效应1．DNA：当PH值超出生理范围（pH7~8）时，对DNA结构将产生更为微妙的影响。
碱效应使碱基的互变异构态发生变化。
这种变化影响到特定碱基间的氢键作用，结果导致DNA 双链的解离，称为DNA的变性2．RNA：PH较高时，同样的变性发生在RNA的螺旋区域中，但通常被RNA的碱性水解所掩盖。
这是因为RNA存在的2`-OH参与到对磷酸脂键中磷酸分子的分子内攻击，从而导致RNA的断裂。
③化学变性：一些化学物质能够使DNA/RNA在中性PH下变性。
由堆积的疏水剪辑形成的核酸二级结构在能量上的稳定性被削弱，则核酸变性。
15 核酸的物理化学性质-王镜岩生物化学(全)
（3）低盐变性：<0.01mol/l时，由于 磷酸基的静电斥力，可以配对的碱 基无法相互靠近。 （4）变性剂：尿素 、甲醛 ，可以打 开氢键
2. 核酸变性的特点
• （1）一系列物化性质也随之发生改变 ： 紫外吸光度值升高，粘度降低，浮力密 度升高，酸碱滴定曲线改变等 • （2） 变性作用发生在一个很窄的温度 范围内 。 • 通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失去 一半时的温度称为该DNA的熔点或熔解温 度，用Tm表示。DNA的Tm值一般在82— 95℃之间
(3) 限制性内切酶
限制性核酸内切酶：存在于细菌体内的，专门降
解外源 DNA ，是一类能够识别双链 DNA 分子中的某种
特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内 切酶。 往往与一种甲基化酶同时成对地存在。识别相 同的碱基序列，当内切酶作用位点上的某一些碱基
被甲基化修饰后，限制酶就不能再降解这种DNA了。
1. 引起核酸变性的因素
（1）热变性：加热使氢键断裂，碱基分子内 能升高，碱基堆积力减小，使用最广泛。缺 点是高温可能引起酯键断裂，得到长短不一 的单链DNA；80～100℃ （2）酸碱变性：在pH<4.5或pH>11即可引起变 性。在制备单链DNA时优先采取pH=11.3的碱 变性，全部氢键都被淘汰。
（2）、有足够的温度以破坏无规则的
链内氢键，但又不能太高，否则配对碱 基之间的氢键又难以形成，一般用比Tm低
20--25℃的温度。
将热变性的DNA骤然冷却时，DNA不可能
复性。缓慢冷却时，可以复性---退火。
（3）、DNA的性质也影响复性
DNA的片段越大，复性越慢。
DNA的浓度越大，复性越快。
重复序列越多，复性越快。
2019华南理工食品科学与工程考研865有机化学与874生物化学考试真题试卷与真题答案
2019华南理工食品科学与工程考研865有机化学与874生物化学考试真题试卷与真题答案《2019华南理工大学考研874生物化学复习全析（含真题与答案，共四册）》由致远华工考研网依托多年丰富的教学与辅导经验，组织官方教学研发团队与华南理工大学轻工与食品工程学院食品专业的优秀研究生共同合作编写而成。
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《2019华南理工考研874生物化学复习全析（含真题与答案，共四册）》全书编排根据参考书目：《食品生物化学》(第二版)宁正祥、赵谋明编著，华南理工大学出版社2006 《生物化学》（第三版）沈同、王竟岩主编,高等教育出版社内容提要：1、华工轻工食品学院院系解读+华南理工大学874生物化学考试解读；2、2004-2017年华南理工大学轻工与食品学院874生物化学考研真题及2007-2016年874生物化学考研真题答案；3、874生物化学重难点内容解析。
（注意：华工指定书目虽然是王镜岩的《生物化学》，但实际考察的内容以华工本校老师宁正祥的《食品生物化学》这本教材为主）《2019华南理工大学考研874生物化学复习全析（含真题与答案）》通过提供院系专业相关考研内部信息，总结近年考试内容与考录情况，系统梳理核心考点与重难点知识点，并对历年真题进行透彻解析，令考生不再为信息匮乏而烦恼，同时极大提高了复习效率，让复习更有针对性。
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核酸化学(习题附答案)
一、名词解释1 解链温度（Tm值）答案: 又称DNA的熔解温度，引起DNA发生“熔解”的温度变化范围只不过几度，这个温度变化范围的中点称为熔解温度（Tm）或解链温度。
2 增色效应答案: 当双链DNA解链（变性）为单链DNA时，碱基更加外露，紫外吸收增加的现象。
3 减色效应答案: 当单链DNA又重新配对，形成双链DNA时，由于碱基之间电子的相互作用，紫外吸收又明显降低的现象。
4 DNA变性答案: 一定条件下，双链DNA解链为单链DNA的现象。
5 DNA复性答案: 除去变性因素后，互补的单链DNA重新结合为双链DNA的现象。
6 分子杂交答案: 变性后的单链DNA与具有一定同一性序列的DNA链或RNA分子结合形成双链的DNA-DNA或DNA-RNA杂交分子的过程。
二、填空题1 第二信使的英文是。
答案: Second2 核苷酸的组成成分有、和。
答案: 磷酸，碱基，戊糖3 核苷由和组成，通过键连接而成。
答案: 碱基，戊糖，N-C糖苷键4 单核苷酸由和组成，单核苷酸是的酯。
答案: 核苷，磷酸，核苷，磷酸5 组成核酸的基本单位是。
答案: 核苷酸6 组成核酸的戊糖有和两种，根据所含戊糖的不同可将核酸分为和两大类。
答案: 核糖，脱氧核糖，核糖核酸（RNA），脱氧核糖核酸（DNA）7 DNA主要存在于并与结合而集中在染色体。
答案: 细胞核（基因组），蛋白质8 RNA主要存在于，根据其功能又可分为、和三种。
答案: 细胞质，r RNA，m RNA，t RNA9 DNA的二级结构是结构。
答案: 双螺旋10 核酸分子中单核苷酸之间靠键相连接，而互补的碱基之间靠键相配对。
答案: 磷酸二酯键，氢键11 在DNA中碱基互补的规律是和。
答案: A=T，G≡C12 在RNA局部双螺旋中碱基互补的规律是和。
答案: A=U，G≡C13 在ATP中有个高能磷酸键。
答案: 214 t RNA的二级结构为形，其柄部称为臂，顶部的环称为，环的中间含有。
核酸的重要理化性质
RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行 为所引起的性质变化没有DNA那样明显。 利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的 情况。 因为天然状态的DNA在完全变性后，紫外吸 收(260 nm)值增加25－40%.而RNA变性后， 约增加1.1%。 增色效应：变性后DNA对260nm紫外光的吸 收率（A260）比变性前明显增加，这种现象 称为增色效应.
2.DNA变性后的表 现
A260值增加 粘度下降 浮力密度增大 分子量不变
3.DNA的热变性和解链温度（Fra bibliotekm）
用加热的方法使DNA变性叫做热变性 DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度 区间内完成。因此，通常将DNA的变性达到 50%时，即增色效应达到一半时的温度称为 DNA的解链温度（melting temperature,Tm）,Tm也称熔解温度或DNA 的熔点。
DNA复性
5、核酸的杂交（hybridization）
热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源 DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某 些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋 结构。 这样形成的新分子称为杂交DNA分子。DNA单 链与互补的RNA链之间也可以发生杂交。 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有 重要意义。
核 酸 的 杂 交
核酸杂交的应用
Southern blotting(Southern 印迹) Northern blotting(Northern 印迹) Western blotting(Western 印迹)
三、核酸的水解
1.核酸的酸解和碱解
核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断 （降解）。 酸对核酸的作用因酸的浓度、温度和作用时间不同而不 同。嘌呤碱基比嘧啶碱基易被水解下来。 DNA和RNA对碱的耐受程度有很大差别。例如，在 0.3-1 mol/L NaOH溶液中，在室温至370C条件下 RNA几乎可以完全水解，生成2′-或3′-磷酸核苷； DNA在同样条件下则不受影响，若加温至1000C，4个 小时也可得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。这种水解性能 上的差别，与RNA核糖基上2′-OH的羟基参与作用有 很大的关系。在RNA水解时，2′-OH首先进攻磷酸基， 在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用
核酸化学__习题及答案
核酸化学习题(一)名词解释1．单核苷酸(mononucleotide)2．磷酸二酯键（phosphodiester bonds）3．不对称比率（dissymmetry ratio）4．碱基互补规律(complementary base pairing)5．反密码子（anticodon）6．顺反子（cistron）7．核酸的变性与复性（denaturation、renaturation）8．退火（annealing）9．增色效应（hyper chromic effect）10．减色效应（hypo chromic effect）11．噬菌体（phage）12．发夹结构（hairpin structure）13．DNA的熔解温度（melting temperature T m）14．分子杂交（molecular hybridization）15．环化核苷酸(cyclic nucleotide)（二）填空题1．DNA双螺旋结构模型是_________于____年提出的。
2．核酸的基本结构单位是_____。
3．脱氧核糖核酸在糖环______位置不带羟基。
4．两类核酸在细胞中的分布不同，DNA主要位于____中，RNA主要位于____中。
5．核酸分子中的糖苷键均为_____型糖苷键。
糖环与碱基之间的连键为_____键。
核苷与核苷之间通过_____键连接成多聚体。
6．核酸的特征元素____。
7．碱基与戊糖间是C-C连接的是______核苷。
8．DNA中的____嘧啶碱与RNA中的_____嘧啶碱的氢键结合性质是相似的。
9．DNA中的____嘧啶碱与RNA中的_____嘧啶碱的氢键结合性质是相似的。
10．DNA双螺旋的两股链的顺序是______关系。
11．给动物食用3H标记的_______，可使DNA带有放射性，而RNA不带放射性。
12．B型DNA双螺旋的螺距为___，每匝螺旋有___对碱基，每对碱基的转角是___。
核酸的物理化学性质
第15章、核酸的物理化学性质（上册P502）本章重点：1、核酸的水解，2、核酸的紫外吸收，3、核酸的变性和复性本章的主要内容：（一）核酸的水解：所有糖苷键和磷酸酯键都能被水解。
（1）酸水解：糖苷键比磷酸二酯键易被水解，嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱更易水解。
（2）碱水解：磷酸酯键易水解，RNA比DNA易水解，因为RNA核糖上有2‘-OH，水解过程见P502。
（3）酶水解：为水解磷酸二酯键的酶，专一水解核酸的为核酸酶。
1.核酸酶的分类：按底物专一性分为RNase（核糖核酸酶）和DNase（脱氧核糖核酸酶）。
按对底物作用方式分为内切酶（作用点在核糖核酸酶内部）和外切酶（作用点在末端）。
2.RNase：如牛胰核糖核酸酶（EC 2.7.7.16），内切酶，作用位点为嘧啶核苷（Py）-3‘-磷酸与其他核苷酸之间的连键。
3.限制性内切酶：为DNase。
剪裁DNA的工具，可用于核酸测序和基因工程。
在细菌中发现，目前已找到限制性内切酶数千种。
限制性内切酶往往与甲基化酶成对存在，自身酶作用位点的碱基被甲基化，内切酶不再降解，因而可识别和降解外源DNA。
断裂位点处常有二重旋转（轴）对称性（回文结构，正读反读相同），在特定位点两条链切断后形成粘末端或平末端。
限制性内切酶命名：如E. coR Ⅰ，第1个字母E(大写)，为大肠杆菌(E.coli)属名的第一个字母，第2、3两个字母co（小写）为种名头两个字母，第4个字母R，表示菌株，最后一个罗马字为该细菌中已分离这一类酶的编号。
（二）核酸的酸碱性质：核苷和核苷酸都是兼性离子，碱基和磷酸基均能解离，见P505，具有酸碱性。
由于DNA酸碱变性，使酸碱滴定曲线不可逆。
（三）核酸的紫外吸收：嘌呤环与嘧啶环具有共轭双键，核苷和核酸的吸收波段在240~290nm，最大吸收值在260nm附近（蛋白质最大吸收值280nm）。
（1）可用于测样品纯度（测吸光度A）：A260/A280比值，纯DNA应大于1.8，纯RNA应达到2.0，若样品混有杂蛋白，比值明显降低。
第15章核酸的物理化学性质和研究方法
沉降系数(S)增加 沉降系数 增加
（二）核酸的复性 1、变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的 过程。将热变性的DNA骤然降温， DNA骤然降温 过程。将热变性的DNA骤然降温，不能复性形成无规则线 如缓慢降温，可以复性，叫退火。 团，如缓慢降温，可以复性，叫退火。 2、影响复性速度的因素： 、影响复性速度的因素： 浓度越高,复性越快 （1）单链片段浓度 浓度越高 复性越快 ）单链片段浓度,浓度越高 片段越大,扩散慢 （2）单链片段的大小 片段越大 扩散慢，错配频率高，复 ）单链片段的大小,片段越大 扩散慢，错配频率高， 性越慢 片段内重复序列的多,复性快 （3）片段内重复序列的多少 片段内重复序列的多 复性快 ）片段内重复序列的多少,片段内重复序列的多 （4）溶液一定的离子强度 能消除磷酸基负电荷造成的斥 ）溶液一定的离子强度,能消除磷酸基负电荷造成的斥 可加快复性速度. 力,可加快复性速度 可加快复性速度 在一定条件下复性的速度可用Cot1/2来衡量，Co为完全变 来衡量， 为完全变 在一定条件下复性的速度可用 来衡量 性时的初始浓度，以核苷酸的摩尔浓度表示， 为时间 为时间(s)， 性时的初始浓度，以核苷酸的摩尔浓度表示，t为时间 ， Cot1/2表示复性一半的 表示复性一半的Cot值 表示复性一半的 值
90
70
75
80 T /℃
85
2、影响Tm的因素 、影响 的因素
的相对含量高Tm高 已知 已知Tm,依据经验公式求 （1）G-C的相对含量高 高,已知 ） 的相对含量高 依据经验公式求 G-C的含量或 值：（G+C）% =（Tm — 69.3）× 2.44 的含量或Tm值 G+C） =（ 69.3） 的含量或 较低。 （2）溶液离子强度低的介质中，Tm较低。 ）溶液离子强度低的介质中， 较低 变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键， （3）变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱 基堆积， Tm下降 下降。 基堆积，使Tm下降。 高时,溶液中的 可取代T的 与 （4）溶液的 ： pH高时 溶液中的 ）溶液的pH： 高时 溶液中的OH可取代 的O与A 可取代 形成化学键.所以 大于11.3时DNA完全变性；pH低时 溶 形成化学键 所以pH大于 时 完全变性； 低时,溶 所以 大于 完全变性 低时 液中的H+可取代 可取代A的 与 形成化学键 所以低于5.0时 形成化学键.所以低于 液中的 可取代 的H与T形成化学键 所以低于 时 DNA易脱嘌呤 易脱嘌呤. 易脱嘌呤 （5）均质 ）均质DNA（polyA-T）或（polyG-C)熔链温度发生 （ ） 熔链温度发生 在一个较小的范围内，异质DNA熔链温度发生在一个较 在一个较小的范围内，异质 熔链温度发生在一个较 宽的范围内。 宽的范围内。
生物化学第14章核酸的物理化学性质和第15章核酸的研究方法
核酸中磷酸基的解离
核苷酸的解离曲线Ⅰ
核苷酸的解离曲线Ⅱ
尿苷酸的碱 基的碱性极 弱 ， 实际上 测不出其含 氮环的解离 曲线 ， 故不 能形成兼性 离子。 离子。
从中间往 两边滴为 曲线Ⅰ， 非缓冲区 较宽。 较宽。
小 滴 定 曲 线 的 腺
DNA
牛 胸
从两边往 中间滴为 曲线Ⅱ， 非缓冲区 较窄。 较窄。
式中A为测得的吸光度 ， 为磷的浓度 为磷的浓度， 为比 式中 为测得的吸光度， c为磷的浓度 ， L为比 为测得的吸光度 色杯的厚度， 为每升溶液中磷的重量 为每升溶液中磷的重量（ 色杯的厚度，W为每升溶液中磷的重量（克）。
DNA的增色效应和减色效应
一 般 天 然 DNA 的 ε(P) 为 ～ 6600 ， RNA 为 7700～ 7800。 单链核酸的 ～ 比双链核酸的大， 。 单链核酸的ε(P)比双链核酸的大 ， 比双链核酸的大 核苷酸单体的ε(P)更大 。 双链 更大。 双链DNA变性成单链 核苷酸单体的 更大 变性成单链 值增大， 后ε(P)值增大，称为增色效应；复性后 值增大 称为增色效应；复性后ε(P)值减 值减 称为减色效应。 小 ， 称为减色效应 。 这是因为双链结构使碱基 对的π电子云发生重叠，减少了对紫外光的吸收。 对的 电子云发生重叠，减少了对紫外光的吸收。 电子云发生重叠
GC对含量与熔点的关系
RNA的热变性曲线
RNA只有局部的双螺旋，所以其Tm较低，变 只有局部的双螺旋，所以其 较低， 只有局部的双螺旋 较低 性温度范围较宽。不管是DNA还是 还是RNA，加入甲 性温度范围较宽。不管是 还是 ， 酰胺可降低其Tm值。双链 值 双链RNA的变性曲线几乎与 酰胺可降低其 的变性曲线几乎与 双链DNA相同。 相同。 双链 相同
核酸的物理化学性质和常用的研究方法
25
七、聚合酶链反应（PCR）
2、优化反应条件 包括模板、引物、 dNTP、DNA聚 合酶和Mg2＋，PCR中常用的聚合酶是 Taq DNA聚合酶 3、 选择热循环温度 PCR 过程的温度控制十分关键。 热循环温度：变性温度，退火温度（低 于引物Tm值的2-3℃），延伸温度
A：光吸收值 C：磷的摩尔浓度 L：比色杯内径 W：每升溶液中磷的重量（g）
4
一、核酸的紫外吸收
DNA的ε(P)：6600 RNA的ε(P)：7700-7800
核酸的ε(P)比核苷酸单体低 单链多核苷酸的ε(P)比双螺 旋多核苷酸的ε(P)要高 增色效应：核酸变性时， ε(P)增加 减色效应：当核酸复性时， ε(P)降低
第十九章
核酸的物理化学性质 和常用的研究方法
1
核酸的物理化学性质
天然DNA分子细丝状的双螺旋结构 赋予DNA一系列显著的物化特性： 极大的粘度； 易于断裂； 易形成纤维状物质； 在稀盐溶液中热变性； 熔点高 RNA分子没有如此明显的物化特性
2
一、核酸的紫外吸收
1、核酸具有紫外吸收 吸收范围：240-290 nm λmax = 260nm （定量测定） 2、根据紫外吸收判断样品纯度 不纯的样品
29
九、DNA的限制酶图谱
细菌内有二种不同功能的酶(Arber等) ： 限制性内切酶：识别并水解DNA的某特 定碱基序列 修饰酶(甲基化酶)：识别限制酶识别的碱 基顺序并将其甲基化 被甲基化了的DNA不会被限制酶降解， 所以细菌自身的DNA不会被自身酶降解。 而当异源DNA侵入细胞时，就会被限制酶 降解
(完整版)核酸的理化性质.doc
第 15 章、核酸的物理化学性质（上册 P502）本章重点： 1、核酸的水解， 2、核酸的紫外吸收， 3、核酸的变性和复性本章的主要内容：（一）核酸的水解：所有糖苷键和磷酸酯键都能被水解。
（1）酸水解：糖苷键比磷酸二酯键易被水解，嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱更易水解。
（2）碱水解：磷酸酯键易水解， RNA 比 DNA 易水解，因为 RNA 核糖上有 2‘ - OH ，水解过程见P502。
（3）酶水解：为水解磷酸二酯键的酶，专一水解核酸的为核酸酶。
1.核酸酶的分类：按底物专一性分为 RNase（核糖核酸酶）和 DNase（脱氧核糖核酸酶）。
按对底物作用方式分为内切酶（作用点在核糖核酸酶内部）和外切酶（作用点在末端）。
2.RNase：如牛胰核糖核酸酶（ EC 2.7.7.16 ），内切酶，作用位点为嘧啶核苷（ Py）‘- 3 - 磷酸与其他核苷酸之间的连键。
3.限制性内切酶：为 DNase。
剪裁 DNA 的工具，可用于核酸测序和基因工程。
在细菌中发现，目前已找到限制性内切酶数千种。
限制性内切酶往往与甲基化酶成对存在，自身酶作用位点的碱基被甲基化，内切酶不再降解，因而可识别和降解外源 DNA 。
断裂位点处常有二重旋转（轴）对称性（回文结构，正读反读相同），在特定位点两条链切断后形成粘末端或平末端。
限制性内切酶命名：如 E. coR Ⅰ，第 1 个字母 E( 大写 ) ，为大肠杆菌 (E.coli)属名的第一个字母，第2、 3 两个字母co （小写）为种名头两个字母，第 4个字母R，表示菌株，最后一个罗马字为该细菌中已分离这一类酶的编号。
（二）核酸的酸碱性质：核苷和核苷酸都是兼性离子，碱基和磷酸基均能解离，见P505，具有酸碱性。
由于 DNA 酸碱变性，使酸碱滴定曲线不可逆。
（三）核酸的紫外吸收：嘌呤环与嘧啶环具有共轭双键，核苷和核酸的吸收波段在240~290nm，最大吸收值在 260nm 附近（蛋白质最大吸收值280nm）。
第15章 核酸的物理化学性质和研究方法
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
降解：核苷酸骨架上 ， 磷酸二酯键的断裂 降解：核苷酸骨架上3’，5 ’-磷酸二酯键的断裂
1. 引起核酸变性的因素
（1）温度；加热到80～100℃ 80～ 温度；加热到80 （2）酸碱度改变 （3）化学试剂：尿素 、甲醛 化学试剂：
核苷酸的解离
由于核苷酸含有磷酸与碱基 为两性电介质， 由于核苷酸含有磷酸与碱基，为两性电介质，它 磷酸与碱基， 们在不同pH的溶液中解离程度不同， pH的溶液中解离程度不同 们在不同pH的溶液中解离程度不同，在一定条件 兼性离子。 下可形成兼性离子 下可形成兼性离子。 核苷酸解离时， 核苷酸解离时，带负电荷的第一磷酸基正好与带 正电荷的含氮环数目相等时的pH即为此核苷酸的 pH即为此 正电荷的含氮环数目相等时的pH即为此核苷酸的 等电点 DNA： DNA：约为 4.0 ~ 4.5 RNA： RNA：约为 2.0 ~ 2.5
第15章 15章 核酸物理化学性质和研究方法
NH2 N
N
N H
N
核酸的一般理化性质
• 核酸为多元酸，具有较强的酸性； 核酸为多元酸，具有较强的酸性； 酸性 • 微溶于水，不溶于有机溶剂 微溶于水， • DNA是线性高分子，粘度极大； DNA是线性高分子，粘度极大； 是线性高分子 • 在260nm波长有最大吸收峰，是由碱基的 260nm波长有最大吸收峰，是由碱基的 波长有最大吸收峰 共轭双键决定的 决定的。 共轭双键决定的。这一特性常用作核酸的 定性、定量分析。 定性、定量分析。
增色效应： 增色效应：核酸发生变性 时，摩尔磷消光系数增加 的现象。 的现象。 减色效应：复性后，摩尔 减色效应：复性后， 磷消光系数又降低的效应。 磷消光系数又降低的效应。
核酸性质
核酸的凝胶电泳
核酸的序列测定 DNA聚合酶链反应 DNA的化学合成
第十五章 核酸的研究方法
一 核酸的分离、提纯和定量测定
核酸制备
总的要求：防止核酸的降解和变性，要尽量保
持其在生物体内天然状态
注意的事项：条件温和，防止过酸、过碱、避
免剧烈搅拌，防止核酸酶作用
P513
第十五章 核酸的研究方法
（一）DNA的分离
Chapter14
核酸的物理化学性质
四
核酸的变性、复性及杂交
（三）、核酸的杂交
2. 常见杂交的类型
（1）Southern blotting （2）Northern blotting （3）Western blotting
（1）. Southern印迹杂交
将在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的 滤膜上，然后通过与标记的单链DNA或RNA探针的杂 交作用检测这些被转移的DNA片段
经验式: (G-C)%=(Tm-69.3)×2.44
(3)介质中的离子强度 一般在较高的离子强 度时，DNA的Tm值较高，而且熔解过程发生在 一个较小的温度范围之内。
P509
Chapter14
核酸的物理化学性质
四
核酸的变性、复性及杂交
（二）、复性 (renaturation)
变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成为双螺 旋结构，这过程称复性 1. DNA复性的特点：
一、 核酸的水解
二、核酸的酸碱性质
三、核酸的紫外吸收
四、核酸的变性、复性及分子杂交 五、核酸的沉降特性
502
Chapter14
核酸的物理化学性质
核酸理化性质
3.3 核酸的理化性质、分离纯化和含量测定一核酸的分子大小一核酸的分子大小二核酸的溶解度与黏度•核酸微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂•黏滞度：DNA 〉RNA ；dsDNA〉ssDNA•DNA变性，黏度降低三核酸的酸碱性质•核酸是多元酸，具有较强的酸性;•DNA碱基对在pH4.0~11.0之间最稳定•DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5四核酸的紫外吸收天然DNA变性DNA核苷酸总吸收值1232202402602800.10.20.30.4波长（nm ）光吸收123克原子磷消光系数e(p)•以每升核酸溶液中1克原子磷为标准来计算核酸的消光系数，称为克原子磷消光系数e(p)。
e(p)=A/CL•A：吸收值C：每升溶液中磷的克原子数L：比色杯内径厚度•增色效应hyperchromic effect核酸变性时，紫外吸收值e(p)值显著升高，称为增色效应•减色效应hypochromic effect在一定条件下，变性核酸可以复性，此时紫外吸收值e(p)值又回复至原来水平，称为减色效应五核酸的变性、复性和杂交(一) 变性核酸的变性denaturation维持核酸空间结构的作用力氢键和碱基堆积力被某些理化因素破坏，使核酸的空间结构改变，从而引起核酸理化性质和生物学功能的改变。
•增色效应•Tm值•黏度降低•旋光性降低•沉降系数S增加•浮力密度大大增加•对双链DNA进行加热变性，当温度升高到一定程度时，DNA溶液在260nm处的吸光度突然明显上升至最高值，随后即使温度继续升高，吸光度也不再明显变化。
Tm：熔解温度(melting temperature) DNA的Tm值一般在70-85℃之间。
影响Tm值的因素•1.DNA的均一性均质DNA Tm范围小异质DNA Tm范围大•ii. G-C含量G-C含量与Tm值成正比关系G-C含量越高，Tm值越大•iii. 介质中的离子强度•离子强度较低的介质中，D N A的T m较低，范围较宽•离子强度较高的介质中，情况则相反•D N A制品保存在较高浓度的缓冲液(一般1m o l/L N a C l溶液)。
2.3 核酸的物理化学性质.
2、变性的实质
某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力， 使核酸分子高级结构改变、理化性质及 生物活性发生改变。 不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
降解：核苷酸骨架上3’，5 ’-磷酸二酯键的断裂
3、变性因素
高温（一般＞75℃）— 热变性
强酸、碱 — 酸碱变性
甲醛（Agarose中RNA ）
– DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 – RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 – 含杂蛋白及苯酚，降低
3.判断DNA是否变性
四、核酸的变性、复性与杂交
(一) 核酸的变性（denaturation）
1、DNA的变性：
在某些理化因素作用下，DNA双链解 开成两条单链的过程。
CH 2 O
N
-
OH pK 1.5
' 1
-
OH
-
O O P O OH
O O P O O
H
CH 2 O
N
CH 2 O
N
OH
OH
• DNA等电点为4～4.5； • RNA等电点为2～2.5
三、核酸的紫外吸收
• 碱基含有共轭双键
• 最大吸收峰260nm左右
核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔 磷即相当于摩尔核苷酸。
30.98 A P）＝ （ WL
ε：摩尔吸光系数 A：吸收值 W：每升溶液磷重量 L ：比色杯内径
• OD260的应用： 1. DNA或RNA的定量
– OD260=1.0相当于 • 50μg/ml双链DNA • 40μg/ml单链DNA（或RNA） • 20μg/ml寡核苷酸
2.判断核酸样品的纯度
核酸理化性质和研究方法
EcoRⅠ切割位点：
—N-C-T-T-A-A↓-G-N-5’ 5’-N-G↑-A-A-T-T-C-N—
EcoRI
5‘ GAABiblioteka TC 3’5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
3’ CTTAA
G 5’
5‘ GGCC 3’ CCGG
◆作用方式: 外切酶/内切酶
◆键的打开方式： 3’--OH 5’ --OH
核酸外切酶(exonuclease)
3’-核苷
5’-核苷
核酸内切酶(endonuclease)
■ 核酸限制性内切酶
一类专一识别特殊核苷酸序列 水解双链DNA的内切酶。
主要由细菌产生，如E. coli; 专一性极强高度特异的识别位点，这些位点通
核酸的变性(Denaturation)：指核酸的双螺
旋结构中的氢键断裂，成为两条单链的过
程。 核酸变性不涉及共价键(磷酸二酯键)的断
裂，而核酸链的磷酸二酯键断裂称为核酸 的降解。 引起变性的因素:如加热、环境体系氢离子 浓度变化、脲素、胍等。 变性的核酸生物活性丧失。
DNA变性
增色效应：
课程测验
4. 一段双链DNA包含1000个碱基对，其组成中G+C =58%，那么该双链DNA中T的含量是____(10年25 题) : A. 58%; B. 42%; C. 29%; D. 21%.
5. 下列DNA模型中，属于左手螺旋的是____(09年2
4题) : A. Z-DNA; B. C-DNA; C. B-DNA ; D. A-DNA.
3’
5’ GG
5’
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第十五章核酸的物理化学性质和研究方法答案
一．选择题
1-7 ③③②④①④
二．判断题
1-4是否否否
5-9 是是是是是
三．名词解释
cot：是DNA复性的动力学常数，数值上等于单链DNA初始浓度Co和复性完成一1.
1
2
半所需时间的乘积，其大小代表DNA顺序的复杂程度。
2 增色效应：由于DNA变性引起的光吸收增加称增色效应,也就是变性后DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。
四．问答题
1、RNA比DNA更不稳定，为什么？
RNA的磷酸酯键易被碱水解，因为RNA的核糖上有2 ’-OH,在碱作用下形成磷酸三酯，磷酸三酯极不稳定，随即水解产生核苷2’，3’-环磷酸酯。
该环磷酸酯继续水解产生2’-核苷酸和3’-核苷酸。
DNA的脱氧核糖没有2 ’-OH，不能形成碱水解的中间产物，故对碱有一定抗性。
2、何谓变性？是否所有能引起蛋白质变性的因素都能引起核酸变性，或者引起核酸变性的因素都能引起蛋白质变性？
变性作用是指核酸双螺旋结构被破坏，双链解开，从而核酸的天然构象和性质发生改变，但共价键并未断裂。
3、何谓Southern杂交？何谓Northern杂交？它们的原理和用途是什么？
Southern杂交是将凝胶电泳分开的DNA限制片段转移到硝酸纤维膜上进行杂交。
其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。
该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA 指纹分析和PCR产物判断等研究中。
Northern杂交将变性的RNA转移到硝酸纤维膜上，通过分子杂交以检测特异的RNA。
原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
4、琼脂糖凝胶电泳对核酸研究有何用途？
分离DNA分子大小从上百kb到数百bp, 凝胶电泳后可以用嵌合荧光染料显色，凝胶电泳后核酸样品可用多种方法自凝胶上回收。
5、为制备变性胶，常在琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中添加什么变性剂？它们有何用途。
为制备变性胶，常在琼脂糖凝胶中添加氢氧化甲基汞或甲醛，RNA在变性凝胶中电泳时，相对分子质量的对数才与迁移率成反比。
在聚丙烯酰胺凝胶中添加8mol/L尿素或98%甲酰胺，DNA和RNA的二级结构已被破
坏，其电泳迁移率与单链Mr的对数呈理想的反比关系。
6、为什么羟基磷灰石柱呈析能分开单链和双链核酸？
由于核酸的磷酸基可与羟基磷灰石的钙离子作用，从而被吸附其上，这种吸附力决定于核酸的性质，受分子大小的影响较小。
双链核酸分子刚性较强，呈伸展状态，其磷酸基有效分布在表面；而变性或单链核酸分子较柔软，呈无规线团结构，有些磷酸基折叠在分子内。
因此，双链核酸的吸附力比单链强，双链DNA的吸附力比双链RNA强，而DNA-RNA杂交分子的吸附力介于两者之间。
7、简要说明oligo(dT)柱制备poly(A)+mRNA的原理和主要操作步骤。
真核生物细胞的mRNA在3’端通常带有poly(A)尾巴，利用与固体支持物相偶联的寡聚脱氧胸甘酸（oligo(dT)）与poly(A)结合，即可将poly(A)+mRNA从总RNA中分离出来。
步骤：①在高浓度盐的TES缓冲液中将RNA样品上柱，使poly(A)与oligo(dT)结合，洗掉柱上非特异吸附的RNA。
②用不含盐的TES缓冲液将mRNA洗脱。
8、提取DNA和RNA主要应注意什么？目前常用的方法有哪些？
提取DNA时应尽量避免核酸酶和机械切力对DNA的降解作用。
目前较长用的方法是在细胞悬液中直接加入2倍体积含1﹪SDS的缓冲液，并加入广谱蛋白酶最后浓度达100 g/mL，在65℃保温4h,使细胞蛋白质全部降解，然后用苯酚抽提，除净蛋白酶和残留的蛋白质。
含DNA的水相在有盐存在的条件下加二倍体积的乙醇，低温放置使DNA沉淀出来。
DNA制品中含有的少量RNA可用不含DNase的RNase分解除去。
氯化铯密度梯度离心也是实验室制备高质量DNA常用的方法。
制备RNA特别需要注意三点：（1）所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温烘烤，塑料用具经高压灭菌，不能高压灭菌的用具要用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)处理，再煮沸以分解和除净DEPC.试验者应戴消毒手套。
（2）在破碎细胞的同时加入强的蛋白质变性剂使RNase 失活。
（3）在RNA反应体系中加入RNase的抑制剂。
现在常用于制备RNA方法有两个：（1）用酸性胍盐、苯酚、氯仿提取。
（2）用胍盐/氯化铯法。
9、Sanger提出的酶法测定DNA序列的原理是什么？有何划时代的意义？
Sanger提出的酶法测定DNA序列的原理是利用DNA聚合酶，将待测序DNA样品作为模板，在引物和底物（dNTP）其中一种用放射性同位素标记），共分为四组，每组按一定比例加入一种底物类似物（ddNTP）。
它能随机参入合成的DNA链，一旦惨入后DNA合成立即终止。
于是各种不同大小片段的末端核苷酸必定为该种核苷酸，片段的长度也可以代表相应核苷酸的位置。
将各组样品同时进行含变性剂的聚丙烯酰胺凝胶电泳，从放射自显影的图谱可以直接读出DNA的核苷酸序列。
该方法简单快捷，极大的简化了DNA测序的方法。
许多物种的DNA序列得以知道，有利于进一步研究和基因治疗等方面。
现在测序技术的改进现已无需制备单链模板，只需有特异引物，可以直接用双链DNA进行测序。
10、何谓DNA芯片？DNA芯片有何用途？
DNA芯片或称DNA微阵，是以硅、玻璃、微孔滤膜等材料作为承载基片，通过微加工技术，在其上固定密集的不同序列DNA微阵列，一次检测即可获得大量的DNA杂交信息。
DNA芯片的用途十分广泛，它是分析基因组或是其表达信息的重要技术，归纳起来有以下几点: (1)测定基因型、基因突变和多态性
（2）DNA的重建测序（3）测定基因的表达谱。