小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验

小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验

[摘要] 目的:1.通过可移植性小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验，从感性上认识肿瘤侵袭与淋巴道转移的生物学特性，了解肿瘤动物实验模型建立的过程及意义。2.进一步了解动物尸体解剖、组织取材、染色的过程。3.强化科研思维的培养及实验技能的训练。

方法:将高转移力小鼠腹水型肝癌细胞(HCa - F)经 615 小鼠右腋中线皮下接种，定期观察右腋皮下肿瘤的生长和同侧腋窝淋巴结及腹股沟淋巴结肿大情况，并于接种后 21 天处死全部小鼠，取皮下瘤体及双侧腋窝淋巴结，腹股沟淋巴结称重并测量大小，同时观察肿瘤的形态特点，生长方式，肺、肝、肾等脏器，并将瘤体、淋巴结及脏器做切片处理以作染色和镜下观察。

结果:21 天观察，实验使用 10 只小鼠，最终存活 8只，其中形成肿块 7 只（3只形成的肿块较大），成瘤率 70%，淋巴结转移率 70%。肉眼观察，较大肿瘤 2*1.5*1.3cm，灰白色，质地较硬，从中间切开，发现肿块大部分坏死，中心部分出现腔，腔内有肿瘤坏死物质。镜下观察，坏死组织粉染，轮廓尚存。残存肿瘤组织细胞存在异型性：瘤细胞大小和形态不一致，细胞核体积增大并呈现多形性，核浆比增大。核的大小、形状和染色不一。核分裂象增多，核浆比失调，胞浆减少。结论:高转移力小鼠腹水型肝癌细胞通过淋巴道转移，无器官转移，且具有高转移力。

[关键词]HCa-F（高转移力小鼠腹水型肝癌细胞); 615小鼠; 高淋巴道转移[前言]研究背景:原发性肝癌的发生率地区差异大，在亚非国家较常

见，我国的发病率较高，属于常见的肿瘤之一。近年来，我国对肝癌的防治研究取得了明显的成绩，一些直径在1cm一下的小肝癌已被发现并及时治疗取得满意的疗效[1]。随着临床治疗经验的积累，逐渐意识到即使是小肝癌根治性切除，转移复发仍然是一个十分严峻的问题，术后 5 年复发率可高达 50% 。

存在的问题:本次试验采用的方法是将瘤细胞移植于615小鼠右腋中线皮下，观察肿瘤生长及转移状态[2]。所以移植瘤没有展现自发性肿瘤从正常组织转变成肿瘤、随后出现转移的全过程,没有了解疾病完整的自然史。

实验的意义:为了探究肝癌的实质性问题，即肿瘤本身的生物学特性，尤其是其转移的生物学特性，本次试验对肝癌转移的生物学行为进行实验性研究。即将肿瘤细胞直接接种到小鼠的皮下组织然后观察肿瘤细胞在小鼠体内的生长及转移情况。它基本上模拟了从肿瘤生长到转移瘤形成的一系列步骤，又涉及宿主的反应性，因此结果可靠，近似于临床病人的实际情况，对提高恶性肿瘤患者的生存率和预后有重要的意义[3]。

[正文]

一、材料

1、细胞系：高转移力小鼠腹水型肝癌细胞，由大连医科大学病理教研室建株并保存。

2、实验动物：近交系615小鼠，雌雄兼用，6-8周龄，体重18-22g，由大连医科大学实验动物中心提供。

3、主要试剂及器皿搪瓷盆、温度计、离心管、1ml注射器、手术刀、眼科手术剪、眼科手术镊、乳胶手套、生理盐水、1%来苏儿溶液、75%酒精棉、10%甲醛固定液等。

二、方法

1、细胞系获取从液氮罐中取出高转移力小鼠腹水型肝癌细胞（Hca-F）塑料冷冻管，立即放入40摄氏度的温水中，1分钟内是冷冻液全部融化，立即送入无菌室。取出细胞悬液放入离心管中，用生理盐水洗涤2次，离心，弃上清，再加1ml生理盐水吹打均匀。向小鼠腹腔内接种0.2mlHCa-F细胞悬液，于第6天无菌条件去腹水。

2、615小鼠皮下接种肿瘤细胞取615小鼠癌性腹水0.1ml，内含2*106 个活瘤细胞，接种于615小鼠右腋中线皮下。局部严格消毒。选择右腋皮下接种。定期检查右腋皮下肿瘤生长和同侧腋窝淋巴结及腹股沟淋巴结肿大情况，于接种后21天处死全部小鼠，取皮下瘤体及双侧淋巴结称重，同时观察肺、肝、肾等脏器。将上述组织固定于10%甲醛固定液中，石蜡包埋制片，HE染色，显微镜观察。

3、组织取材将皮下瘤体、淋巴结、肺、肝、肾选取病变部位，切成2~3mm的小于2cm*1cm大小的组织块，10%中性甲醛固定。小块组织一般固定数小时，较大标本需固定24~48小时。经冲洗（用递升浓度的酒精等）、透明（用二甲苯等）、浸蜡（用石蜡），然后用石蜡将组织包埋成蜡块，再经切片机切片和染色制成切片。一般常规作苏木精-伊红染色。

4、切片染色石蜡切片法、HE染色法。

⑴脱水程序及时间：组织固定，冲洗，然后：

1）脱水：以下列顺序进行：60%酒精30分钟→80%酒精1~2小时→95%酒精2~4小时或过夜→95%酒精2~4小时→100%酒精2~4小时→100%酒精2~4小时或过夜。

2）透明：二甲苯I 30~45分钟；二甲苯Ⅱ 30~45分钟。

3）浸蜡。蜡碗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（各30~45分钟）；包埋。

4）修蜡块：修蜡块，贴号。

5）切片。

6）烘烤。烘烤切片60~70摄氏度，1小时。

7）染色。

⑵HE切片染色程序与方法

1）切片脱蜡水洗：将烘干的切片浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5~10分钟。

无水酒精3-10分钟（消除二甲苯）→95%酒精1~3分钟→80%酒精1~3分钟→70%酒精1~3分钟→50%酒精1~3分钟→自来水冲洗5分钟以上（洗去切片上的酒精，切片透明）→蒸馏水清洗（防止污染苏木精染液）。脱蜡是水化过程，目的是通过酒精的缓冲作用，易于水洗与染色。因为染剂是水，从无水酒精直接放入染液中，容易引起激烈的扩散作用，造成切片漂浮脱落或损伤组织。

而经各级浓度酒精缓冲后即可避免发生这种现象。

2） HE染色苏木精-伊红染色是先用苏木精将组织切片适当的过染，经水洗后再用盐酸酒精分化，弱碱性水溶液显蓝。使胞核呈明显的蓝色，胞质及背景无色。再经水洗后用伊红染胞质，染

成深浅不同程度的粉红色至红色。

苏木染色（染核）5~15分钟→自来水冲洗3~5分钟→0.5%盐酸酒精溶液分化数秒钟→自来水洗1~5分钟→弱碱性水溶液显蓝30~60秒→自来水冲洗5~10分钟→蒸馏水洗1~2次→伊红1分钟→蒸馏水洗1~2次。

3）脱水、透明、封固：脱水、透明的目的是使存留在切片上的水分及漂浮的染色液全部除净，经透明剂的作用后，将脱水剂清除出来，使切片产生适宜的折光率。最后用盖玻片及封固剂封固，便于观察和长期保存。

80%酒精30~40秒→95%酒精30~60秒→无水酒精Ⅰ1~5分钟→无水酒精Ⅱ1~5分钟→二甲苯Ⅰ1~5分钟→二甲苯Ⅱ1~5分钟→中性树胶封固。

5、镜下观察。

三、结果

21天观察10只小鼠，最终存活8只，其中形成肿块7只，3只形成的肿块较大。成瘤率70%，淋巴结转移率70%。肉眼观察：淋巴结较正常增大，皮下瘤体较大，与皮下组织粘附紧密，肝和肾脏可见肿瘤结节，较大肿瘤2*1.5*1.3cm，灰白色，质地较硬，从中间切开，发现肿块大部分坏死，中心部分出现腔，腔内有肿瘤坏死物质。镜下观察，坏死组织粉染，轮廓尚存。残存肿瘤组织细胞存在异型性：瘤细胞大小和形态不一致，细胞核体积增大并呈现多形性，核浆比增大。核的大小、形状和染色不一。核分裂象增多，核浆比失调，胞浆减少。