蛋白酶产生菌的紫外诱变育种

蛋白酶产生菌的紫外诱变育种

xxxx大学生命科学学院生物工程第一组

前言: 因为自发突变率小，以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效是紫外，紫外诱变一般采用15w的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。

本次实验通过比较对照组和紫外诱变1min、5min、10min的实验组菌落的生长情况和水解圈的情况，可以很好的了解紫外诱变的效果。初步的说明诱变育种为筛选高效，稳定的菌种提供了有效可能的方法。

1 实验材料与方法

1.1 材料

1.1.1样品：老师提供的生长较好的菌液

1.1.2培养基及其配制

1）液体培养基：牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，NaCl 1.0g，pH7.0～7.5，H2O 定容至100ml。配好50ml/三角瓶，分装两瓶每瓶50ml.包扎112℃，灭菌30min。

2）固体培养基（300ml）:牛肉膏0.9g，蛋白胨3g，NaCl 3g，H2O 定容300ml，pH值7.0。配好后，按100ml/瓶分装三瓶, 分别称取1.5g琼脂条塞入三角瓶，包扎，112℃，灭菌30min。

取牛奶粉25g用250ml水溶解，包扎，116℃，灭菌15min。按10%分别加入上述3个三角瓶中，每个三角瓶10ml。混匀后，倒平板。

1.1.3生理盐水：取Nacl 1.8g 溶解在200ml的水中，即配制0.9%的生理盐水。

1）每支试管中加入4.5ml蒸馏水，塞上试管塞，22支试管分4组分别包扎；

2）剩下的生理盐水装入三角瓶包扎；

112℃灭菌30min。

1.1.4器材

血球计数板，显微镜，紫外诱变箱，红灯泡，

移液管，涂布棒，含有7颗玻璃珠的空三角瓶等，112℃灭菌30min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培养

从老师给的菌悬液各取50ul接入2个液体培养基，37°C，220rpm，震荡培养过夜。

1.2.2出发菌株菌悬液的制备

1）取出发酵培养基，从生长良好的一瓶取20ml倒入50ml离心管中5000转离心5分钟，弃上清，倒扣离心管于滤纸上吸干残留培养基；

2）加30ml无菌生理盐水，重新震荡悬浮菌体，再离心，弃去上清；重复一次；

3）重复上述步骤加入5ml生理盐水恢复成菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数，逐步添加生理盐水调整细胞浓度为108/mL；

4) 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内，振荡10~20min，以打散细胞；

5）取0.5ml 菌悬液进行10-1——10-7稀释分离，取10-5、10-6、10-7三个稀释度，每一梯度取100ul

菌液涂布平板，37℃倒置培养24h。

1.2.3 蛋白酶产生菌株的紫外诱变

1）将紫外灯打开，预热30min；

2）取三个无菌空培养皿，加入菌悬液5ml；

3）将待处理的培养皿置于诱变箱内，轻轻晃匀后打开皿盖，分别处理1min、5min、10min，照射完毕后先盖上皿盖，再关闭紫外灯；

4）分别取0.5ml处理后的菌液进行10-1——10-5稀释分离，取10-3、10-4、10-5三个稀释度。每个样品的每一梯度取100ul菌液涂布平板，待菌液干后用黑色包装袋包好37℃倒置培养24h.（避光培养），做好标记。

诱变过程在暗室红灯下进行。

1.2.4 实验结果观察

观察和比较对照组和3个实验组的单个菌落情况，稀释梯度生长情况，以及水解圈大小。

2 实验结果与分析

在对照组与紫外5min诱变中都出现了较好的单个菌落，并且菌落数随着稀释度的增加而减少；以及各个培养基中都出现了较明显的水解圈。如下图：

3 实验讨论

因为基因突变具有不定向性。因此在此紫外诱变的过程中，是否产生高产，稳定的蛋白酶产生菌，须做进一步的实验。将紫外诱变后的突变菌株与野生型菌株经行酶活比较。才能判断和筛选出正向突变的菌株。