克隆技术2
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韩国科学家培育出首只克隆狗 2005年08月05日 09:06 北京晨报
“斯纳皮”“博纳”喜结良缘 ,为科学 “献身”
克隆技术的意义
• 一切科学活动都是为人类服务 • 获取干细胞 • “治疗性克隆”
人类胚胎核移植技术
2001年11月,美国科学家宣布首次克隆成功了处于 早期阶段的人类胚胎,称其目标是为病人“定制” 出不会诱发排异反应的人体细胞用于移植。
动 物 细 胞 克 隆
动物细胞克隆
• 广义的动物克隆有:胚胎分 割、卵裂球分离、孤雌激活、 细胞核移植等,
• 狭义的克隆技术往往指:核 移植技术
ຫໍສະໝຸດ Baidu
细胞核移植
• 是指将早期胚胎、胎儿或成体动物的细 胞核移植到去核的卵母细胞中,重新组 成重构胚并使之发育成成体动物的过程。
细胞核移植
将早期胚胎、胎儿或成体动物的细胞核 移植到去核的卵母细胞中,重新组成重 构胚并使之发育成成体动物的过程。
植 物 细 胞 克 隆
1902年,德国植物学家 Haberland指出,植物的体 细胞具有母体全部遗传信 息,具有发育成完整个体 的潜能,因而每个细胞都 可像种子那样,经离体培 养再生成完整植株。
1958年,Steward成功将一个胡 萝卜细胞在试管中培养,长成 一株具有根、茎、叶等器官的 完整植株。
童第周
细胞质对细胞核的影响的研究
以金鱼和螃蜱鱼为材料,进行鱼类不同亚科 细胞核移植获得成功 将黑斑蛙的红细胞的核移入事先除去了核 的黑斑蛙卵中,这种换核卵最后长成能在 水中自由游泳的蝌蚪。
没有外祖父的癞蛤蟆
• 朱冼(1900~1962),中国实验生物学家, 第一届中国科学院院士。 • 1959年,第一批脊椎动物无性系问世。 世界首次实验证实: 人工单性生殖的子代具有繁殖后代的能力
哺乳动物胚胎细胞核移植技术
胚胎细胞核移植技术
• 胚胎细胞核移植 (embryo cell unclear transplantation)技术。将一个早期胚胎的 细胞核移植到去核的卵母细胞中,构建新合 子的生物技术,通常将提供细胞核的细胞称 为供体,接受细胞核的卵母细胞称为受体。
1977年,生物学家霍佩(P. C. Hoppe )和显微外科专家 伊尔门斯( K. I. Illmense) 首次对小鼠卵进行核移植获 得成功
2004年2月11日,美国《科学》杂志宣布,汉城国立大 学研究小组成功克隆出人类早期胚胎,并从中提取出 胚胎干细胞。
解决办法
1.体细胞核移植----解决供核困难 2.异种胚胎核移植----解决核受体胚胎来源 困难
异种核移植
病人的体细胞作为核供体,另一种 动物的卵母细胞为受体细胞而进行 的核移植技术。
在无菌的培养皿中做4个100ul左右 的培养液滴(含10%FBS的M2), 上覆盖灭菌石蜡油,置38.5℃、5% CO2饱和湿度的CO2培养 箱中平衡 备用。
去核的方法
1.直接穿刺法 a.盲吸法 b. 半卵法 C.用DNA荧光染料对卵母细胞染色,然后在荧光 监视下去核。 2.功能性去核,即将卵母细胞置于用荧光燃料配 置的溶液中,用紫外线照射使核失去功能,此法 可达到完全去核,但在完全去核的同时,是否对 非遗传物质或细胞质主要成分有影响,尚有待 于进一步研究。
• 此后,胚胎细胞的核移植在多种动物上获得了 克隆后代: • 绵羊(Willadsen等,1986), • 牛(Prather等,1987), • 兔(Stice等,1988), • 猪(Prather等,1989), • 山羊(张勇等,1991)等。 • 1997年,由 Meng et al成功地克隆出两只猴,这 是灵长类动物的首次被克隆。
绵羊“多莉” 整个克隆过程如下:
母绵羊A 母绵羊B
乳腺细胞 (体细胞)
未受精的 卵细胞
细胞融合
去核卵细胞 新的卵细胞发育成胚胎
提取细胞核
胚胎移植
母绵羊C
“Dolly Parton”
• 1998年7月,美国夏威夷大学Wakayama等报 道,由小鼠卵丘细胞克隆了27只成活小鼠,其 中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代,这是继 “多莉”以后的第二批哺乳动物体细胞核移植 后代。 • 此后,体细胞核移植技术在牛、山羊、猪等多 种动物获得成功。 。 • 至1999年底,全世界已有6种类型细胞——胎 儿成纤维细胞、乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管 /子宫上皮细胞、肌肉细胞和耳部皮肤细胞的 体细胞克隆后代成功诞生。
显微操作
将脱去颗粒细胞的卵母细胞用含7.5ug/ml CB的M2 培养液清 洗3-4遍后移入100ul左右的上述溶液的液滴中,同时将供体 细胞加入液滴中。石蜡油覆盖后于显微操作仪上用固定针吸 住卵母细胞,用去核针拨动之,使第一极体位于12点位置; 去核针从两点处进针,针尖斜面部分刺入卵泡内,吸出第一 极体及其下方的1/4-1/3胞质(包括细胞核);然后从操作液 中吸取形态圆,边缘略粗糙的核供体细胞,从原针吸口处注 入透明带下并轻压透明带。
核移植分类
根据核供体细胞来源的不同 1.胚胎细胞的核移植 2.体细胞的核移植 根据供体细胞与受体细胞是否来 于同一种动物又可将其分为 1.同种核移植 2.异种核移植两类。
低等动物胚胎核移植技术
Hans -Spermann transplantation expriment
1938年 Hans Spemann
核供体细胞的准备方案
• 罗斯林方案:在培养细胞达到50%-70%汇合时, 将培养液中的血清从正常浓度(多为10%)降到 0.5%,并继续培养3-8天, 然后再消化脱壁用于 核移植 • 马塞诸塞方案:培养细胞达到70%-80%汇合时 直接将细胞消化脱壁用于核移植 • 檀香山方案:直接从新鲜组织分离供体细胞 • 北京方案:将培养细胞冷藏备用的方案
低等的无脊椎动物中---常见 脊椎动物---未见
克
隆(3)
第一个时期是微生物克隆—细菌增殖
第二个时期是生物技术克隆—DNA克隆
第三个时期是动物克隆—细胞克隆成一个 动物
克隆技术的里程碑
克隆羊多莉(Dolly)的诞生: 1997年2月,英国Roslin研究所宣布克隆 羊多莉( Dolly )的诞生揭示一个全新概 念:由成年机体的一个体细胞核,可以复 制一个基因完全相同的新生命个体。
2004年01月24日 07:29 北京青年报
中国首例异体克隆动物———克隆濒危动物
北山羊在新疆乌鲁木齐县六十户乡降生
非人类哺乳动物卵母细胞可否 对人体细胞进行重编程?
人-兔异种体细胞核移植构建重构胚
MⅡ期兔卵母细胞 人颗粒细胞、皮肤成纤维细胞
显微操作去除核及极体
体外培养传代、冷冻保存
将单个体细胞注射入卵周隙
人成纤维细胞准备
成年女性颈部手术(1:1000新洁 尔灭消毒)时所留取的皮肤约1 cm2, 立 即 于 7 5 % 酒 精 中 浸 泡 1 2min,随后于含双抗的生理盐水中 冲洗2-3遍,最后放入上述生理盐 水中带回实验室。
A 组织块培养的人皮肤成纤维细胞
B 消化培养的人皮肤成纤维细胞
显微操作皿的准备
细胞核
去核卵母细胞
核移植重构胚
• 正常情况下,早期胚胎发育是由母源遗传的 RNA和蛋白质所控制的,发育到一定阶段后,合 子核开始控制基因的表达,由母型基因调控向合 子型基因调控的顺利过渡是动物早期胚胎进一 步正常发育的必要内在条件之一。 • 早期胚胎发育中的基因印记。
印迹基因
基因印迹意义
在进化论上,在于有效防止单性生殖, 维持了遗传多样性,但增加了隐性突变 转为显性危险性。
电融合 激活 体外培养
遗传物质鉴定
受体细胞准备
• 到目前为止,已有三类用于核移植产生 了后代。 • 第一类是去除原核的合子,此类受体仅 局限于用原核或假原核做供体; • 第二类是早期胚胎; • 第三类即是MⅡ期的卵母细胞。
受体卵母细胞的准备
• 雌性未孕日本大耳兔,体重2500±250克,达到性成熟, 健康状况良好,无急慢性疾病。 • 兔后腿肌肉注射PMSG75IU,72h后静脉注射hCG100 IU,在注射hCG后15-18h耳缘静脉注入空气栓处死兔 子,剖腹剪下输卵管(需无菌操作),用TCM199培 养液从输卵管与子宫连接部进针向输卵管伞端方向冲 洗输卵管,回收卵-冠-丘复合物,将回收的卵-冠-丘复 合物置透明质酸酶液滴中(浓度为2.5ug/ml),用移 液器及适当口径的玻璃移液管反复吹打,脱去颗粒细 胞,再于TCM199中洗6-8遍,CO2培养 箱中培养备用。
蝾螈受精卵的结扎实验
分化了的细胞核 移入卵子中能否 指导胚胎发育?
Hans Spemann
Briggs
1952年美国费城癌症研究院 Briggs和 King 两栖类囊胚的细胞核移植
1962年Gurdon的非洲蟾蝌蚪肠上皮细胞核移植到去核蛙卵实验
“童 鱼”
生物遗传性状是细胞核和细胞质相互作用结果 开创了人类按照需要进行人工培养新物种的先例, 对培育动植物新品种具有重大指导的意义 。
克 隆 技 术 Clone Technology
安徽省立医院生殖医学中心 童先宏 Tong68xianhong@163.com
克
隆(1)
1903年,美国植物生理学家韦柏(Webber)在《科学》 杂志上定义为:“用植物的营养器官部分,如块茎、 球茎、枝条、芽等无性繁殖所得到的品系”。
克
隆(2)
即由同一个祖先细胞分裂而形成的 纯细胞系,这个细胞系每个细胞的 基因彼此是相同的。
哺乳动物体细胞核移植技术
动物克隆技术的里程碑
体细胞核移植技术
(somatic cell unclear transplatation)
将分化程度较高的体细胞移植入去核的卵母细胞中构建新合子的生物技术。
Hello Dolly!
§ In 1997, at the Roslin Institute in Scotland, Dolly was born. She was a clone of her mother, a white-faced sheep. § Her surrogate mother was this black-faced ewe. § Unfortunately, Dolly died on February 14, 2003 due to lung disease. She also had arthritis. Scientists are investigating whether she aged prematurely since she was a clone with “old” DNA
只有早期胚胎尚 具有全能性,到 囊胚以后则随着 分化而逐渐丧失 其全能性。
个体发生、发育
一个精子和一个卵子的结合(即受精), 恢复二倍体,从而开始了一个个体的发育。 在胚胎发育过程中,由一个受精卵来源的 细胞开始分化。它们有一些专门发育为肌 肉细胞,有一些发育为神经细胞,还有发 育为血细胞等。
在哺乳动物胚胎发育过 程中,细胞发生了分化, 已分化的细胞能否重新恢 复到发育的起始状态? 能否重新发育成其它类 型细胞组织? 甚至发育成完整个体的 全能性呢? 细胞的分化是不是发生 了不可逆的变化?
Kaguya
辉夜姬
辉 夜 姬
“辉夜姬”
maternal maternal
“辉夜姬”和它的一窝鼠宝宝
核移植成功的关键
• 核移植基本技术。 • 供体核DNA的正确复制和重编程。 • 核质相互作用---供体核和受体胞质的质 和量。协调供体细胞与受体胞质的细胞 周期对维持重构胚的正确染色体倍性和 阻止DNA的损伤具有重要作用。
核重编程
• 核重编程的过程就是使在体细胞中被关 闭,而在正常胚胎发育中表达的基因重新 被激活的过程.
重编程有三种可能的结果:
(1)供核基因组完全没有进行重编程,重 构胚很快死亡; (2) 部分重编程,重构胚在不同的发育 阶段死亡 (3)完全重编程,产生正常的克隆动物
异种核移植
• 1998年1月,美国威斯康星一麦迪逊大学的科学家们以 牛的卵子为受体,成功克隆出猪、牛、羊、鼠和猕猴 五种哺乳动物的胚胎,这一研究结果表明,某个物种 的未受精卵可以同取自多种动物的成熟细胞核相结合。 • 1999年,美国科学家用牛卵子克隆出珍稀动物盘羊的 胚胎;我国科学家也用兔卵子克隆了大熊猫的早期胚 胎, • 在异种克隆研究领域,目前国际上仅有印度野牛和欧 洲盘羊取得成功。到目前为止应用异种核移植技术获 得的活体后代都来自于亚种间核移植。 • 中国首例异体克隆动物———濒危动物北山羊在新疆 乌鲁木齐县六十户乡降生