高性能淀粉酶菌株的筛选[开题报告]
产淀粉酶菌株的筛选及生理生化性质的鉴定
产淀粉酶菌株的筛选及生理生化性质的鉴定一实验目的及要求：为了从自然界获得产淀粉酶活力较高的菌株,从面粉、储存面仓、发霉玉米等样品中筛选出1株产淀粉酶活力较强的菌，并对产淀粉酶菌的生理生化进行了探讨。
从面粉中得到的产淀粉酶菌共有三种，颜色有红色和白色。
从其菌体形态初步了解其特征，随后用唯一碳源实验、葡萄糖酵解实验、过氧化氢酶实验等分析并鉴定其生理生化特性。
二名词定义：淀粉酶分离鉴定淀粉酶 amylase，AMY,AMS一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α－1，4-葡聚糖，水解α－1，4-糖苷键的酶。
根据酶水解产物异构类型的不同可分为α-淀粉酶（EC3．2．1．1．）与β-淀粉酶（EC3．2．1．2．）。
α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。
微生物的酶几乎都是分泌性的。
此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α-1,4-链。
因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖。
另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1,6-键的α-极限糊精。
一般分解限度以葡萄糖为准是35-50％，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70％分解限度的（最终游离出葡萄糖）。
β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1,4-葡聚糖链。
主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。
对于象直链淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。
作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α-1,6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。
从上述的α-淀粉酶和β-淀粉酶的作用方式，分别提出α-1,4-葡聚糖-4-葡萄糖水解酶（α-1,4-glucan 4-glucanohydrolase）和α-1,4-葡聚糖-麦芽糖水解酶（α-1,4-glucan maltohydrolase）的名称等而被使用。
简答题 设计一个诱变筛选淀粉酶高产菌株的科研方案,并加以必要
简答题设计一个诱变筛选淀粉酶高产菌株的科研方案,
并加以必要
请设计一个实验方案自土壤中筛选能产淀粉酶的枯草芽孢杆菌并进行诱变育种选育高产突变株。
1、取样
选择含淀粉丰富的土壤为最佳
2、无菌水溶解
充分震荡
3、高温处理
60度的高温处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞
4、稀释涂平板
培养基用含淀粉的培养基配制
5、培养
培养1-3天后，观察。
6、初筛与纯化
挑取有降解圈的细菌单菌落，并在平板上纯化3次，然后4摄氏度斜面保存。
7、鉴定
参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用分子生物学手段鉴定，进一步确认是否为枯草芽孢杆菌。
8、复筛
测定其淀粉酶活，最后确定诱变出发菌株
9、诱变
选择合适诱变源，建议采用物理诱变和化学诱变相结合的复合诱变方式。
10、筛选
采用上述初筛和复筛方案进行诱变鉴定
11、遗传稳定性鉴定
筛选出的菌株，要经过多次传代之后，再进一步鉴定其产生淀粉酶的能力是否发生了变化。
如果产生了回复突变，则需要重复诱变筛选过程，直至到筛选出遗传稳定的高产菌株为止。
淀粉酶菌株的筛选和诱变育种
淀粉酶菌株的筛选和诱变育种淀粉酶菌株的筛选和诱变育种[摘要]：本文章中我们利用实验菌株对于淀粉的特异性，用革兰氏碘液，利用平板法筛选出所需菌株和利用紫外线诱变育种，分别对要诱变的菌株进行不同时间的诱变，将在红光的照射下将结果稀释不同倍数，涂到平板上进行暗室培养，48小时后观察，用碘液测酶活力。
[关键词]：淀粉酶；筛选；诱变育种前言:一般情况下，我们要获得目的菌株，一是从自然界中分离纯化，活力普遍较低，较省时省力，二是通过育种的方法，获得目的菌株，而通过人工选育的菌株，则更满足于工业化生产的需要，为我们提供了更好地选择。
要获得所需的高产突变菌株，就要对菌株进行突变处理，突变分为自发突变和诱导突变。
因自发突变的频率较低，所以采用诱导突变。
所谓的诱变就是用物理或化学诱变剂处理均匀分散的细胞群，促使突变率大幅度提高。
然后筛选出目的突变菌株，以供生产实践或科学实验用。
诱变可由化学或物理因素引起，紫外线诱变是最简单、最常用的一种，因此我们选择采用这种方法。
紫外线诱变处理的有效波长为200~300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。
DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。
通过本篇文章，能够让我们进一步了解从自然界中分离淀粉酶菌株的具体的筛选过程与方法并且理解诱变育种的基本原理以及用诱变育种筛选高产目的菌种的基本方法。
正文一、淀粉酶菌株的筛选方案1.1菌种来源：校园土壤1. 2培养基：淀粉培养基：蛋白胨10g，NaCl 5g,可溶性淀粉2g,蒸馏水1000ml,琼脂16g 左右，121℃高压灭菌锅灭菌20min,待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒入摇瓶若干。
实验六十淀粉酶产生菌株的筛选
实验六十淀粉酶产生菌株的筛选实验项目性质：设计性所涉及的知识点：无菌技术、富集培养、纯种分离、淀粉酶性质、酶活测定计划学时：8学时一、实验目的1．掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。
2．巩固以前所学的微生物学实验技术。
3．掌握产酶微生物筛选的方法。
二、实验原理α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。
从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定。
1、取样：即为收集含菌的样品采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。
在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。
在土壤中，数量最多的当推细菌，其次是放线菌，第三霉菌，酵母菌最少。
除土壤以外，其他各类物体上都有相应的占优势生长的微生物。
例如枯枝、烂叶、腐土和朽木中纤维素分解菌较多，厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多，果实、蜜饯表面酵母菌较多；蔬菜牛奶中乳酸菌较多，油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌较多等。
2、细胞分裂培育（又称多样培育）增殖培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。
因此，增殖培养事实上是选择性培养基的一种实际应用。
3、纯种拆分在生产实践中，通常都应用领域纯种微生物展开生产。
通过上述的细胞分裂培育就可以说道我们必须拆分的微生物从数量上的劣势转型为优势，从而提升了甄选的效率，但是必须获得纯种微生物就必须展开纯种拆分。
纯种拆分的方法很多，主要存有：平板划线分离法、吸收分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端研磨法等。
4、性能测定拆分获得纯种这只是稻种工作的第一步。
所分给的纯种与否具备生产上所建议的性能，还必须必须展开性能测量后就可以同意权衡。
淀粉酶高产菌株的筛选及其酶活的测定
2010年第1期3月出版淀粉酶高产菌株的筛选及其酶活的测定Screening and activity determination of the higher activity amylase strain刘杰雄*陈号陆雯朱丽云（中国计量学院现代科技学院，杭州310018）*刘杰雄，男，1989年出生，中国计量学院现代科技学院生物工程专业在读生。
收稿日期：2009-11-16LIU Jie-xiong *CHEN HaoLU Wen ZHU Li-yun（College of Modern Science Technology ，China JiLiang University ，Hangzhou 310018，China ）摘要为了筛选对于淀粉降解效果好的淀粉酶产生菌株，从浙江、山东等地富含淀粉的土壤样品中筛选出1株产淀粉酶活力较强的菌株BSJD10，结合菌落形态、生理生化指标和16S rDNA 序列分析，对其种群形态和个体形态进行观察和鉴定，确定BSJD10为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）。
关键词淀粉酶；枯草芽孢杆菌；鉴定Abstract To screen for the effects of starch degradation of amylase produced good strain.From the soil samples from Zhejiang ，Shandong and other places where rich in starch ，a strong amylase producing strain BSJD10were screened out ，with colony morphology ，physiological and biochemical indicators and 16S rDNA sequence analysis ，its population patterns and individual mor-phology were observed and identificated.Keywords amylase ；bacillus subtilis ；identification 淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制作业、淀粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。
高产淀粉酶菌株的筛选
高产淀粉酶菌株的筛选一：前言1. 掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。
2. 巩固以前所学的微生物学实验技术。
3. 学会筛选高产淀粉酶菌株。
关键词：产淀粉酶、芽孢杆菌、酶活力、筛选1.α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。
2. 从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、富集培养、初步筛选、分离纯化和性能测定。
a) 采样：即采集含菌种的样品采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。
在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。
例如厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多。
b) 富集培养：富集培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。
c) 初步筛选： i. 初筛使用选择培养基对菌种进行培养，通过培养基的特殊成分，来筛选出目的菌种，从而进行培养。
ii. 初筛利用鉴别培养基，通过添加一些特殊的试剂或成分来鉴别出目的菌种，从而筛选出来并对其进行培养。
d) 分离纯化：通过上述的筛选只能说我们要分离的目的菌种已经存在，但还要把夹杂在其中的杂菌除去，从而得到纯种的菌落。
纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。
e) 性能测定：分离纯化得到的菌种之后，所分得的菌种是否具有实验所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。
二、实验材料：接种环、试管、三角瓶、培养皿、移液管、高压蒸汽灭菌锅、玻璃棒、量筒、酒精灯、纱布、棉花、面线绳、恒温培养箱载玻片可见分光光度计显微镜紫外操作台实验试剂：牛肉膏、蛋白胨、淀粉、NaCl、琼脂粉、蒸馏水、卢卡式碘液、95%乙醇、蕃红、革兰氏碘液培养基配制：牛肉膏1.3g、蛋白胨2.5g、NaCl 1.3g、淀粉2g、溶于250mL蒸馏水中，一边加热再慢慢加入5g琼脂粉三：实验步骤1培养基的制备及其仪器的灭菌（1）按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏1.3g、蛋白胨2.5g、NaCl 1.3g、淀粉2g、溶于50mL蒸馏水中，一边加热再慢慢加入5g琼脂粉放入烧杯中。
高产淀粉酶菌株筛选
淀粉酶产生菌的富集培养
①样品采集 用无菌锥形瓶，在栽有土豆的菜园里，从不同的采样点采取土样约 15g 。 （注意应采取距地表2-3cm以下的土样） ②制备土壤稀释液 称取土样 l0g ，放入盛 90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇 20min ，使土样与水充分混合，将菌分散，即为稀释 10-1 的土壤悬液。取 1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从 此试管中吸取lml加入另一盛有 9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推 制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液。 ③涂布平板 取9个筛选培养基，用记号笔在培养皿底部注明稀释度，每种稀释度标记 3 皿，然后用无菌吸管分别由 10-2 、 10-3 、 10-4 、 10-5 、10-6 五 管土壤稀释液中 各吸取0.1ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置，用无菌涂布棒在 培养基表面轻轻地涂满整个平面，室温下静置5-10min。 ④培养 将平板倒置在37℃温箱中培养48h。
引起污染。
培养基的制备
④加塞 培养基分装完毕，在试管口或三角烧瓶口塞上棉塞，以阻止外界 微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。 ⑤灭菌 121℃，20min ⑥搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷至 50℃左右，将试管口端搁置在玻棒或其 它合适高度的器具上，斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。 ⑦倒平板 将灭菌后的培养基冷却到55～60℃倒平板。（倒平板的方法是右手
二
原理
土壤是微生物生活的大本营，是寻 找有重要应用潜力的微生物主要的菌源。 因此本实验选择从土壤中分离出淀粉酶 高产的菌种，再进行纯培养。主要运用 富集培养技术，稀释涂布平板法和平板 划线分离法及无菌操作技术获得我们所 需要的产淀粉酶菌种。淀粉酶作用于淀 粉时，打开了淀粉分子的糖苷键，从而 使淀粉失去粘性，同时使其失去了与碘 的显色反应能力，不再与碘结合，从而 形成透明圈。产淀粉酶菌株在选择培养 基上培养后，会水解淀粉形成水解圈， 加碘液染色后，水解圈尤为明显。
土壤菌株筛选实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握土壤中微生物的分离与纯化方法。
2. 了解不同微生物的形态特征和生理特性。
3. 筛选具有特定生理功能的菌株。
二、实验原理土壤中存在着大量的微生物，包括细菌、真菌、放线菌等。
通过选择合适的培养基和分离方法，可以从土壤中分离出具有特定生理功能的菌株。
本实验采用平板划线法、涂布分离法等方法，对土壤样品进行分离纯化，并对筛选出的菌株进行鉴定。
三、实验材料与仪器1. 材料：土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂糖、无菌水、无菌平板、无菌试管、接种环、显微镜等。
2. 仪器：恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、显微镜等。
四、实验步骤1. 样品处理：取一定量的土壤样品，用无菌水进行稀释，制成10^-3、10^-5、10^-7等不同浓度的土壤悬液。
2. 分离纯化：（1）平板划线法：将不同浓度的土壤悬液涂布于牛肉膏蛋白胨琼脂平板上，用接种环进行划线分离，培养24小时后观察菌落形态。
（2）涂布分离法：将不同浓度的土壤悬液涂布于牛肉膏蛋白胨琼脂平板上，用无菌玻璃棒轻轻涂布，培养24小时后观察菌落形态。
3. 菌落鉴定：（1）形态特征观察：观察菌落的大小、形状、颜色、边缘、表面等特征，记录下来。
（2）生理生化试验：对筛选出的疑似菌株进行生理生化试验，如革兰氏染色、氧化酶试验、过氧化氢酶试验等，以确定菌株的属种。
4. 结果分析：根据形态特征和生理生化试验结果，对筛选出的菌株进行鉴定，并统计不同生理功能菌株的筛选数量。
五、实验结果与分析1. 菌落形态特征观察：在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上，观察到不同形态的菌落，如圆形、卵圆形、长条形等，颜色有白色、黄色、红色等。
2. 生理生化试验结果：（1）革兰氏染色：部分菌株为革兰氏阳性菌，部分菌株为革兰氏阴性菌。
（2）氧化酶试验：部分菌株产生氧化酶，部分菌株不产生氧化酶。
（3）过氧化氢酶试验：部分菌株产生过氧化氢酶，部分菌株不产生过氧化氢酶。
3. 结果分析：根据形态特征和生理生化试验结果，筛选出以下具有特定生理功能的菌株：（1）革兰氏阳性菌：可能为葡萄球菌、链球菌等。
【生物工程专业】【毕业设计文献综述开题报告】产淀粉酶菌株鉴定及酶的制备(可编辑)
【生物工程专业】【毕业设计文献综述开题报告】产淀粉酶菌株鉴定及酶的制备（可编辑）【生物工程专业】【毕业设计+文献综述+开题报告】产淀粉酶菌株鉴定及酶的制备(20届)毕业论文摘要: 从中分离得到一株产菌株，根据菌落形态和常规生理生化鉴定方法对菌株进行鉴定，为了确定该菌株在分类学上的位置，对这一菌株进行16S RNA分子鉴定。
主要是通过16S rNA测序与GenBank中已有的序列比对来鉴定菌种序列比对Bacillusamyloliquefaciens有99%的相似度。
该酶的最适反应温度为60，最适反应pH值为6.0。
关键词: ;;Abstract: A strain of amylase producing was isolated from nature. The strain was identified by the shape and general physiological and biochemical properties. In order to confirm the location in taxonomy,16S rDNA sequence of the strain was sequenced and it had the similarity of 99, with that of theBacius amyloliquefaciens. Amylase which is extracellular in incubation period of the strain can be purified by salt out. The optimum temperature of amylase is 60? and the optimum pHis 6.0.Keywords: amylase; strain identification; preparations ofenzymes目录摘要…………………………………………………………………………………………………… ? Abstract……………………………………………………………………………………………… ?1 绪论 11.1 高产淀粉酶的来源 11.2 菌种鉴定的方法概况 11.3 α-淀粉酶的研究 21.3.1 α-淀粉酶分离纯化方法的研究 21.3.2 α-淀粉酶活力测定方法的研究 31.4 淀粉酶的应用 31.4.1 在食品工业中的应用 31.4.2 在造纸业中的应用 31.4.3 在清洁剂生产中的应用 31.4.4 在医药行业中的应用 32 实验方法 42.1 材料、试剂和仪器 42.1.1 生物材料 42.1.2 主要试剂 42.1.3 培养基配方 42.1.4 主要仪器和设备 42.2 实验方法 52.2.1 菌种活化和培养 52.2.2 菌落及生理生化特性鉴定 5 2.2.3 菌种的分子鉴定 52.2.4 菌种的发酵 62.2.5 淀粉酶活力测定 62.2.6 蛋白质含量的测定 6 2.2.7 酶的制备 62.2.8 酶学性质研究 73 结果与分析 93.1 菌落生理生化特性鉴定 9 3.2 菌株分子鉴定结果 93.3 淀粉酶分离纯化结果 10 3.4 淀粉酶酶学性质的研究结果 11 3.4.1 酶反应的最适温度和酶的热稳定性研究 113.4.2 酶反应的最适pH值和酸稳定性 124 结论 14参考文献 15致谢 171 绪论β-淀粉酶。
产淀粉酶菌株的分离和筛选
产淀粉酶菌株的分离及筛选摘要：【实验目的】1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。
2了解产淀粉酶菌株的分离方法。
3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。
【实验原理】淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂.。
【实验目的】1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。
2了解产淀粉酶菌株的分离方法。
3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。
【实验原理】淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多，特点各异，可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域。
在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程均有重要价值，如添加高温淀粉酶可提高啤酒质量，中温蒸煮条件下添加适当耐高温a-淀粉酶可提高糖化率及酒精出酒率，降低甲醇含量，提高酒精质量，同时可提高设备利用率等。
淀粉酶在面包焙烤过程中分解淀粉产生的可溶性糖被酵母转化成酒精和CO2气体，不仅能增加面包体积，同时还有改善面包表皮色泽、提高面包软度、延长保质期的作用，对面包冷却和冷冻也有重要作用。
由于微生物数量多，繁殖快，工业生产主要采用向生物发酵法大量生产该制剂。
本实验从土壤中分离的淀粉酶产生菌从温度、pH值两方面探讨其产酶的最适条件。
通过平板培养法，从样品中初步分离出淀粉产生菌株，再通过单菌落培养从而获得比较纯的菌种。
然后对其进行二级扩大培养，最终测定液体培养基菌液中被酶分解得到的葡萄糖含量来讨论菌株的最适条件（温度、pH值等），为工业街道淀粉酶及饲料添加剂提供候选菌株。
【仪器、材料和试剂】（一）仪器1、恒温培养箱2、高压蒸气灭菌锅3、摇床4、恒温水浴锅5、生物显微镜6、电子天平（二）材料样品一：存放过久发霉的麦芽和周围粉尘样品二：米饭生产线附近草坪上的土壤（三）试剂与器材1、锥形瓶（50ml、100ml、500ml等）2、培养皿（25个左右）3、大小试管（30个左右）4、移液枪（1000μl、100μl）及大小枪头若干5、酒精灯、接种针等6、牛肉膏或酵母膏7、蛋白胨8、NaCl9、可溶性淀粉10、琼脂11、卢戈氏碘液11、草酸铵结晶紫12、碘液13、95%酒精14、蕃红染色液15、蒽胴试剂（现配）16、葡萄糖标准液(0.1 g/L)实验环节1 产淀粉酶菌株的初筛【实验步骤】1、称取一个样品5g，倒入盛有45mL无菌水带塞的三角锥形瓶中，摇床振荡30min制成样品悬液记为10-1土壤稀释液；2、用无菌移液管吸取10-1的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中吹吸数次混匀即为10-2稀释液，照此方法分别制成10-2~10-9稀释液；3、分别取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9土壤稀释液各0.5mL，涂布于平板培养基表面，一个稀释度涂布接种2块平板，37℃下恒温培养16h ；4、待长出菌落后滴加卢戈氏碘液，挑取有明显淀粉水解圈的单菌落，作为初筛菌株。
高性能淀粉酶菌株的筛选及培养基优化[开题报告]
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毕业论文开题报告生物工程高性能淀粉酶菌株的筛选及培养基优化1 选题的背景和意义淀粉酶在工业酶制剂生产中占有十分重要的地位，广泛应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业，居市场份额第一。
但是，我国的α-淀粉酶制剂的品种和生产菌株都很单一，α-淀粉酶活也较国外同行业低[1]。
淀粉酶的生产主要依靠微生物发酵。
而近年来，尽管转导转化和基因克隆等分子生物技术已经广泛应用，但是这些方法成本较高，目前投入商业化生产的α-淀粉酶生产菌株几乎都是通过从自然界中分离得到的野生型菌株[1]。
因此不断从自然界中分离淀粉酶产生菌，并探索其最佳发酵条件有重要意义。
本次实验从自然界中分离产淀粉酶的菌株，通过测定酶活筛选出产酶量较高的菌株，利用液体发酵法对其产α-淀粉酶培养基配方进行优化，获得在生产应用方面具有一定优势的α-淀粉酶产生菌以及其较优的培养基配方，以适应工业生产需求。
2 相关研究的最新成果及动态在菌种筛选方面，一般是采用碘比色法或者DNS比色法，测定淀粉酶酶活[3-5]。
即通过测定淀粉酶水解的淀粉的量，或者生成的麦芽糖的量来测定其相应酶活。
上面有种方法虽然原理上有所不同，但实际操作上较为相似。
而且由于其试剂配制方便，操作简单，灵敏度高，故在国内广泛应用。
而在临床医学领域应用较为广泛的试剂盒法[6]，由于其价格昂贵，一般不做为生物实验室的检查手段。
在培养基配制优化上，由于数学统计以及计算机技术的发展，统计学中的多种优化方法已开始广泛地应用于微生物发酵培养基的优化工作中，其中以响应面方法的效果最为显著[7]。
响应面方法(Response Surface Methodology,简称RSM)是利用合理的试验设计并通过实验得到的一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。
由于该方法试验次数少、周期短，求得的回归方程精度高、能研究几种因素间交互作用，故近年来广泛应用于各种培养基的优化上。
产淀粉酶菌株的筛选
发酵工程实验报告产淀粉酶菌株的筛选姓名：××班级：生物技术学号：××指导老师：×××产淀粉酶菌株的筛选××（长春师范大学生命科学学院生物技术）【摘要】为筛选产淀粉酶的高产菌株, 利用淀粉水解圈作为筛选模型, 从学校附近土壤中筛选得到产淀粉酶能力较强的细菌。
对其酶活力进行测定, 最终得到产淀粉酶的高产菌株。
【关键词】淀粉酶;水解圈;酶活力;高产菌株Screening of Strains Producing Starch××(Technology of Biological Life Science College of Changchun Normal University)[Abstract] for the high-yield strains were screened for amylase, the starch hydrolysis circle as a model for screening, screening from the school near the soil produced amylase ability of the bacteria. Determination of the enzyme activity, high yield strain eventually produced amylase.[Key words] Amylase;Hydrolysis circle;Enzyme activity;Producing strain前言：生活中的微生物无处不在，某些微生物给人们带来困扰，但更多的微生物对我们人类有必不可少的作用。
淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类的总称,广泛存在于动植物和微生物中, 是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种。
土壤中淀粉酶菌株的筛选
土壤中高产淀粉酶菌株的筛选方案：一、实验材料样品:四川化工职业技术学院采集的土样若干试剂:营养琼脂、淀粉、土壤、碘液等仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱 .移液管、培养皿、试管、三角瓶、量筒、酒精灯、接种环等液体培养基:淀粉10 g、硫酸铵10 g、氯化钠5 g、硫酸0.5 g、磷酸氢二钾1 g、牛肉膏1 g，定容1 L二.实验步骤(一)培养基的配置1.称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。
牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。
2.溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。
待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。
将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，应控制火力并需不断搅拌,以防琼脂糊底烧焦。
3.分装将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。
分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。
固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。
4．加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染。
5.包扎加塞后，将全部试管和三角瓶用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层报纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。
用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
培养皿、移液管、涂布棒用报纸包扎好。
试管里面加入45ml 自来水，三角瓶里面加入90ml自来水和玻璃珠，加塞，包扎。
6.灭菌将上述培养基及其仪器121．3℃， 20分钟高压蒸汽灭菌。
7.搁置斜面及倒平板将灭菌的试管培养基冷至50℃左右（以防斜面上冷却水太多），将试管口一端搁置在书边上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
三角烧瓶里的培养基在超净工作台上倒平板，然后静止，待其凝固（二）产淀粉酶菌株的分离、纯化1.土样的采集（1）地点的选取：四川化工职业技术学院花园（潮湿）（2）采集时间:2013-9-5 8:00 （3）采集原则：地点选取后，用小铲子出去5cm表土，取离地面5-20cm处的土，盛与袋中并标明时间，地点及环境情况。
产淀粉酶菌株鉴定及酶的制备[开题报告]
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毕业论文开题报告生物工程产淀粉酶菌株鉴定及酶的制备1 选题的背景和意义淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的统称，是最早实现工业化生产，迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种。
它是最重要的工业用酶之一，广泛应用于各种淀粉转化为糖浆，以环糊精为产品的制药行业，这些酶约占全球酶产量的30％。
除动物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物，现在广泛应用于工业生产的主要是微生物淀粉酶。
淀粉酶不仅可以简化液化、糖化过程，降低淀粉深加工的生产成本，还可用于麦芽糖浆的生产、开发新型助消化剂以及工业废液处理等多个领域，包括淀粉酶、异构酶、果胶酶和纤维素酶等糖酶所占的市场份额约为40％。
而食品和饮料行业利用90％的糖酶进行生产，因此淀粉酶具有巨大的应用前景。
随着社会需求的增大，工业生产对α-淀粉酶的需求量越来越大，其在各领域应用广泛，急需具更高活性的淀粉酶制剂。
生物发酵法生产淀粉酶只是解决了“丰产”的问题，但要最大限度地创造出物质财富，必须还要从下游分离工程（酶的分离纯化）解决“丰收”的问题。
通常处理的发酵液或酶反应液中淀粉酶的浓度一般很低，提取时所耗费的能量就很大，费用也就很高，同时淀粉酶是生化活性物质，易受环境因素如温度、pH、金属离子和微生物等的影响，甚至失活，而在很多情况下，特别是医药产品和作为生物试剂用的产品，其最终产品的纯度要求很高，有些产品要求是有一定保存期的稳定的无色晶体。
因此，下游工程往往要比其他生产过程需要更多的设备，耗用更多的能源及操作费用。
酶的分离纯化常在整个用发酵法生产酶产品的生产成本上占主要部分，如果终产物纯度要求相当高时更是如此。
对于传统发酵工业来说，其分离和提纯所占费用约为总投资的60%，而对于基因工程菌的发酵，甚至达到整个生产投资的80%-90%。
所以认真地研究和优化发酵液中淀粉酶的分离纯化工艺对工业降低生产成本，提高经济效益至关重要。
2 相关研究的最新成果及动态2.1 产淀粉酶菌株的研究淀粉酶是由植物、动物和微生物产生的。
产淀粉酶菌株的筛选及生理生化鉴定
吉林化工学院环境与生物工程学院微生物学实验报告产淀粉酶菌株的筛选及生理生化鉴定学生学号：10350135学生姓名：郭金洋专业班级：生技1001指导教师：谢莹吉林化工学院Jilin Institute of Chemical Technology产淀粉酶菌株的筛选及生理生化鉴定姜建平，荣荣，赵永红，赵楠，郭金洋摘要：目的：筛选产淀粉酶菌株。
方法：利用碘液显色法，从土壤中筛选产淀粉酶菌株；通过菌落形态、菌体特征观察和生理生化鉴定对菌种进行鉴定。
关键词：产淀粉酶菌株，鉴定生理生化性1前言淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类的总称，广泛存在于动植物和微生物中，是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种【1】淀粉酶种类繁多，特点各异，可应用于造纸、印染、酿造、果汁、和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域【2】本实验以土壤为原料，从中筛选出具有产淀粉酶能力的菌株，并对其进行生理生化鉴定，了解并熟悉淀粉酶的筛选及鉴定2材料与药品2.1材料取自学校周围的蛋糕坊附近的土壤，高压灭菌锅，移液管，试管，三角瓶，培养皿，牙签，载玻片，接种针，电炉子2.2药品牛肉膏，蛋白胨，淀粉，琼脂，硫酸铵， K2HPO4， MgSO4·7H2O， CaCl2·2H2O，蔗糖，蒸馏水， NaCl ，硝酸氢二钾，葡萄糖， 0.04%溴甲酚紫，碘液。
3 实验方法3.1 培养基的配制3.1.1.淀粉培养基3.1.1.1淀粉培养基配方牛肉膏 0.3g 蛋白胨1g NaCl 0.5g 淀粉 1% 琼脂1.5g 蒸馏水100ml PH=7.2----7.43.1.1.2淀粉培养基配制方法1）称取按照配方称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠，加入蒸馏水溶于小烧杯中，若有不融物，可加热溶解。
2）称取淀粉于小烧杯中，加入蒸馏水煮沸溶解，直至澄清透明。
倒入上述烧杯中。
3）定容4）在三角瓶中加入琼脂，将定容后的溶液倒入三角瓶，调节PH值。
实验 土壤中产淀粉酶菌株的筛选ppt课件
在原培养皿表面喷洒稀碘液，记录有水解圈的单菌 落，与此对应找出合成淀粉酶的菌株1-2株。
注意：未分离得到菌落的小组可与其他组合作，挑 取其他组鉴定得到的菌落进行后续实验（实验报告 中注明使用哪一组的菌落）。
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7. 产淀粉酶菌株的增殖培养
液体培养基分装：10ml/瓶，每个菌株对应1瓶（ 每组1-2瓶，参考鉴定结果）
液体培养基接种：用接种环从固体培养基表面上 沾取少许菌苔，将接种环在液体培养基内振摇几 次即可。
做好标记，放入摇床中振荡培养24h。
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8. 产淀粉酶菌株的纯化——平板划线法
灼烧接种环，冷却后用接种环挑取少量菌苔
左手持平皿，将皿盖打开一条缝隙，右手将接种 环伸入皿中，划3-4条平行线
灼烧接种环，60°旋转平皿，划线（注意：后一 区要求与前一区首尾相连，但不得与其他区域搭 在一起）
实验结束后请各组同学务必与实验老师处签到后方 可离开，否则记为缺勤
最后一组同学使用完超净台后，需将台内废液、使 用过的枪头等清理干净，移液枪调回最大量程，并 用酒精棉球将台面擦拭干净后，打开紫外灯照射。
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实验报告：实验目的、实验原理、实验步骤 （注意事项）、实验结果、思考题
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系列实验内容
实验1 土壤中产淀粉酶菌株的筛选 （1、2） 实验2 产淀粉酶菌株的诱变剂量选择 实验3 紫外诱变剂突变菌株的初筛 实验4 紫外诱变剂突变菌株的复筛 实验5 高产淀粉酶生产菌株的稳定性及淀粉酶
活力测定
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实验步骤
1. 筛选培养基的配制（已完成） 可溶性淀粉2 g，NaCl 5 g，牛肉膏5 g，蛋白胨
10 g，琼脂20 g，水1000 mL。
高产淀粉酶菌株的筛选及其培养条件的优化
高产淀粉酶菌株的筛选及其培养条件的优化张志强;李思思;李辉;梁魁景;刘言;王婷婷;由明扬【摘要】为筛选淀粉酶高产菌株,通过比较水解圈与菌落的直径比及3,5-二硝基水杨酸(DNS)显色法所测酶活性高低,筛选得到高产淀粉酶能力的菌株WB-4.通过单因素试验,得到该菌株的最优碳源为可溶性淀粉,最优氮源为蛋白胨.利用Plackett-Burman进行显著因素筛选,发现可溶性淀粉含量、蛋白胨含量、温度为显著因素.利用响应面法对显著因素进行优化,得到菌株的最优培养条件为可溶性淀粉含量18.81 g/L,蛋白胨含量10.02 g/L,温度31.12℃,淀粉酶活性365.12 U/mL,酶活性提高了1.33倍.【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2017(045)010【总页数】3页(P221-223)【关键词】高产淀粉酶菌株;响应面法;Plackett-Burman因素筛选;发酵条件优化;工业化应用【作者】张志强;李思思;李辉;梁魁景;刘言;王婷婷;由明扬【作者单位】衡水学院生命科学系,河北衡水053000;衡水学院生命科学系,河北衡水053000;衡水学院生命科学系,河北衡水053000;衡水学院生命科学系,河北衡水053000;衡水学院生命科学系,河北衡水053000;衡水学院生命科学系,河北衡水053000;衡水学院生命科学系,河北衡水053000【正文语种】中文【中图分类】S182淀粉酶是能催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其他低聚糖的一类酶的总称[1]。
淀粉酶来源极其广泛，不仅动物的唾液、胰脏富含淀粉酶，植物体内也含有丰富的淀粉酶，但是，目前商业化生产的淀粉酶主要由微生物发酵提炼所得[2]。
自从19世纪初德国科学家Kirchhoff发现淀粉酶以来，有关淀粉酶的研究报道逐年增加，淀粉酶的应用也越来越广泛。
特别是在酿造工业、纺织、医药工业、环保、洗涤剂等方面得到了广泛的应用[3]。
近年来，虽然我国淀粉酶的品种、产量不断增加，但是与国外相比，我国的淀粉酶品种相对偏少、产量偏低[4]。
实验一：淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定
实验一：淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定指导老师：辛XX生命科学学院XX级生物技术班 XX同组人：XX,XX,XX,XX摘要：目的：从以分离到的细菌、放线菌和真菌中筛选出能产生生理活性物质的菌株并测出淀粉酶活力。
方法：利用土壤制成菌液，将其涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基上进行纯化，再用淀粉培养基培养，最后通过淀粉透明圈的大小来判断淀粉产生菌产淀粉的能力。
再使用分光光度计精确测量淀粉酶的酶活力。
关键词：淀粉酶；透明圈；酶活力；分光光度计我们从学校的花坛中采集一些土壤样本，拿到实验室中，进行淀粉产生菌的筛选。
土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养，几天后在拼板上课长出细菌或者是其他的微生物，并繁殖形成菌落。
将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。
故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。
淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，它能将淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉遇到碘变蓝，这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。
随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。
因此可以根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。
1材料和方法1.1材料1.1.1实验材料长春师范学院家属楼前小菜园1.1.2实验药品碘液、2%可溶性淀粉、pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、0.5mol/L乙酸、0.85%生理盐水。
1.1.3实验仪器培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。
1.2方法1.2.1培养基的配置（1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板）（2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉 20g, 硝酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化钠 0.5g,硫酸镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼脂 20g, 水 1000毫升，调整pH值到7.2～7.4。
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毕业论文开题报告生物工程高性能淀粉酶菌株的筛选1 选题的背景和意义淀粉酶是能催化淀粉和糖原水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一类酶的总称，在淀粉糖工业、食品工业、医药、纺织、洗涤剂、青贮饲料、微生态制剂以及酿酒行业中被广泛应用。
淀粉酶是最早用于工业化生产并且迄今为止仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一[1、2]。
不同种类的淀粉酶水解淀粉会生成不同的产物。
根据淀粉酶水解淀粉的作用方式可分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶。
α-淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，所得产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为α构型，同时该酶能使淀粉浆的粘度下降，又称为液化酶；β-淀粉酶是从淀粉的非还原性末端切下一分子的麦芽糖，又被称为糖化酶，其产物还原性末端葡萄糖单位碳原子为β构型；葡萄糖淀粉酶是从底物非还原末端依次水解α-l，4糖苷键和分支的α-1，6-糖苷键，生成葡萄糖。
异淀粉酶是只水解糖原或支链淀粉分支点的α-1，6-糖苷键，切下侧枝链[3]。
淀粉酶是工业中最重要的酶。
如今，在生物制药领域，它也具有重要的作用。
虽然淀粉酶具有很多来源，但是微生物来源的淀粉酶，特别是α-淀粉酶和葡糖淀粉酶，在商业上发挥着重要的作用。
由于淀粉是可以由淀粉酶水解的惟一天然物质，分离有效的微生物菌株生产对生淀粉有效性高的淀粉酶是非常理想的。
应用新的耐热性葡糖淀粉酶可以促进淀粉的水解过程，而使用α-淀粉酶可以使整个过程一步便可以完成，具有经济效益。
现在，必须开发具有双重功效的，如液化作用和糖化作用的微生物菌株如淀粉分解酵母。
也应该开发具有有效β-淀粉酶活性的菌株，β-淀粉酶可以用来生产麦芽糖浆。
可以用农业和工业上的废物作为淀粉酶生产的底物，从而降低开支，也解决了废物的处理和污染问题。
在工业上的作用，淀粉酶的耐热性已成为非常重要的性质，因此，我们也应该努力从耐热和极端耐热的微生物中生产淀粉酶。
另外，将淀粉酶的应用范围拓宽如应用于生物制药领域也具有积极的意义。
2 相关研究的最新成果及动态2.1 α-淀粉酶的催化机理目前公认的α-淀粉酶的催化机理[4]，催化中心位于α/β桶状结构的底部，261位谷氨酸和231位天冬氨酸是起催化作用的两个重要残基。
整个催化过程可分三步：第一步，淀粉链中的糖苷氧被质子供体261谷氨酸质子化；第二步，亲核基团231位天冬氨酸亲核攻击葡萄糖残基的C1，糖苷键断裂，葡萄糖残基与231位天冬氨酸形成酯键，同时去质子化状态的261位谷氨酸夺取一个水分子H+，产生一个OH-；第三步，OH- 攻击葡萄糖残基的C1，使酯键断裂，261位谷氨酸和231位天冬氨酸重新恢复初始状态。
在已知结构的α-淀粉酶中，在α/β桶状结构的底部，均含有谷氨酸和天冬氨酸两个残基，它们的相对位置相似，并且所有α-淀粉酶的整体三维结构都很相似，因此，它们的催化反应机理应该是相同或相近的[4、5]。
以对α-淀粉酶分子结构和催化机理的研究为基础，通过各种手段改善酶的催化反应特异性，使其更适合于在工业生产中应用是近年来新兴的发展趋势。
2.2 α-淀粉酶的突变研究目前应用得最广泛的基因水平上的突变主要有两种，即随机突变和定点突变，有时也将两种方法结合使用。
随机突变首先需构建突变文库，然后根据研究酶的特点设计高通量的筛选方法。
它的优点是不必明确知道酶的三维结构、催化机理等。
定点突变需要对酶的结构机理有较明确的认识，它更适用于研究单个或多个位点对酶分子的影响。
将这些方法应用于α-淀粉酶的研究已有一定进展。
目前有关突变的研究大多针对于地衣芽胞杆菌活菌，如Takase 研究发现天冬酰胺326赖氨酸/天冬氨酸能够显著改变地衣芽胞杆菌活菌的pH特性。
Nielsen J E等对地衣芽胞杆菌活菌进行定点突变，发现谷氨酰胺264丝氨酸和天冬酰胺190苯丙氨酸能提高地衣芽胞杆菌活菌的热稳定性。
Shaw A 等通过随机突变，得到Met15Thr,能增强地衣芽胞杆菌活菌的稳定性，在此突变的基础上进行随机突变，发现Met15Thr和天冬酰胺188丝氨酸使地衣芽胞杆菌活菌热稳定性提高2倍[6]。
但目前就氨基酸突变如何导致酶宏观性质的改变说法不一，还有待进一步研究。
2.3基因克隆及氨基酸序列分子生物技术的发展，对α-淀粉酶的研究已进入分子水平阶段，在α-淀粉酶的氨基酸序列分析、基因编码及核苷酸序列分析、基因克隆和基因性状表达等方面都取得较大的进展，基因工程技术已广泛应用到了淀粉酶生产菌株的克隆上，并且在不同微生物的α-淀粉酶基因克隆方面已经作了大量的工作，主要在大肠杆菌等。
Suganum a et al. 研究了α-淀粉酶的N-端氨基酸序列。
Kim et al. 描述了编码一种新α-淀粉酶的基因，该基因被克隆并在大肠杆菌中表达[7]。
Steyn 和Pretorius 编码α-淀粉酶基因(AMY)编码GA的基因(STA 2)转入一个酵母菌的整合载体(Yip5)，形成重组质粒pSP1和pSP2，AMY和STA 2被一同连接到载体Yip5中，产生质粒pSP3。
随后，编码抗Geneticin 418 显性标记的A PH 1 被克隆到pSP3 中得到pSP4。
为了增强Geneticin 418的表达，pSP4再连接启动子GAL10和终止子URA3，这样就得到质粒pSP5。
pSP5通过增加ARS1H和CEN4序列被修改成环形微染色体pSP6。
转入了pSP1-pSP6 的实验室郎酒酵母菌株能稳定产多种α-淀粉酶和GA [7]。
3 课题的研究内容及拟采取的研究方法（技术路线）、难点及预期达到的目标本课题希望通过对曲和其他不同来源的淀粉酶产生菌的比较，筛选获得淀粉酶活力较高及生产性能较好的菌株1株，对其产酶条件及酶学性质进行研究。
实验具体内容包括：(1)产淀粉酶菌株的筛选；(2)产酶菌株的鉴定；(3)菌株发酵条件的优化；(4)酶学特性的研究。
3.1产酶菌株的筛选流程图（如上）3.2菌种来源曲和其他不同来源的淀粉酶产生菌。
3.3培养基采用淀粉固体培养基分离培养。
称取牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g 溶于900mL 蒸馏水中，再加入25g琼脂粉并搅拌至充分溶解，调pH 至中性，最后加蒸馏水定容至1000mL，高压蒸汽灭菌[2]。
3.4初筛方法称取酒曲5g，倒入盛有无菌水带玻璃珠的三角瓶中，摇床振荡后制成土壤悬液记为10-1土壤稀释液。
用无菌移液管吸取10-1的土壤悬液0.5 mL，放入4.5 mL无菌水中吹吸数次混匀即为10-2稀释液，照此分别制成10-2～10-9的稀释液，分别取10-7、10-8、10-9土壤稀释液各0.5 mL，涂布于平板培养基表面，一个稀释度涂布接种到数个平板，恒温培养，待长出菌落后，滴加卢戈氏碘液，挑取有明显淀粉水解圈的单菌落，进行斜面培养，作为初筛菌株编号保藏[8]。
3.5复筛方法把初筛出的菌株划线到不同编号的平板培养基上，恒温培养一段时间，长出单菌落后，选择直径相当的单菌落，滴加卢戈氏碘液，用游标卡尺测水解圈直径，选取水解圈直径相对较大的菌株作为复筛菌株即实验菌株，进行菌种鉴定及产酶条件优化[9]。
3.6细菌鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》,鉴定项目包括：形态观察、革兰氏染色、芽孢染色、糖发酵、V-P试验、淀粉水解、木糖产酸、柠檬酸盐试验及耐盐性试验等[10]。
3.7响应面法优化温淀粉酶发酵条件在优化初期利用Plackett-Burman（简称PB）设计法，将初始发酵培养基的8种成分：可溶性淀粉（X1）、尿素（X2）、K2HPO4（X3）、KH2PO4（X4）、MnSO4·H2O（X5）、MgSO4·7H2O （X6）、豆粕（X7）和酵母膏（X8），分别作为PB 试验设计的8 个因素，每个因素取2～3个水平，即低水平（-1）为初始发酵培养基各成分的浓度，高水平（+1）取低水平的1.5 倍。
活菌含量作为响应值Y[11、13]。
根据PB试验筛选出的对发酵液活菌含量影响显著的因素、以各显著因素的正负效应确定最陡爬坡试验的路径，快速的逼近最大响应区域。
Box-behnken 设计Box-behnken 设计适用于2～5个因素的优化试验，基于PB 试验设计和最陡爬坡试验的试验结果，进行Box-Behnken设计：以PB试验筛选得到的对发酵液活菌含量影响显著的因素作为设计因素，以最陡爬坡试验得出的浓度作为中心点，根据相应的试验表进行试验后[11]，使用SAS对试验结果进行响应面分析[12]。
3.8酶学特性研究3.8.1酶活测定淀粉酶酶活定义：1 mL酶液（或1g固体酶粉）在pH 6.0，温度60℃，1min液化可溶性淀粉1mg所需的酶量称为一个酶活单位（U）。
测定：2 %可溶性淀粉溶液10mL，pH6.0磷酸二氢钠—磷酸氢二钠缓冲液2.5mL于60℃下水浴预热5min后，加入稀释一定倍数的酶液0.5mL反应5min，用0.1mol/L的盐酸0.5mL终止反应。
取1mL反应液于5mL比色碘液中，用比色碘液做空白样，测其660nm吸光度A660。
根据A660与酶浓度C的回归方程式计算出C。
酶活力=C×稀释倍数×16.7[14]。
3.8.2酶的性质分析[15]（1）酶反应的最适温度：将酶溶于pH 4.0的磷酸缓冲液中，在4～100℃范围内，不同温度下测定酶活性，以最高酶活力为100%，计算相对酶活力；(2)酶反应的最适pH：将酶溶于范围在2.6～7.6之间，不同pH的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液中，于最适反应温度下测定酶活力。
以最高酶活力为100%，计算相对酶活力；（3）酶的热稳定性：将酶溶于pH4.0的磷酸缓冲液中，在不同温度下处理不同时间后冷却，分别测定酶活力，以未经热处理的酶所测得的活力为100%，计算相对酶活力；（4）酶的酸稳定性：将酶溶于范围在2.6～7.6之间，不同pH的磷酸缓冲液中，在37 ℃下放置不同时间后，测定酶活力。
以未放置于4℃下保存的酶所测得的活力为100%，计算相对酶活力;（5）酶的Km 值测定：以可溶性淀粉为底物，在pH 4.0，60℃的条件下以不同浓度(S)的可溶性淀粉为底物溶液,测定酶的反应速度V(以单位时间内吸光度的减少量dA/dt来表示)，以1/V21/[S]的双倒数法作图，计算Km值；（6）金属离子对酶活性的影响[16、17]：分别配置含有5mmol/L的不同金属离子的等量酶液，充分混匀后，在适当温度下下放置一段时间后，pH4.0条件下测定酶活力。
以未含金属离子的酶活力为100%,计算相对酶活力。
3.9 重点难点高活力淀粉酶菌株的筛选；淀粉酶的酶学性质研究。
4 论文工作进度和安排2010.10.30 选题2010.11.5 布置论文任务2010.11.5－2010.12.30 查阅文献资料，翻译英文文献，完成文献综述和开题报告2011.1.10 文献综述、开题报告和翻译文章定稿并上交2010.11.5-2011.1.10 熟悉实验室环境和基本实验操作，准备实验所需基本材料2011.4月前在学校指定时间完成开题答辩2010.11.5－2011.5.12 毕业论文实验阶段2011.5.13 完成并提交毕业论文2011.5 在学校指定时间进行毕业论文答辩2011.6 完成并提交答辩后的修改论文5 参考文献[1] 孙晓菲,李爱江.α-淀粉酶的应用及研究现状.[J].畜牧兽医科技信息,2008(6):13-14.[2] 张双民.土壤中淀粉酶高产菌株的分离及产酶条件的优化.[J].土壤肥料,2006(2):59-60.[3] 颜守保.产耐酸性α-淀粉酶菌株的筛选,发酵条件及酶学性质研究.[D].安徽农业大学,2007[4] Sivaramakrisshan S,Gangadharan D,Nampoothiri K M,et al.α-Amylase from microbial sources-an overview on recent development. Food Technol. Biotechnol[J].2006, 44 (2) ,173-184 [5] N ielsen J E, Borchert T V. Protein engineering of bacterial alpha-amylases [J].Biochim Biophys Acta, 2000,1543(2):253-274[6] 王楠,马荣山.耐高温α-淀粉酶的研究进展[J].中兽医医药杂志,2007(3)[7] 胡欣洁,邓斌,胡承. 微生物α-淀粉酶的研究进展[J].中国防伪,2005(9):59-60[8]魏群.分子生物学实验指导（第二版）[M].北京:高等教育出版社,2007.[9]陈均辉,李俊,张太平,等.生物化学试验（第四版）[M].北京:科学出版社,2008.[10]伯杰细菌鉴定手册（第八版）[M].北京:科学出版社,1984.[11]陈雄,袁金,凤王志,等.响应面法优化地衣芽孢杆菌A2发酵培养基[J].中国饲料,2009,7:17-20[12]欧宏宇,贾士.SAS软件在微生物培养优化中的应用[J].天津轻工业学院学报,2001,1:[13]茆军,张志东,王玮,等.响应面法优化低温淀粉酶发酵条件研究[J].生物技术, 2008,18(4):83-86[14]蒋若天,卢涛,宋航.一株α-高温淀粉酶的地衣芽孢杆菌产酶培养基的优化[J].现代食品科技,2006,22(4):52-56[15]李勃,党永,马瑜,等.黑曲霉Tx-278耐酸性α-淀粉酶的分离纯化及其性质研究[J].微生物学杂志,2008,28(4):30-34.[16]Rezahi S, Hosseinnim K K.A Ca2＋independentα-amylase that is active and stable at low pH from the Bacillus sp1 KR28104[J].Enz yme Microb.Technol. 2005, 36(3):666-671[17] 柳辉,杨江科,闫云君.产α-淀粉酶菌株的分离,鉴定及酶学性质研究[J].生物技术,2007(17):34-35.。