挖掘新基因资源的方法

挖掘新基因资源的方法概述

随着生物科技和基因工程技术的发展，酶制剂的开发和研究越来越需要更多的酶基因资源，目前国内研究方法主要有以下几种：

一通过寻找新的微生物资源

我们寻找新的基因资源最直接和最传统的方法就是通过对自然界的微生物进行筛选，获得更多的优良的微生物资源，然后通过分子生物学手段获取基因资源，早期的研究大多数局限于此。微生物筛选的基本流程大致如下：

1.根据不同的目的选取特定的地点采集样品，常选取比较极端的环境。

2.对采集的样品进行处理，稀释培养，或者富集培养

3.很据不同的样品和目的进行初筛，复筛。

菌种筛选的手段筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求，对于初筛，要力求快速、简便，对于复筛，应该做到精确，测得的数据要能够

反映将来的生产水平。

1)从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存

在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管

相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽

可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方

法只能用于初筛。

2)平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基

平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见

的"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、

生长圈法和抑制圈法等。这些方法较粗放，一般只能定性或半定

量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺

点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液

体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。

平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，

以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。

4.细菌的生理生化试验，各种代谢产物的测定。

5.细菌培养鉴定，性能测定，克隆基因，表达分析。

缺点：开发周期太长；

优点：操作方法简单，获得较多的菌种资源。

大型设备：电子天平、超净工作台、高低温恒振荡培养箱、恒温水浴锅、可见光分光光度计、高压蒸汽灭菌锅、PCR仪，紫外成像系统。

实例：筛选高温淀粉酶产生菌及克隆基因（广西大学薛蓓2009年硕士毕业论文）

i.采样在在高温环境（广西象州温泉）采样，共选择三个采样点，

即热泉口（温度80℃，pH7.0）、温泉水（温度73℃，pH6.5）及温

泉旁边的底泥（温度65℃，pH6.8）。

ii.产α-淀粉酶产生菌的菌株筛选将采集的样品分级稀释，涂布在以可溶性淀粉为唯一碳源的M9培养基上，于60℃-80℃倒置培养24h，

待长出菌落后，将平板置于4℃，直到淀粉板上透明圈明显后取出，

观察透明圈大小，并测量菌落直径（C）及透明圈直径(H)，计算透

明圈与菌落直径比值(H/C)作为初筛指标，初步筛选出产淀粉酶高的

优良菌株进行进一步的纯培养。再以这些菌株为材料，液体培养检

测其淀粉酶的活力以复筛选出了淀粉酶产量高的菌株。

iii.菌株鉴定，酶学性质测定选取复筛优良菌株65℃，200rpm振荡培养24h，测定发酵液酶活，并初测其性质，并鉴定该菌株。

iv.克隆高温淀粉酶基因根据GeneBank已公布的与所筛选菌株同源性最高的菌株里淀粉酶的序列设计引物进行PRC扩增得到目的基

因。该基因编码的淀粉酶在80℃下保温20min,残留活性在85%以上。二宏基因组技术挖掘新基因资源

分子微生物生态学的研究业已证明环境中大量存在未能培养的微生物，某些环境中采用现有培养技术能够培养的微生物不到1%，超过99%的微生物尚未能培养(Amann RI, Ludwig W,1995)，可见基于微生物分离培养的技术途径开发利用微生物资源受到了极大的限制。为了突破上述限制，充分挖掘和利用微生物的多样性基因资源，人们在寻找新技术方法上倾注了极大的热情。“宏基因组”即指生境中全部微小生物遗传物质的总和，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和（Handelsman J., Rondon M.R. Brady, 1998 ）。宏基因组文库既包含了可培养的又包含了未能培养的微生物基因，避开了微生物分离培养的问题，极大

地扩展了微生物资源的利用空间。目前已采用土壤、海水、海洋浮游生物、海棉、甲虫、人唾液等环境样品成功构建了宏基因组文库，已筛选到的生物活性物质有各种酶类及一些次生代谢产物，包括脂酶/酯酶、蛋白酶、淀粉酶、氧化酶、几丁质酶、核酸酶、膜蛋白、4-羟基丁酸代谢酶系、生物素合成酶系、色素、抗菌抗肿瘤活性物质及抗生素抗性基因等。

宏基因组文库技术的主要流程如下：

1从环境中提取宏基因组DNA；

先采集环境样品，处理，裂解，抽提总DNA ，一般按处理样品方式的不同划分为直接提取法和间接提取法。顾名思义，直接提取法就是

直接对样品进行裂解，释放其中的DNA；间接提取法则是先分离样品

中的微生物，后对微生物进行裂解用核酸内切酶切割成一定长度的DNA

片段并连接到合适的载体上。

2转化宿主菌，形成一个重组的DNA文库即宏基因组文库。

将提取的高质量的总DNA用合适的酶切、回收，然后和处理好的合适的载体进行连接，转化宿主。

3宏基因组文库筛选。

由于环境样品中微生物种类繁多，宏基因组文库容量一般较大，活性克隆子的筛选是新活性物质筛选的瓶颈，根据研究目的, 可从生物活

性水平、化合物结构水平以及DNA序列水平设计不同的筛选方案。

1）生物活性水平的筛选又称为功能驱动筛选(function-driven screening), 根据重组克隆产生的新活性进行筛选。采用各种活性检测手

段检测挑选活性物活性克隆子，进行生化分析和插入DNA片段序列分

析，进而对其深入研究。这一策略以生为线索能够发现全新的活性物质

或基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子，但工作量大，效率低，并

且受检测手段的局限。

2）DNA序列水平的筛选又称为序列驱动筛选(sequence-driven screening), 以序列相似性为基础，执行某类功能的酶可能具有相识的

基因序列。根据某些已知的相关功能基因的保守序列或相似序列设计杂

交探针或PCR引物，通过杂交或PCR扩增挑选阳性克隆。这一策略有