FZ002沙眼衣原体(CT)核酸检测操作规程

一、原理

使用一对沙眼衣原体特异性引物和一条沙眼衣原体特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测沙眼衣原体DNA。

二、标本的采集和处理：

1.适用标本类型：生殖泌尿道分泌物

2.标本采集：

2.1 男性：用男性专用棉拭子取尿道分泌物或伸入尿道约2～4cm，略捻拭子取出分泌物

（略带粘膜），拭子取出后放入塑料试管密闭送检。

2.2 女性：

2.2.1 阴道-用无菌生理盐水洗去宫颈外分泌物，再用女性专用棉拭子插入宫颈内，停留5秒后旋动棉拭子采取宫颈分泌物，密闭送检。

2.2.2 尿道-棉球蘸取无菌生理盐水洗净尿道口，再用女性专用棉拭子插入尿道约2cm，略捻拭子取出分泌物（应略带粘膜），密闭送检。

3.标本的保存及运送：门诊病人标本由患者本人送检，住院病人标本由专门工作人员运送。标本可立即用于测试，1～5℃保存不超过3天，也可保存于-20℃待测，保存期6个月。

三、试剂

1．试剂购自中山大学达安基因股份有限公司。

2．组成：

组分名称规格数量

PCR反应管1人份／管20

DNA提取液500µl /管 2

阴性质控品250µl／管 1 CT临界阳性质控品50µl／管 1

CT强阳性质控品50µl／管 1

CT阳性定量参考品

10µl／管 4

（1.0×104~1.0× 107 IU/ml）

3．储存条件：于-20℃保存，避免反复冻融。试验前室温平衡30min。

四、仪器：

高速低温离心机，生物安全柜，恒温金属浴，Roche LightCycler2．0检测分析仪。

五、操作步骤：

(一)核酸提取：

1标本处理：

1.1 标本试管中加入1ml无菌生理氯化钠溶液，充分震荡混匀；

1.2 将液体转至1.5ml离心管中，12，000rpm离心5min；

1.3 去上清，沉淀加无菌生理氯化钠溶液1ml，漩涡振荡器混匀，12，000rpm离心5min；1.4去上清，沉淀中加入50µlDNA提取液充分混匀，100℃恒温干浴10min（误差不超过1min）

1.5 12，00rpm离心5min，备用。

2 阴性质控品的处理

2.1 取出阴性质控品，复温至室温后吸取50µl至1.5ml灭菌离心管中，加入50µlDNA提取液，振荡器混匀5～10秒，1OO℃干浴10min(误差不超过1min)

2.2 12，000rpm离心5min，备用。(在二区进行)

3 CT临界阳性质控品的处理(同阴性质控品)

4 CT强阳性质控品的处理(同阴性质控品)

（二）PCR扩增:

1 加样：取PCR反应管，分别加入待测标本及阴阳性临界值质控品2µl，盖好离心管盖，6500rpm 离心数秒，使试剂与标本混合。（在二区进行）

2 PCR扩增：将各反应管按顺序放入Roche LightCycler2.0圆形卡盘，放入仪器中按照该仪器操作程序进行PCR扩增(具体见Roche LightCycler2.0扩增仪标准操作程序)。（在第三区进行）

六、结果分析：

Roche LightCycler2.0的条件设置：反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光数值（Fluorescene）为F1/F2，点击Qualification读取结果。调整噪声容限，使阴性质控品Ct值为40，临界阳性质控品Ct为32～34，强阳性质控品Ct为18～20，最后记录仪器自动分析计算出的Ct值。

七、质量控制：

在做该实验时，必须做与标本同步的阳性对照，阴性对照和临界值对照，若临界值或阳性对照阴性，此批结果不可靠，不能出报告，必须查找原因，直至原因找出并得到证实，重做该批标本，若阴性对照的Ct值小于40，也应找查原因，是否有交叉污染的可能。

八、临床意义：

1. 用于沙眼衣原体感染的早期诊断；

2. 沙眼衣原体感染无症状携带者的调查；

3. 沙眼衣原体感染的流行病学调查；

九、注意事项：

1．DNA提取液和冻存的血清标本使用前，充分融化混匀。

2．反应管内加模板后，应尽快扩增。

3．PCR操作应严格分区进行，避免扩增后的产物污染；所有消耗品应灭菌后一次性使用。

4. 提取液内含不溶于水的物质，每次取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或吸取后堵塞吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截。

5.实验完毕后，对生物安全柜及实验室台面进行消毒处理。

6.所有检测样品（包括试剂盒自带的阳性质控品）应视为具有潜在传染性，操作和处理均应符合生物安全相关规定。