2010版-高效液相色谱法
岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪标准操作程序
1 目的: 建立LC-2010AHT高效液相色谱仪标准操作程序，规范LC-2010AHT高效液相色谱仪的使用和操作。
2 范围: LC-2010AHT型高效液相色谱仪。
3 责任: QC全员。
4 程序:4.1 流动相的准备根据实际情况配制所需的流动相，用0.45µm滤膜过滤，经超声波清洗仪超声脱气约20分钟。
流动相的保质期一般为3天。
4.2 仪器的开机4.2.1 接通电源，按下仪器正面的电源开关按钮，仪器开始自检。
4.2.2 打开电脑，点击桌面的“LCsolution”图标，然后点击“instrument 1”，进入液相操作界面。
4.3 仪器的操作4.3.1 根据需要更换流动相，色谱柱，色谱柱更换时将色谱柱标签箭头方向指向检测器方向。
4.3.2 打开方法文件：点击菜单栏的“File”下拉菜单中的“Open Method File”按键，系统弹出一个对话框，找到所要方法的路径，双击方法文件或单击方法文件后点击“OK”按钮。
4.3.3 新建方法文件：点击菜单栏的“File”下拉菜单中的“New Method File”后，所有参数都被清除，在各项参数上设置好所需的数值，点击左上方的“保存”按钮或点击菜单栏的“File”下拉菜单中的“Save Method File”，在弹出的对话框中选择保存的路径和方法的文件名，点击“OK”按钮。
4.3.4 方法确定后，点击操作界面上方的“Pump”打开泵体，点击“Oven”打开柱温箱，或者直接按仪器上的“Pump”和“Oven”。
4.3.5 脱气：设置好要脱气的管路，点击操作界面上方的“Auto purge”，仪器开始脱气。
还有一种方法就是点击仪器上的“Purge”按钮，要注意的是，此时应将泵的开关打开，具体就是打开仪器最下方的侧盖，将泵开关逆时针旋转180度即可。
4.3.6 走基线：脱气完毕后，系统开始走基线。
4.3.7 批处理：点击操作界面左边的“Batch Processing”按钮，进入到批处理界面。
高效液相色谱法测定中药延胡索炮制前后延胡索乙素的含量
YANGJ i a n-mi n91，CAO Li ar l 92。 XUE Gui —pi n91。et al 1．Phar ma col ogy De p．He be i Nor t h Un i ver si t y ，Zhang i i a kou．075 000 ，He bei 。Ch i na； 2．Th e Fi r st Af f i l i at ed Ho spi t al 。Hebe i Nort h Uni ve r s i t y，Zhangj i akou，075000，He be i ，Chi na
RSDl 0 C Kl As s ay age re cover y wa s 100．4 0A wi t h
。 ％． 饵 嘲：
of Tet r a hydr opa l ma t i ne i n Yanhus uo af t er pro—
ee ss i ng WaS hi gher t h an t hat bef o r e t r ea t me nt ．Thi s me t hod of as say i n g wa s pr oved t O be si mpl e a nd r el ia ble ，
不能帮助我们识别症状感知 偏差的哮喘患者。我们进
Che st , 19 98．1 13( 2) 。272 ．277 ．
行的哮喘自觉症状与气道功能指标的同时监测，可以4刘颖，贺正一．救治突发致死性哮喘8例分析[ J] ．中困现代
识别出症状感知偏差的哮喘 患者，也以发现气道功
临床医学，200 5．20 04( 7) ：81．81．
of met hyl al cohol - 0．1％phos phor i c ac i d( 8 5 I 15) ，a vel oc i t y of 1．OmL·mi nl ，and a de t ect i ng wavel e ngt h at
2010版药典黄曲霉毒素检验法
实用标准文案2010版药典黄曲霉毒素检验法（文字版）附录Ⅸ V 黄曲霉毒素测定法本法系用高效液相色谱法(附录ⅥD)侧定药材饮片剂制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉毒B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水(10：18：42)为流动相，流速每分钟0.8ml；采用柱后衍生法检测。
衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加人甲醇100ml使溶解，用谁稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每挣钟0.3ml 衍生化温度70℃；以荧光检测器检测，激发波长λex=360nm(或365nm），发射波长λem=450nm。
两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。
混合对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混和标准品（黄曲霉毒B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0ug/ml、0.3ug/ml、1.0ug/ml、0.3ug/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。
精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
供试品溶液的制备取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，加氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11000转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45um）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲和柱（AflaT-est@P），流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀。
即得。
测定法分别精密吸取上述混和对照品溶液5ul、10ul、15ul、20ul、25ul，诸如液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，另精密吸取上述供试品溶液20-25ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的量，计算，即得。
高效液相色谱法测定醋酸泼尼松片中相关物质含量
高效液相色谱法测定醋酸泼尼松片中相关物质含量贺颖;董得时【摘要】目的:探讨高效液相色谱法测定醋酸泼尼松片中相关物质含量.方法:采用ZORBAXSBC18(规格:4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,流动相为甲醇-水(58:42),流速为1.0mL·min-1,柱温30℃,检测波长为240nm,进样量取10μL.结果:醋酸泼尼松、泼尼松、醋酸可的松在浓度范围0.52～30.81μgmL-1之间有良好的线性关系,平均回收率(n=6)为99.36％,RSD=1.31％.结论:本研究方法专属性强、重复性好、结果准确,为醋酸泼尼松片中醋酸泼尼松、泼尼松、醋酸可的松含量测定提供了科学、专属的方法.【期刊名称】《中国医院用药评价与分析》【年(卷),期】2012(012)006【总页数】3页(P531-533)【关键词】高效液相色谱法;醋酸泼尼松片;泼尼松;醋酸可的松【作者】贺颖;董得时【作者单位】大连医科大学附属第一医院药学部,辽宁大连116000;大连医科大学附属第一医院药学部,辽宁大连116000【正文语种】中文【中图分类】R977.1+1醋酸泼尼松为一种肾上腺皮质类激素药，能够抗过敏、抗炎、抗风湿及免疫抑制，是临床上的常用药之一。
《中华人民共和国药典:二部》(2000年版)中收录的醋酸泼尼松片含量测定方法为紫外分光光度法［1］，虽然此法简单，但其选择性较差，专属性不强，结果可能受片剂中的其他添加剂或辅料的干扰，而对于一些有意的造假产品，也常常出现“合格”的检测结果。
因此本文笔者根据相关资料［2-5］及《中华人民共和国药典》(2010年版)中醋酸泼尼松原料药有关物质检查方法，采用高效液相色谱法测定醋酸泼尼松片中醋酸泼尼松、泼尼松、醋酸可的松的含量，现报告如下。
1 仪器与试药Waters高效液相色谱仪(美国，2487型紫外检测器、1525型输液泵、717自动进样器、2996型检测器、waterts Empower色谱软件)，电子天平(SartorisBS110S十万分之一天平)。
第十八章_高效液相色谱法
疏水基团 C18基 C8基 苯基
2010-12-2
（3）键合相色谱法分离机理 ）
反相键合相色谱: 固定相极性<流动相极性 反相键合相色谱 固定相极性 流动相极性 常用固定相： 常用固定相：C18（ODS） ） 常用流动相 甲醇-水 甲醇 水 乙睛-水 乙睛 水 分离对象 非极性 中等极性化合物
2010-12-2
2010-12-2
3）流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的 越大 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大 溶剂种类：水为弱溶剂， 溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂 溶剂比例：水的比例增加， 溶剂比例：水的比例增加，使k增大 增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大 中性盐的加入：使中性溶质的 增大 pH：影响弱酸、弱减的离解 ：影响弱酸、 流动相的pH降低，弱酸 增大 增大， 增大； 流动相的 降低，弱酸k增大，tR增大；弱 降低 变小。 碱k变小。 变小
2010-12-2
一、化学键合相色谱法的固定相
• 固定相应符合下列要求： 固定相应符合下列要求： –颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀 –化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好 1、键合相的种类 （1）非极性键合相 ： 与苯基等键合在硅胶表面； －非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面； 非极性烃基， －用于反相色谱； 用于反相色谱； －长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 稳定性更好。 稳定性更好。
极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
离子交换基团 胺基、 胺基、季铵盐 磺酸、 磺酸、羧酸
高效液相色谱法测定甘油果糖氯化钠注射液
应用报告 LC008高效液相色谱法测定甘油果糖氯化钠注射液 2010版药典（二部）规定采用高效液相色谱法对甘油果糖氯化钠注射液进行含量测定，以磺酸型聚苯乙烯与二乙烯基苯共聚体阳离子交换树脂H型为填充剂，要求理论塔板数按氯化钠峰计算不得低于2500。
上海舜宇恒平科学仪器有限公司采用LC1620高效液相色谱仪，使用Shodex SH1011色谱柱，推出符合药典要求的测定方法。
1实验部分1.1仪器与试剂LC1620高效液相色谱仪（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；FA2004电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；氯化钠、果糖、甘油、磷酸（国药试剂，AR）；纯净水（杭州娃哈哈）。
1.2标准溶液的配制1.2.1对照品溶液的配制准确称取甘油10g，果糖5g，和氯化钠0.9g标准品，于100ml容量瓶中，加水定容至刻度，得到甘油果糖氯化钠注射液的对照品溶液。
详细方法请参考中华人民共和国药典（2010版二部P84）1.2.2标准待测溶液准确量取5ml对照品溶液于100ml容量瓶中，加水定容至刻度，得到标准待测溶液。
1.3色谱条件色谱柱：Shodex SH1011（8.0×300mm）流动相：0.04mol/L磷酸溶液流速：1.0ml/min柱温：50℃进样量：20µl检测波长：200nm2实验结果将1.2.2中所配制的标准待测溶液，在1.3描述的高效液相色谱条件下进样，三种主要成分均能得到有效的分离（见图一），以氯化钠峰计算理论塔板数为19282。
重复进样五次重复性良好（见图二），如表1所示RSD均在2.0%以内。
图 1 氯化钠甘油果糖标准品谱图出峰顺序：氯化钠、果糖、甘油图 2 连续五次进样谱图表1 五次进样重复性结果氯化钠果糖甘油保留时间 0.07% 0.06% 0.05%峰面积 1.90% 0.94% 1.37%峰高 0.43% 0.26% 1.14%理论塔板数 1.75% 1.75% 1.53%3结论（1）采用LC1620高效液相色谱仪，按照中华人民共和国药典（2010版）的方法，氯化钠、果糖、甘油能够在Shodex SH1011色谱柱上得到良好分离。
中国药典2010年版--溶液颜色检查法
❖ b. 现在市面上有国家标准物质研究中心监 制的标准比色液，方便了检验，缩短了检验 时间，用于快检非常适宜。测定时取一定体 积的供试品溶液和相同体积标准比色溶液置 于配对的玻璃管（外径12mm，无色、透明、 中性硬质玻璃制成）中，同置白色背景上， 于自然光下，自上向下透视，或同置白色背 景前，平视观察，比较溶液颜色。
根据上述测定结果，在剩余的原溶液中加适
量的盐酸溶液(1→40)，使每1ml溶液中适含 62.4mg的CuSO4·5H2O，即得。
❖ C.比色用氯化钴液：取氯化钴约32.5g，加适量的 盐酸溶液(1→40)使溶解成500ml,精密量取2ml，置 锥形瓶中，加水200ml，摇匀，加氨试液至溶液由 浅红色转变至绿色后，加醋酸-醋酸钠缓冲液 (pH6.0)10ml，加热至60℃，再加二甲酚橙指示液5 滴,用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)滴定至溶 液显黄色.每1ml的乙二胺四醋酸二钠滴定液 (0.05mol/L)相当于11.90mg的CoCl2·6H2O。 根据 上述测定结果,在剩余的原溶液中加适量的盐酸溶液 (1→40)，使每1ml溶液中适含59.5mgCoCl2·6H2O， 即得。
5.制订溶液颜色检查法的意义
❖ 药物溶液的颜色及其与规定颜色的差异能在 一定程度上反映药物的纯度，是对通常利用 紫外检测器进行有关物质高效液相色谱法测 定的有效补充。
二.方法
1. 溶液颜色的检查方法包括：
❖ (1）目视法：经典方法 ❖ （2）色差计法：目视法无法辨清的品种选用
本法 ❖ （3）紫外可见分光光度法，利用吸光度测定
12.5
比色用硫酸铜液 水
7.2
68.8
0
72.7
4.0
66.4
0
岛津LC-2010AHT型高效液相色谱仪操作规程
岛津LC-2010A HT型高效液相色谱仪操作规程一、准备（一）准备所需的流动相，用合适的0.45μm滤膜过滤，超声脱气至少20min。
（二）根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱（注意方向）。
（三）配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用0.45μm滤膜过滤。
（四）检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。
二、开机接通仪器电源，按下系统控制器面板上的电源开关，色谱仪面板画面上显示要输入Login Pass-ID-No的对话框，输入00000后，按 [OK]，显示Menu画面，然后打开电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站。
三、更换流动相并排气泡打开排气阀，按下控制面板[purge]键，选择排气管道，排出管道内气泡，排气完毕后关闭排气阀。
四、设定洗脱参数（一）等度洗脱方式1.点击激活泵（和柱温），泵（和柱温）启动，pump（和oven）指示灯亮，用检验方法规定的流动相冲洗系统，一般最少需6倍柱体积（约30min）的流动相。
2.检查各管路连接处是否漏液，如漏液应予以排除。
3.观察泵控制屏幕上的压力值，压力波动应不超过1MPa。
（二）梯度洗脱方式1.以检验方法规定的梯度初始条件平衡系统。
2.在进样前运行1~2次空白梯度。
五、平衡系统打开“LC solution色谱工作站”软件，输入实验信息并设定各项方法参数后，等待系统平衡。
六、进样观察基线变化。
如果冲洗至基线漂移<0.01mV/min，噪声为<0.001mV时，可认为系统已达到平衡状态，可以进样。
设定好进样的位置、参数，点击确定，系统自动进样。
七、清洗柱及进样系统和关机（一）数据采集完毕后，关闭检测器，继续以工作流动相冲洗120min后，（如流动相含缓冲盐，换为高水相流动相向高有机相递增的流动相低流速冲洗120min），最后用甲醇或乙腈冲洗至少30min。
（二）冲洗完柱后，清洗整个流路及进样系统。
（三）清洗完成后，先将流量降到0，关闭电源开关。
绿原酸测定方法
高效液相色谱法测定杜仲叶中绿原酸含量
（董娟娥—2010-04-----2010-06）
一实验目的与要求
1、了解高效液相色谱仪的构造及工作原理；
2、学习高效液相色谱仪的应用过程；
3、掌握高效液相色谱法测定绿原酸的操作及注意事项。
二实验原理
1液--液色谱、分配色谱；
2反相色谱：流动相的极性大于固定相的极性,C18柱以18烷基键和材料为固定相；3通过检测装置将要测定的物质在等波长吸收的光信号转变成电信号显示出来，并通过物质浓度与信号之间的关系可以完成定量工作。
三仪器与试药
1仪器：美国Waters公司高效液相色谱仪（包括输入泵、进样系统、检测器等）；超声波清洗器、高速离心机、超纯水制备装置。
2试药：绿原酸标准品（德国），色谱甲醇（天津），冰乙酸（分析纯），乙醇（分析纯）、超纯水。
四色谱条件
色谱柱C18柱（VP-ODS 150mm×4.6mm，5um）；流速：1.0ml/min；流动相甲醇：水：冰乙酸=25：75：1 ；检测波长：240nm。
五实验步骤
1对照品溶液的配制：0.1mg/ml的色谱甲醇溶液
2供试品溶液的配制：称取0.07—0.08g杜仲叶粉（记录重量），置5ml离心管中，加入80%乙醇-水溶液4ml，超声波提取25min，充分混匀，取约1.5ml转移至2ml 的离心管于12000rpmin离心10miin；取上清液经0.45μm的微孔滤膜过滤，取5ul用于分析。
3计算校正因子吸取5ul标准溶液进样以峰面积和浓度计算校正因子。
4样品含量计算利用计算出的校正因子在色谱工作站计算出样品中绿原酸的含量。
六撰写实验报告。
岛津高效液相操作说明
LC-2010A/LC-2010C
操作说明书
（操作篇）
请仔细阅读本说明书，以便正确使用仪器。请将 操作说明书与仪器一起妥善保管。
分析机器事业部
前言
仪器使用前，请务必仔细阅读本操作说明书。对此次购买我公司仪器表示感谢。 在本仪器的操作说明书中，记述了仪器的安装要领、使用方法及使用注意事项、硬件有 效性、与相关的附件和选购件等。 在使用仪器之前，请仔细阅读操作说明书，根据内容正确使用。 阅读后，请将操作说明书放在可立刻拿到的地方妥善保存。
但是，非我公司正品，零部件的供应期限由其制造公司决定。
硬件有效性
各设备和分析系统的正常功能未经确认，则无法保证分析数据的可靠性。因此，通过进 行定期的硬件有效性确认功能正常，同时，有必要保留其记录。
本仪器在出厂前已经过严格的检查，其结果已被汇总在《检查结果书》内。关于硬件有 效性的详情，请参阅《维护篇》『3．硬件有效性』（)维－89页）。
耗电量 700VA 700VA 700VA
频率 50/60HZ 50/60HZ 50/60HZ
·请接地线。 否则发生故障或漏电时，会导致触电。另外，
在确保装置动作稳定上也很重要。 ·连接器的接地导线，不要插入电源插孔或触 摸，否则会导致火灾或触电。 ·电源软线上面，不要放置重物，不要接近热 器具。否则会损伤软线，导致火灾，触电或故 障。软线损伤时，请立即与本公司代表处或代 理商联系。 ·电源软线不要改装，不要过分弯曲和拉伸。 否则会损伤软件，导致火灾、触电或故障。
操-viii
LC-2010
安全注意事项
2．关于静电应注意的事项
使用易燃性有机溶剂作为流动相的液相色谱仪，必须经常注意防止引起火灾和爆炸等危 险。在各种事故原因中，特别是因静电引起的事故，状况很难掌握，只因偶然的原因即会引 起事故。现就静电事故的发生机理和防止事故的方法进行说明，请采取妥善的安全措施。
有效成分含量测定方法及操作规程-修订版
中药材、饮片有效成分含量测定方法及操作规程根据《中华人民共和国药典》2010年版（一部）中有效成分含量的测定以及附录V A中高效液相色谱法（外标法），建立中药材、饮片有效成分含量测定方法及其操作规程。
本规程适用于中药材、饮片有效成分含量测定。
1、原理高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
2、仪器及药品2.1 仪器高效液相色谱仪、分析天平、粉碎机、筛分器（20目）、冷凝管、圆底烧瓶、水浴锅、旋转蒸发仪、容量瓶、离心机、烧杯、分液漏斗、移液管等。
2.2 药品根据《中华人民共和国药典》2010年版（一部）中有效成分含量的测定项目的规定选用相应的色谱纯试剂。
3、操作规程3.1对照品溶液的配制按照各品种项目下的规定，精密称量对照品和供试品，配制成规定浓度溶液，分别精密取出一定量的溶液，注入进样瓶中，记录编号(或标记)，放入自动进样器中。
3.2 校正曲线的绘制及含量测定3.2.1开机→更换新鲜的流动相→打开计算机→打开1220液相电源开关→打开仪器的联机工作站→打开排液阀替换流动相→设定方法→调用方法平衡色谱柱，待基线平衡好之后进行进样分析3.2.2 设定序列→点击运行序列→等待仪器检测完毕。
3.2.3 建立积分事件→选择正确的定义峰积分→分析→编辑积分峰/组表→填写相应的项目(名称、ISTD标号为“0”、拟合类型、强制过零点、方法、编号、进样量等)→级别(1-5)中填入各个峰的含量。
3.2.4 调入第1级别数据→分析/单一级别校正→选择“校正”、“校正级别1”、“清除全部校正”→选择“确定”→调入第2级别数据→分析/单一级别校正→选择“校正”、“校正级别2”→调入第3级别数据→分析/单一级别校正→选择“校正”、“校正级别3”→依次校正到级别5→检查校正→导入报告选择编辑报告模版(外标法)→保存方法。
2010版中国药典英文
加热回流提取 Heat under reflux 2g, cut into pieces, with 20ml of ethanol for 1 hour, cool and filter, use the filtrate as the test solution. 取本品2g， 剪碎，加乙醇20ml，加热回流1 小时，放冷， 滤过，滤液作为供试品溶液。
d. 结果判断
The fluorescent spots in the chromatogram obtained with the
test solution correspond in position and colour to the spots
obtained with the reference drug solution; and an orange fluorescent spot in the chromatogram obtained with the test solution corresponds in position and colour to the spot in the chromatogram obtained with the reference solution. 供试品
萃取、过柱纯化 Extract the filtrate with two 15-ml quantities of nbutanol saturated with water, combine the n-butanol extracts, and evaporate to dryness. Dissolve the residue in 1 ml of dehydrated ethanol, add a quantity of alumina, stir well on a water bath, dry, and apply to a small (10-15mm in diameter) 或 Sepack C18 column packed with neutral alumina (200 mesh, 1g, 10~15mm in diameter ), pre-elute with 30ml of a mixture of ethyl acetate and methanol (3:1). Elute with 30 ml of a mixture of ethyl acetate and methanol (1:1), and collect the eluate. Evaporate to dryness and dissolve the residue in 0.5 ml of ethanol as the test solution.
高效液相色谱检查法标准操作规程
高效液相色谱检查法标准操作规程、一、目的：建立高效液相色谱检查法标准操作规程，使其操作规范化。
二、依据：中国药典2010版二部附录28。
三、适用范围：适用于高效液相色谱检查法标准操作。
四、责任者：质量部检验人员。
五、正文：1.简述高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。
由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。
高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。
有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。
常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。
高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。
检测器最常用的为可变波长紫外可见光检测器，其他检测器有如示差折光检测器和蒸发光散射检测器等。
色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。
梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。
2高效液相色谱仪的使用要求2.1按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705-90）”的规定作定期检定，应符合规定。
2.2仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。
2.3具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
3.操作前的准备3.1流动相的制备用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水，可用超级纯水器制得或用重蒸馏水。
中国药典2010版对应高效液相色谱图集
中国药典2010版对应高效液相色谱图集栀子分析栀子的高效液相色谱《中国药典》收载情况【来源】本品为菌草科植物栀子E lli s 的干燥成熟果实。
9-11月果实成熟呈红黄色时采收，除去 果梗及杂质，蒸至上汽或置沸水中略烫，取出，干燥。
【功能与主治】泻火除烦，清热利湿，凉血解毒；外用消肿止痛。
用于热病心烦，湿热黄疸，淋证涩痛，血热吐脑， 目赤肿痛，火毒疮疡；外治扭挫伤痛。
【含量测定】色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(15:85)为流动相；检测 波长为238nm。
理论板数按栀子苷峰计算应不低于1500。
对照品溶液的制备：精密称取扼子苷对照品适量，力卩甲醇制成每1mL含30 p g 的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取本品粉末(过四号筛)约0.1 g ，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25m L ,称定重量， 超声处理2盼钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10m L,置25mL量瓶中， 加甲醇至刻度，摇匀，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 ML ,注入液相色谱仪，测定，即得。
栀子样品来源：本品为菌草科植物栀子GWew'ayosTm'noWes Ellis 的干燥成熟果实。
9-11月果实成熟呈红黄色时采收，除 去果梗及杂质，蒸至上汽或置沸水中略烫，取出，干燥。
产地：江西。
对照品：栀子苷(含量：99.91%)供试品溶液的制备：取本品粉末(过四号筛)约0.1 g ,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25m L ,称定重量， 超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量職滤液10m L ,置25mL 量瓶中， 加甲醇至刻度，摇匀，取200 m L 加入800^ L 超纯水即得待测液。
对照品溶液的制备：精密称取栀子苷对照品适量，力卩入20%甲醇水制成每1mL含30 Mg的溶液，摇匀，即得。
高效液相色谱法 中国药品检验标准操作规范 2010年版
高效液相色谱法高效液相色谱法（《中国药典》2010年版二部附录V D）系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1 对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪，由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期鉴定并符合有关规定。
1.1 色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等）也有使用。
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。
离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。
填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。
孔径在15nm（1nm=10Å）以下的填料适于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。
除另有规定外，分析柱的填充剂一般在3~10μm之间。
粒径更小（约2μm）的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm）。
使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。
当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。
以硅胶为载体的键合固定相的使用温度不超过40℃，为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60℃。
流动相的pH指应控制在2~8之间。
当pH指大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH指小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。
偏差要求--2010年版中国药品检验标准操作规范
1、紫外-可见分光光度法(P58～59)：含量测定时供试品应称取2份，如为对照品比较法，对照品一般也应称取2份。
吸收系数检查也应称取供试品2份，平行操作，每份结果对平均值的偏差应在±0.5%以内。
作鉴别或检查可取样品1份。
吸收系数测定法样品应同时测定2份，同一台仪器测定的2份结果，对平均值的偏差应不超过±0.3%，否则应重新测定。
2、原子吸收分光光度法(P70)：供试品要求制备2份样品溶液，各测定3次。
取平均值从标准曲线上求得相应的浓度。
测定的相对标准偏差（RSD）应不大于3%，石墨炉法可适当放宽。
样品测定离散性大时应多测几次，以增加读数的可靠性。
《明胶药用空心胶囊铬检测方法指导原则》铬测定：由于微量测定，结果的偏差会较大，一般两份样品的相对偏差≤10%，取平均值即可。
3、荧光分析法（P73）：2份供试品测定结果，每份结果对平均值的偏差应在±1.5%以内，否则应重做。
4、火焰光度法（P75）：定量分析采用第一法或第二法时，要求制备2份供试品溶液，各测定3次，测定的相对标准偏差（RSD）应不大于5%。
样品测定离散性大时应多测几次，以增加读数的可靠性。
5、高效液相色谱法(P81)：供试品溶液与对照品溶液每份至少进样2次，由全部注样平均值（n ≥4）求得平均值，相对标准偏差（RSD）一般应不大于1.5%。
（此规定为05版药品操作规程上描述，10版无此规定）6、气相色谱法(P102)：精密称取供试品和对照品各2份，按-----。
每份校正因子测定溶液（或对照品溶液）各进样2次，2份共4个校正因子相应值的平均标准偏差不得大于2.0%。
多份供试品测定时，每隔5批应再进对照品2次，供试品测定完毕，最后再进行对照品2次，核对下仪器有无改变。
7、毛细管电泳法（P111）：标准品（对照品）溶液每份至少进样2次，由全部进样结果（n＞4），求得平均值，相对标准偏差（RSD）一般应不大于3.0%。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蒸发光散射检测器的应用
谨慎使用，充分优化实验条件。企业质控人员和药检 所人员均需要。
漂移管温度的优化：温度对响应值的影响无明显的规 律性。最优温度为在流动相基本挥发的基础上，产生 可接受噪音的最低温度。
雾化气流速的优化：流速越大，响应值越低。最优气
体流速应是在可接受噪音的基础上，产生最大检测响 应值的最低气体流速。
11
2010年版《中国药典》 对色谱柱的要求
填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、 表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键 合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试 品的保留行为和分离效果。 孔径在15nm（1nm=10Å）以下的填料适合 于分析分子量小于2000 的化合物， 分子量大于2000 的化合物，则应选择孔径在 30nm 以上的填料。
23
2010年版《中国药典》 对检测器的要求
紫外、荧光、电化学和示差折光检测器 的响应值与待测溶液的浓度在一定范围 内呈线性关系， 但蒸发光散射检测器响应值与待测溶液 的浓度通常呈指数关系，故进行计算时， 一般需经对数转换。
24
2010年版《中国药典》 对检测器的要求
不同的检测器，对流动相的要求不同 如采用紫外检测器，所用流动相应符合 紫外-可见分光光度法（附录Ⅳ A）项下 对溶剂的要求；采用低波长检测时，还 应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波 长，并选用色谱级有机溶剂。 蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不 允许使用含不挥发性盐组分的流动相。
2010年版《中国药典》 高效液相色谱法修订内容
河南省食品药品检验所 2010,10
1
常见的分离方式
蒸馏 离心 电泳 过滤 超滤
色谱
2
色谱法的分离原理是：
溶于流动相(mobile phase)中的各 组分，经过固定相时，由于与固定相 (stationary phase)发生作用（吸附、 分配、离子吸引、排阻、亲和）的大 小、强弱不同，那么在固定相中滞留 的时间就不同，故从固定相中流出的 先后也就不同。 这种方法被称为色层法、层析法。
224.000
23.800
8.10
9.00 [min]
48.000
4.04 4.86 5.28
-40.000 0.00
3.50
7.00
10.50
14.00
17.50
18.08
21.00
24.50
.00
31.50
35.00 [min]
图 硫酸核糖霉素有关物质色谱图 （蒸发管温度：110℃，不分流模式）
8
传统硅胶基质填料的pH 局限性
1
键合相水解
硅胶溶解
0.1 0 2 4 6
pH
8
10
12
14
XTerra 杂化填料 —宽pH范围
9
2010年版《中国药典》 对流动相的要求
当色谱系统中需使用pH 值大于8 的流动相时， 应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体 并具有高表面覆盖度的键合硅胶填充剂、包覆 聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅 胶填充剂等； 当需使用pH 值小于2 的流动相时，应选用耐 酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位 阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷 基硅烷键合硅胶填充剂，或有机-无机杂化填 充剂等。
3.34 16.48
3.34
400.000 [mv]
70.000 [mv]
54.600
312.000
7.68 4.04
39.200
8.400
136.000
总杂质：4.18%
7.10 7.68
-7.000 0.00
0.90
1.80
2.70
3.60
4.50
4.86
5.40
5.28
6.30
7.20
7.10
14
2010版药典二部中色谱柱的使用情况
色谱柱类型 C18柱 C8柱 氰基柱 硅胶柱 苯基柱 品种数 1210个 93个 21个 31个 9个 色谱柱类型 氨基柱 丁基柱 三甲基硅烷柱 二羟基丙基硅烷键 合硅胶柱 苯乙烯-二乙烯基柱 品种数 5个 3个 2个 1个 1个
15
2010版药典二部中色谱柱的使用情况
32
示差折光检测器的应用：
原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组
分浓度。 优点：通用型检测器 缺点： 1）对温度变化敏感
2）对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测
3）属于中等灵敏度的检测器
33
示差折光检测器的应用：
葡甲胺 麦芽糖 乳糖
山梨醇 山梨醇注射液 甘露醇 甘露醇注射液
4.85
5.40
6.30
7.20
7.04
7.60
8.10
9.00 [min]
48.000
-40.000 0.00
3.50
7.00
10.50
14.00
17.50
17.92
21.00
24.50
28.00
31.50
35.00 [min]
图 硫酸核糖霉素有关物质色谱图 （蒸发管温度：65℃，分流模式）
30
蒸发光散射检测器的应用
7
2010年版《中国药典》 对流动相的要求
试验中，如需调整流动相组分比例时，以组分 比例较低者（小于或等于50%）相对于自身 的改变量不超过±30%，且相对于总量的改 变量不超过±10%为限 如30%相对改变量的数值超过总量的10%时， 则改变量以总量的±10%为限。 流动相的pH 值：应控制在2～8 之间。当pH 值大于8 时，可使载体硅胶溶解；当pH 值小 于2 时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。
倍他环糊精
羟丙基倍他环糊精
乳果糖口服溶液
34
电导检测器的应用：
原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变化来测
定电离物质含量。
优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用于梯度洗脱。 缺点：对温度变化敏感（每升高1度，电导率增加2%-2.5%)。 广泛应用于离子色谱。 主要用于检测水溶性无机和有机离子。
13
2010年版《中国药典》 对色谱柱的要求
1、色谱柱 （1）常用色谱柱填料粒径3～10μm （2）微径柱填料粒径 约2μm（UPLC或UFLC） 硬件须匹配 色谱条件可适当调整 以品种正文规定条件的测定结果为准 2、柱温 （1）通常为室温（通常不超过40℃） （2）以硅胶为载体的普通色谱柱，最高使用温度不得超过 60℃ （a）提高灵敏度，峰高的对数与柱温呈线性关系 （b）为改善选择性（改善分离效果）
3
色谱分离的机理
分离是一个物理的 过程。
固定相(Stationary Phase) 流动相(Mobile Phase) 样品(溶解于流动相中的溶质)
4
色谱法在2010年版药典二部的应用
柱色谱 纸色谱 薄层色谱 气相色谱
高效液相色谱 离子色谱 分子排阻色谱
凝胶色谱
正相色谱 反相色谱 离子对色谱
缬沙坦 盐酸帕罗西汀 a-酸性糖蛋白柱 手性色谱柱α1酸性蛋白柱 手性色谱柱chiralcel OD-RH
瑞格列奈 瑞格列奈片
苯磺酸顺阿曲库铵 注射用苯磺酸顺阿曲库铵 甲氨蝶呤
甲氨蝶呤片
注射用甲氨蝶呤
牛血清白蛋白键合硅胶柱
16
色谱柱的应用：高效液相色谱
技术B：不同的配体密度
Symmetry® C18
12
2010年版《中国药典》 对色谱柱的要求
除另有规定外，分析柱的填充剂粒径一般在 3μm~10μm 之间。 粒径更小（约2μm）的填充剂常用于填装微径 柱（内径约2mm），使用微径柱时，输液泵 的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体 积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需 作适当的调整。 当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规 定的色谱条件的测定结果为准。
毛细管电泳
电泳法
5
什么是液相色谱？
6
2010年版《中国药典》 对流动相的要求
反相色谱系统的流动相： 首选甲醇－水系统（采用紫外末端波长检测时， 首选乙腈-水系统），如经试用不适合时，再 选用其他溶剂系统。 应尽可能少用含有缓冲液的流动相，必须使用 时，应尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。 由于C18 链在水相环境中不易保持伸展状态， 故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相 色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不 低于5％，否则C18 链的随机卷曲将导致组分 保留值变化，造成色谱系统不稳定。
100
0
-100 0 10 20 30 40 50 min
迪马公司（钻石，5μm，4.6mm×250mm） 柱色谱图
19
色谱柱的应用：高效液相色谱
Waters(XBridgeTMShield RP18 5μm，4.6mm×250mm) 柱色谱图
20
色谱柱的应用：高效液相色谱
资生堂MGⅡ5μm，4.6mm×150mm色谱柱图谱
21
2010年版《中国药典》 对检测器的要求
最常用的检测器为紫外检测器，包括二极管阵 列检测器， 其他常见的检测器有： 荧光检测器 蒸发光散射检测器 示差折光检测器 电化学检测器 质谱检测器等
22
2010年版《中国药典》 对检测器的要求
紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器， 其响应值不仅与待测溶液的浓度有关，还与化 合物的结构有关； 蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型 检测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散 射检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎 仅与待测物的质量有关； 二极管阵列检测器可以同时记录待测物的吸收 光谱，故可用于待测物的光谱鉴定和色谱峰的 纯度检查。