高效液相色谱法的标准操作规程
高效液相色谱法的种类 液相色谱操作规程
高效液相色谱法的种类液相色谱操作规程高效液相色谱法按分别机制的不同分为液固吸附色谱法、液液调配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
1．液固色谱法使用固体吸附剂，被分别组分在色谱柱上分别原理是依据固高效液相色谱法按分别机制的不同分为液固吸附色谱法、液液调配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
1．液固色谱法使用固体吸附剂，被分别组分在色谱柱上分别原理是依据固定相对组分吸附力大小不同而分别。
分别过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。
常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5～10μM。
适用于分别分子量200～1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。
常用于分别同分异构体。
2．液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分别原理是依据被分别的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分别。
分别过程是一个调配平衡过程。
涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必需预先用固定相饱和，以削减固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区分常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分别和收集多而杂化。
由于涂布式固定相很难避开固定液流失，现在已很少接受。
现在多接受的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法（NPC）和反相色谱法（RPC）。
正相色谱法接受极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调整组分的保留时间。
常用于分别中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调整保留时间。
适用于分别非极性和极性较弱的化合物。
高效液相色谱测定法标准操作规程
标准操作规程1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。
2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。
3责任：QC人员对本SOP实施负责。
4容高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
4.1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。
超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
4.1.1.色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2〜8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。
2020版《中国药典》高效液相色谱法检验操作规程
2020版《中国药典》⾼效液相⾊谱法检验操作规程⼀、⽬的：制订详尽的⼯作程序，规范检验操作，保证检验数据的准确性。
⼆、范围：本操作规程适⽤于⾼效液相⾊谱法的检验操作。
三、职责：1、检验员：严格按操作规程操作，认真、及时、准确地填写检验记录；2、化验室负责⼈：监督检查检验员执⾏本操作规程。
四、内容：简述：⾼效液相⾊谱法系采⽤⾼压输液泵将规定的流动相泵⼊装有填充剂的⾊谱柱，对供试品进⾏分离测定的⾊谱⽅法。
注⼊的供试品，由流动相带⼊⾊谱柱内，各组分在柱内被分离，并进⼊检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理⾊谱信号。
1、对仪器的⼀般要求和⾊谱条件⾼效液相⾊谱仪由⾼压输液泵、进样器、⾊谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
⾊谱柱内径⼀般为2.1～4.6mm,填充剂粒径为2～10µm。
超⾼效液相⾊谱仪是耐超⾼压、⼩进样量、低死体积、⾼灵敏度检测的⾼效液相⾊谱仪。
1.1⾊谱柱1.1.1⾊谱柱的类型1.1.1.1反相⾊谱柱：以键合⾮极性基团的载体为填充剂填充⽽成的⾊谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常⽤的填充剂有⼗⼋烷基硅烷键合硅胶、⾟基硅烷键合硅胶和苯基硅烷键合硅胶等。
1.1.1.2正相⾊谱柱：⽤硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充⽽成的⾊谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可⽤作反相⾊谱。
1.1.1.3离⼦交换⾊谱柱：⽤离⼦交换填充剂填充⽽成的⾊谱柱。
有阳离⼦交换⾊谱柱和阴离⼦交换⾊谱柱。
1.1.1.4⼿性分离⾊谱柱：⽤⼿性填充剂填充⽽成的⾊谱柱。
1.1.2⾊谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表⾯积、键合基团的表⾯覆盖度、载体表⾯基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响⾊谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的⾊谱柱。
1.1.3温度会影响分离效果，品种正⽂中未指明⾊谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
高效液相色谱法标准操作规程
范围：原料、产品职责：检验室对本规程的实施负责正文：1.原理——高效液相色谱法是将具一定性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。
——高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。
2.操作前的准备2.1流动相的制备用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水。
凡规定PH值的流动相、应使用精密PH计进行调节。
配制好流动相应通过适宜的0.45µm滤膜滤过，用前脱气，应配制足量的流动相及时待用。
2.2供试溶液的配制供试品用规定溶剂配制成供试溶液定量测定时，对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。
供试溶液在注入色谱仪前，一般应经适宜的0.45µm滤膜滤过。
必要时在配制供试溶液前，样品需经提取净化。
以免对色谱系统产生污染或对色谱干扰。
3.系统适用性试验——按各品种项下要指法训练对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。
3.1色谱柱理论板数（n）在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半峰高宽（Wh/2），按n=5.54(tR/ Wh/2)2计算色谱柱的理论板数。
如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。
3.2分离度定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。
分离度（R）的计算公式为：2（tR2- tR1）R=W1+W2式中tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间；W 1及W2为此相邻两峰的峰宽。
高效液相色谱法标准操作规程
高效液相色谱法标准操作规程1. 目的建立高效液相色谱法标准操作规程，规范高效液相色谱法检验操作，保证检验操作规范化。
2. 范围适用于高效液相色谱法检验操作。
3. 术语或定义N/A4. 职责质量控制部对本规程的实施负责。
5. 程序5.1依据《中国药典》2020年四部及2019年版《中国药品检验标准操作规范》。
5.2 简述高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
5.3 对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪，由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期检定并符合有关规定。
5.3.1色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等) 也有使用。
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。
离子交换色谱系统使用离子交换填充剂; 分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。
填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。
孔径在15nm(lnm=10A)以下的填料适于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。
除另有规定外，分析柱的填充剂粒径一般在3～10μm之间。
粒径更小(约2μm)的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm) 。
使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。
当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。
高效液相色谱标准操作规程
目的：建立高效液相色谱使用标准操作规程，使其操作规范化。
范围：高效液相色谱。
责任人：高效液相色谱操作者和设备维修员。
内容：1 设备描述功能强大的高效液相色谱仪能适用于各种分析目的。
仪器具有完善的GLP/GMP法规认证，自我评价功能。
操作简便，高度可靠，灵敏度高，便于维护，组合灵活。
适用于从制备色谱，常规色谱到半微量色谱的一切范围。
1.1 主要技术参数1.1.1 泵类型：单泵1.1.2 流速设定范围：0.001-5ml/min（10-400kgf/cm2），001-9.999ml/min（10-200kgf/cm2）1.1.3 流速准确度：±2%或2μ1/min（0.1-5ml/min，10-400kgf/cm2，水，室温20o C）。
1.1.4 流速精密度：±0.3%（内以水作为流动相，流速为0.1-5ml/min，10-400kgf/cm2，水，室温20o C）1.1.5 压力设定范围：1.0－39.2MPa（10-400Kgf/cm2）1.1.6 压力准确性（±10%或±1.0MPa）1.1.7 检测器：SPD-10Avp灯1.1.8 光源：D21.1.9 波长范围：190nm-600nm1.1.10 光谱带宽：8nm1.1.11 波长精度：±1nm1.1.12 波长重现性：±0.1nm高效液相色谱标准操作规程编号ZL-C-616版次：01第 2 页共 4页1.1.13 漂移：±2x10-4AU/时（250nm，室温恒定，池内为空气）1.1.14 噪音水平：±0.35x10-5AU（250nm，池内为空气，时间常数相当于2秒）1.1.15 响应时间：相当于0.05,0.1,0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,6.0,8.0,10.0秒的10转换档1.1.16 量程：0.0001-2.56AUFS,最小设定间隔可为0.0001AUFS1.1.17 调零：自动调零功能，基线位移功能1.1.18 极性：可转换1.1.19 检测池（光路长，容量，耐压、接触液体部件材料）：10nm,8μ1,30kgf/cm2,SUS316,特氟隆，石英1.1.20 2波长同时测定*2波长：190-370nm或371-600nm内的任意2波长1.1.21 2波长同时测定*2采样周期：1个波长需1.2秒1.1.22 比例色谱图显示*2：输出所设定的2波长的比1.1.23 波长扫描文件数：3（1个为背景用，输出减去背景的数据）1.1.24 波长扫描波长间隔：1-5nm，5档设定，用W灯时为2-5nm1.1.25 波长扫描速度：10nm/秒-50nm/秒，5档设定（根据波长间隔设定）1.1.26 时间程序控制：检测器本身，系统控制器均可1.1.27 时间程序设定项目：波长（2含波长）、自动调零、量程、标记、晌应时间、波长扫描、事件、极性、灯ON/OFF、LOOP（程序的循环）1.1.28 时间程序本体的步骤数：最大32步骤1.1.29 记录仪输出：10mv1.1.30 积分仪输出：0.5,1,2,4,1.25,1.5AU/V,6档转换1.1.31 光源使用时间监测功能：能够记忆到9999.9小时1.1.32 体积、重量：W260XD430XH140mm,13kg1.1.33 使用环境温度范围：4-35o C1.1.34 所需电源：AC220V,150VA,50/60HZ2 设备操作使用方法2.1 测试准备2.1.1 流动相的配制：配制后的流动相先过滤，用溶剂过滤器处理，使流动相充分混合以清除流动相中的气泡。
高效液相色谱仪操作规程
高效液相色谱仪操作规程1 溶剂输送泵操作1.1 安装后的准备1.1.1 在烧杯中装入大约100mL异丙醇，在烧杯中放入吸滤器，将一段SUS 管的一端连接在泵出口，而另一端放入烧杯中。
1.1.2 将排液管的一端连接到排液管接口上，另一端放入废液瓶中。
1.1.3 打开电源ON，显示初始屏幕。
1.1.4 逆时针方向转动排液阀180度，打开排液阀。
按purge键，泵开始运行，指示灯亮。
1.1.5 冲洗完毕后，按一次func键，进入流速设定状态，并且设定流速1mL/min。
1.1.6 将排液阀旋钮顺时针方向旋转到底，关闭排液阀。
1.1.7 按pump键，泵启动，指示灯亮。
大约3--5分钟后，再按pump键，泵停止运行，指示灯灭，完成操作准备。
1.2 运行的检查1.2.1 开始运行前务必确保：储液瓶中装有流动相，并且吸滤器已经放入储液瓶中。
排液管的另一端已经放入废液瓶中。
1.2.2 将排液阀旋钮逆时针方向旋转180度，打开排液阀。
1.2.3 按CE 键返回到初始屏幕。
按pump键，泵大约以1ml/min的流速运行（指示灯亮）。
1.2.4 观察流动相流出排液管大约10秒钟。
在此期间，流动相应连续流出并且无气泡出现。
1.2.5 再按pump或purge键，泵停止运行，指示灯灭。
1.3 上面两步完成后仪器进入工作状态。
2 紫外—可见检测器操作2.1 按下电源开关，打开仪器，将发生如下情况。
2.1.1 显示板上所用光点及指示灯亮。
自动检查内存，瞬间显示控制程序的版本号。
2.1.2 预热大约20sec，仪器的单色器找到其初始位置（大约1分钟）。
2.1.3 （使用氘灯的亮线（656nm）自检波长的准确性（大约10 sec）。
2.1.4 如果没有检查出错误，显示正确信息，几秒钟后，由初始屏幕代替原信息2.1.5 如果自检没有错误，屏幕显示正确，此时可以进行操作。
为初始状态，将显示初始屏幕。
2.2 设定测定波长2.2.1 按CE键。
高效液相的标准操作规程(SOP)
WATERS高效液相的标准操作规程（SOP）1流动相的处理1.1过滤溶剂溶剂在使用前要用过滤器过滤，有机相和纯水相通常可以不过滤，如果使用固体化学试剂（缓冲盐）配制流动相，过滤特别重要，不能让固体微粒污染泵，阻塞进样器和柱头过滤片。
同时一些缓冲盐溶液过夜后易生菌，使用前要抽滤或者重新配制。
实验室应有水溶性和脂溶性两种过滤膜供选择（反光面朝上），过滤水相时，要先用1-2ml 水润湿过滤膜，有助于快速抽滤。
1.2保持储液瓶的清洁用普通溶剂瓶作流动相储液器应不定期废弃瓶子，最后一次应用HPLC级的水或溶剂清洗，不能在清洗过程中留下污迹。
流动相瓶子要保持清洁。
1.3保证溶剂的质量一定要用HPLC级的溶剂，水也应达到HPLC级，同样也要使用高纯度的缓冲盐。
1.4 故障及解决方法1.4.1 流动相脱气不充分流动相受热，或者流动相不同组分混合时会有气体产生，气泡进入泵内引起压力波动，增加噪音，色谱图上出现毛刺。
可试用下列方法解决问题：a、流动相再脱气；b、采用更有效的脱气方法（如抽滤）或两种方法配合使用；c、改系统内混合为系统外预混合。
1.4.2 流动相供给不畅流动相用完，管道中吸入气体引起泵压力不稳。
应经常观察储液器中流动相的量，加足流动相保证所有的样品分析完毕。
输液管道上装滤头沉至瓶底，储液器盖上留一小孔正好夹住进液管，使其不能上下移动。
过滤器阻塞会引起管道和泵腔进气泡，压力不稳。
压力不稳时，如果已经排除流动相混合不均匀的状况，则观察滤头外部是否长毛（一般水相滤头易长毛），去掉过滤器后如果系统运转正常，说明已找出问题，是过滤器被微粒所阻塞或长霉。
解决方法：a、换上新的过滤器（滤头）。
b、将滤头拆下，先用纯水超声15min，再换50%甲醇水溶液超声，再换纯甲醇超声，如果是水相的滤头，在安装前还需要用纯水超声。
如果上述还不能解决问题，则使用10%稀硝酸水溶液超声滤头，可起到除去菌类微生物的作用。
1.4.3 检测器和流动相管路被污染由于污染，噪音越来越大，检测器被污染。
高效液相色谱仪操作规程
高效液相色谱仪操作规程
《高效液相色谱仪操作规程》
一、实验目的
本实验旨在通过高效液相色谱仪分析样品，准确测定目标化合物的含量，并学习高效液相色谱仪的操作方法和技巧。
二、实验设备
1. 高效液相色谱仪
2. 注射器
3. 色谱柱
4. 移液管
5. 色谱仪软件
三、操作步骤
1. 打开高效液相色谱仪的电源并进行系统初始化，启动色谱仪软件。
2. 调整流速，进样量等参数，使得实验条件符合要求。
3. 将样品通过移液管注入色谱柱中，注意避免样品泡沫和气泡的产生。
4. 设置色谱条件，如梯度洗脱，流速等，启动色谱分析。
5. 记录实验数据和结果，并进行数据处理和分析。
6. 清洗色谱仪，保持设备清洁。
四、实验注意事项
1. 在操作色谱仪时，要严格按照操作步骤进行，严禁随意更改参数。
2. 在进行样品进样时，要小心操作，避免产生气泡和样品泡沫。
3. 在进行色谱分析时，注意梯度洗脱条件的设置，保证分析结果准确。
4. 在实验结束后，及时清洗色谱仪，保持设备干净。
五、实验结果
根据实验数据和结果，可以得出目标化合物的含量和纯度，并进行结果的解释和分析。
通过《高效液相色谱仪操作规程》的学习，使我们更加熟悉高效液相色谱仪的操作方法和技巧，能够准确进行样品分析，为科研工作的开展提供了重要的技术支持。
高效液相色谱法的标准操作规程
高效液相色谱法的标准操作规程1 定义及概述：1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。
由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。
1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。
有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。
常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。
1.3 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理组成。
检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外—可见检测器。
色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。
梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。
2 高效液相色谱仪的使用要求：2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程”的规定作定期检定，应符合规定。
2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无渗漏连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。
2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
3 操作前的准备：3.1 流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水。
对规定pH值的流动相，应使用精密pH 计进行调节。
配制好的流动相应通过0.45µm适宜的滤膜滤过，用前脱气。
高效液相色谱法操作规程与注意事项
⾼效液相⾊谱法操作规程与注意事项⾼效液相⾊谱法操作规程与注意事项1.程序1.1.仪器及性能要求：所⽤的仪器为⾼效液相⾊谱仪，由泵系统，进样系统，⾊谱柱，检测器和⾊谱数据处理系统组成。
1.1.1.泵系统：HPLC泵系统通过⾼压⼒管和设备从溶剂瓶中吸取计量的流动相到柱⼦中。
现⾏的泵系统有⼀元或多元计算机控制的计量泵组成，这些泵可以按照梯度洗脱的要求改变流动相的⽐例或者是按等度洗脱的要求混合流动相。
1.1.2.进样系统：化合物被溶解在流动相或合适的溶剂中，可以通过⼿动进样器或定量环，或⾃动进样器转移到流动相中。
⾃动进样器由可存放进样瓶的卡盘组成，进样瓶的顶部有⼀个可以刺⼊的隔膜，进样针通过这个隔膜将样品转移到⼀个定量环中然后输送到⾊谱系统中。
1.1.3.⾊谱柱：最常⽤的⾊谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相⾊谱系统使⽤⾮极性填充剂，以⼗⼋烷基硅烷键合硅胶最为常⽤，⾟基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅胶和氨基键合硅胶）也有使⽤。
正相⾊谱系统使⽤极性填充剂，常⽤的填充剂有硅胶等。
离⼦交换⾊谱系统使⽤离⼦交换填充剂量；分⼦排阻⾊谱系统凝胶或系统⾼分⼦多孔微球等；对映异构体的分离通常使⽤⼿性柱。
除另有规定外，柱温为室温。
1.1.4.检测器：常⽤的检测器包括紫外分光检测器，⽰差折光检测器，⼆极管阵列检测器。
固定波长检测器在单⼀波长下运⾏，典型的波长是254nm，通过低压⼒的汞灯发射。
可变波长的检测器包含持续的能源，例如氘灯或⾼压⼒氙灯，通过单⾊器或⼲涉过滤器产⽣⼀定波长的单⾊光。
1.2.系统适⽤性试验1.2.1.为了确定最终运⾏系统的有效性，应当进⾏系统适⽤性试验。
整个系统可以⽤以下指标来评价：信噪⽐、理论塔板数，分离度，重复性，拖尾因⼦，其指标及计算⽅法应在相关分析⽅法中予以规定，如果没有专门的规定，按以下⽅法进⾏计算：信噪⽐：⽤于评价⾊谱系统检测微量物质的能⼒，美国药典的计算公式：S/N=2H/h，H为峰顶到基线的距离，h为基线中噪声峰最⼤值与最⼩值的差，该段基线需取≥5倍半峰⾼宽的距离，如果有可能，⽬标峰两侧取相等的距离（如图1）。
高效液相色谱（HPLC）操作规程
高效液相色谱（HPLC）操作规程一操作1.准备工作⑴流动相的准备应根据实验选择合适的流动相，所有流动相原则上应选择HPLC级别，水应选择超纯水，并应保持新鲜。
所有流动相在进行实验前应经过相应的脱气处理，脱气时间应根据流动相的量相应增加，但一般超声脱气不应少于20min。
在实验过程中应保证足够的流动相，流动相的量与流速、洗脱时间等有关，应根据具体情况进行准备。
⑵样品的准备对于待测的样品，在进样之前应经过滤膜过滤，根据样品的不同选择不同种类、不同直径的滤膜。
2. 排气打开purge阀，键入stop→prime，直到无气泡停止stop。
B泵同样操作。
关闭purge阀。
3. 开机打开电脑主机和显示器，点击Galaxie，进入工作站。
选择系统，点击Agilent HPLC.点击overview，可观察仪器各部分状态。
打开泵及检测器的电源。
二 分析方法建立1.进入工作站系统界面。
点击数据，文件→新建→方法，出现视窗，点击前进即可。
键入方法名和相应描述→点击ok后出现方法文档。
2.210的设定点击控制→210图标→Elution。
选择流动相A和B的种类。
Compressibility、Pressure Constant以及Refill Time属于内置参数无需设定。
设置A、B流动相的比例，通过改变B的比例设定。
如需梯度洗脱，则根据方法对Equilibrium Time 和Hold Time进行设定。
点击Misscellaneous。
Start Mode选择Inject Trigger on Pump A。
End of Sequence 选择Leave Pump on。
210设定结束。
3.325的设定点击325图标，选择Signal。
其中Detector Bunch Rate建议设置成2（10Hz），Noise Monitor Length建议设定成64，Response Time建议设定0.5。
根据方法设定相应波长。
高效液相色谱仪标准操作规程
高效液相色谱仪标准操作规程1目的建立高效液相色谱仪(Waters2695-2996Allianee)标准操作规程，为了使操作者操作高效液相色谱仪(Waters2695-2996Allianee)更规范，保证结果更精确。
2范围适用于高效液相色谱仪(Waters2695-2996Allianee)标准操作规程。
3职责操作者。
4程序4.1开机4.1.1打开Allianee电源开关，仪器进入自检状态。
4.1.2打开检测器，“STATUS”闪烁，4分钟后“LAMP”亮，仪器正常。
4.1.3点击menu/Status进入“STATUS”界面，按direactfunction，选择dryprime后，选择“A/B/C/D”四个泵，点击“Enter”，管道快速充满液体。
4.1.4打开电脑，点击“Empower”登陆，输入帐户“system”，密码“manage”，进入“EmpowerPro”。
4.1.5在配置系统中新建一项目。
4.1.6点击“运行样品”，选择“项目”，3分钟后仪器进入运行界面。
4.2样品检测4.2.1点击“编辑”，编辑仪器方法并保存方法名。
4.2.2点击“新建方法组”，编辑方法组名。
(要求方法组与仪器方法同名)4.2.3标识样品名、进样品/进标准品、样品位置、进样体积、运行时间后，于“file”中保存参数4.2.4点击“准备”，仪器显示“准备进样”后，点击进样。
4.2.5点击鼠标右键，选择“波长”和“正好运行时间”，保存参数4.3数据处理4.3.1点击“浏览项目”，于“进样”栏中双击所选的样品名，进入“通道”栏，双击所选的样品名，进入样品数据主窗口4.3.2选择波长，点击“提取色谱”后，积分或以处理方法向导处理数据，保存处理方法后，于“file”“保存”中保存“全部”。
4.4打印报告4.4.1于所选“浏览项目”结果栏中，选择已处理好的数据（如果没有，点击更新），点击右键，选择预览报告。
4.4.2选择报告方法，确定后，进入报告预览状态。
高效液相色谱法标准操作规程
1.目的：规范高效液相色谱法检验操作，保证检验的质量。
2.范围：适于本公司原辅料、成品的高效液相色谱法操作。
3.责任：质量管理科、中心化验室、检验员。
4.检验依据：《中国药典》2015年版四部高效液相色谱法操作方法。
5.内容：5.1 简述◆高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。
由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。
◆高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。
有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。
常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。
◆高效液相色谱仪基本由泵，进样器，色谱柱，检测器和色谱数据处理系统组成。
检测器最常用的为可变波长紫外可见光检测器，其他检测器有如示差折光检测器和蒸发光散射检测器等。
色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。
梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。
◆高效液相色谱仪的使用要求◆按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705－90）”的规定作定期检定，应符合规定。
●仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。
◆具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
5.2 操作前的准备◆流动相的制备用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查．应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水，可用超级纯水器制得或用重蒸馏水。
高效液相色谱操作规程
高效液相色谱操作规程第一部分：进样前准备工作1．溶剂LC的溶剂包括：自己的流动相，超纯水，体积比为1：1的流动相与超纯水的混合溶液。
例如，如果你的流动相是甲醇：水＝85：10，那么你需准备的溶剂如下：纯甲醇，超纯水，50％甲醇水混合液。
（以下以甲醇为流动相为例）1．1 过滤使用前，应将纯的甲醇（要求是色谱纯，最好是进口的色谱纯）用0.45µm的滤膜过滤。
50％的甲醇水溶液也用过滤过的甲醇和超纯水配。
注意：此不操作切不能省，尤其是国产色谱纯。
否则，很容易造成色谱柱的堵塞，造成柱压过高，从而使你的测定工作不能进行。
1．2脱气使用前所有的溶剂都要用超声清洗仪脱气15min.原因：液相色谱最重要的一点就是整个流路不能有气泡，否则会造成峰分离不好，响应不理想等后果。
而使用的溶剂或多或少都会融入空气，所以使用前必须脱气。
2．样品样品包括标样和实际样品。
所有样品的最后性状都应是透明的液体。
为避免堵塞，样品同样得用0.45µm的滤膜过滤。
第二部分:仪器使用1.将吸液头放进相应的流动相中.通常标有A的放入纯水中,B泵放进纯有机溶剂中.没有任何标记的吸液头放进50%的有机溶剂水混合液中.2.开仪器.开启顺序为:CTO-20A,SIL-20A,SPD-M20A,LC-20AT.等待几秒钟后,开电脑.3.点击工作站图标,如图: .之后出现界面4.点击出现界面5.点击OK.可听到蜂鸣一声,仪器连接正常,进入工作站.6.设置方法.点击界面中的高级须更改的参数主要有:点击数据采集------输入所需的LC停止时间------点击应用于所有的采集时间点击泵-----选择模式里的低压梯度-----设置泵A总流速,溶剂B浓度.点击柱温箱------设置柱温箱温度.点击自动排气------选择流动相A,流动相B.方法设置完成.另存方法文件到自己建立的文件夹里.保存完成后,点击下载(界面右上角).7.点击自动排气图标.出现排气界面.8.排气完成.点击仪器开关图标,泵开关图标,柱温箱开关图标.9.点击绘图.开始走基线.通常需走30分钟,视基线的好坏更改而定.基线不平,则需更长的分析时间.点击更该分析时间图标,输入所须的时间,点击确定.10.基线平衡之后,就可以进样.将样品放入样品架.如果是单次进样，就点击单次运行。
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高效液相色谱法的标准操作规程1 定义及概述：1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。
由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。
1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。
有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。
常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。
1.3 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理组成。
检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外—可见检测器。
色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。
梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。
2 高效液相色谱仪的使用要求：2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程”的规定作定期检定，应符合规定。
2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无渗漏连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。
2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
3 操作前的准备：3.1 流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水。
对规定pH值的流动相，应使用精密pH 计进行调节。
配制好的流动相应通过0.45µm适宜的滤膜滤过，用前脱气。
应配制足量的流动相及时待用。
3.2 供试溶液的配制：供试品用规定溶剂配制成供试溶液。
定量测定时，对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。
供试溶液在注入色谱仪前，一般应经0.45µm适宜的滤膜滤过。
必要时，在配制供试溶液前，样品需经提取净化，以免对色谱系统产生污染。
3.3 检查上次使用记录和仪器状态：检查色谱柱是否适用于本次试验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动相能否互溶，流动相的pH值与该色谱柱是否相适应，仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。
4 操作：4.1 泵的操作：4.1.1 用流动相冲洗滤器，再把滤器浸入流动相中，启动泵。
4.1.2 打开泵的排放阀，用专用注射器从阀口抽出流动相约20ml，设置高流速（9ml/min）或用冲洗键(PURGE)进行充泵排气，观察出口处流动相呈连续液流后，将流速逐步回零或停止（STOP）冲洗，关闭排放阀。
4.1.3 将流速调节至分析用流速，对色谱柱进行平衡，同时观察压力指示应稳定，用干燥滤纸片的边缘检查柱管各连接处应无渗漏。
初始平衡时间一般约需30分钟，如为梯度洗脱，应在程序器上设置梯度状态，用初始化比例的流动相对色谱柱进行平衡。
4.2 紫外可见光检测器和色谱数据处理机的操作。
4.2.1 开启检测器电源开关，选择光源（氘灯或钨灯），选定检测波长，待稳定后，测试参比和样品光路的信号应符合要求，设置吸收度方式和检测响应时间（一般不大于1秒），设置薄刻度吸收值（适用于记录仪）。
4.2.2 开启色谱处理机，设定处理方法，初步设定衰减、纸速、记录时间、最小峰面积等参数，或设定记录仪的纸速和衰减。
4.2.3 进行检测器回零操作，检查处理机的电平（LEVEL），应符合要求，或检查记录仪的笔应处在设定的起始位置，如有变动，可继续回零操作直至符合要求。
4.2.4 记录基线，待稳定后，进行处理机斜率测试，符合要求方能进行操作。
4.3 进样操作（六通阀式进样器）4.3.1 把进样器手柄放在载样位置（LOAD）。
4.3.2 用供试溶液清洗配套的注射器，再抽取适量样品，如用定量环（LOOP）载样，则注射器抽取量应不少于定量环容积的5倍，用微量注射器定容进样时，进样量不得多于环容积的50%。
在排除气泡后方能向进样器中注入供试溶液。
4.3.3 把注射器的平头针直插至进样器的底部，注入供试溶液，除另有规定外，注射器应取下。
4.3.4 把手柄转至注样位置（INJECT），定量环内供试溶液即被流动相带入流路。
4.4 色谱数据的收集和处理。
4.4.1 注样同时启动数据处理机，开始采集和处理色谱信息，如采用记录仪，则注样同时按一下记号键，作起始记号。
4.4.2 最后一峰出完后，应继续走一段基线，确认再无组分流出，方能结束记录。
4.4.3 根据第一张预试的色谱图，适当调整各有关参数，使色谱峰信号在色谱图上有一定强度。
4.4.4 含量测定的对照溶液和样品供试液每份至少注样2次，由全部注样结果（n ≥4）求得平均值，相对标准偏差（RSD）应不大于1.5%。
4.4.5 色谱系统适用性试验应符合中国药典的要求，如按指定峰计算的理论板数（n）和拖尾因子（T），分离度（R）以及重复性。
计算公式为：n=5.54(tR/Wh/2)2其中：tR为保留时间，Wh/2为半高峰宽，取相同单位。
T=W0.05/(2d1)其中：W0.05为离基线5%峰高处的峰宽，d1为峰上升边高5%峰高处的距离。
R=2（tR2-tR1）/(W1+W2)=1.18(tR2-tR1)/(W1h/2+W2h/2)其中：tR1和tR2分别为相邻前后二峰的保留时间，W1和W2则分别为其峰的底宽，T和W取相同单位。
W1h/2、W2h/2为峰1、2的半高峰宽。
4.4.6重复性，取各品种项下对照溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测定值的相对标准偏差应不大于2.0%。
也可按各品种校正因子项下，配制相当于80%、100%、120%的对照品溶液，加入规定量的内标准溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0%。
4.5 测定结果处理：4.5.1 峰面积归一法，按药品标准有关项下进行峰面积归一法求组分含量的按下式计算：百分含量[C%]=[∑Ai/∑A]×100% 其中：∑Ai为被测含量组分峰面积，∑A为参与计算的全部峰面积之和。
4.5.2 内标法：用含对照品和内标物质的对照溶液所得色谱峰响应值，按下式算出校正因子（f）：f=(As/ms)/(Ar/mr)其中：As和Ar分别为内标物质和对照品的峰面积或峰高，ms和mr分别为加入内标物质和对照品的量。
再根据含内标物质的供试品溶液色谱峰响应值，计算含量（mi）:mi=f×Ai/(As/ms)其中：Ai和As分别为供试品和内标物质的峰面积或峰高，ms为加入内标物质的量，必要时，再根据稀释倍数，取样量和标示量折算成为标示量的百分含量，或根据稀释倍数和取样量折算成百分含量。
4.5.3 外标法：用含对照品的对照溶液所得色谱峰响应值，按下式计算比值（r）：r=Cr/Ar其中：Cr和Ar分别为对照品的浓度和相应的峰面积和峰高。
再根据供试品溶液的色谱峰响应值，计算供试品中被测成分的浓度（Ci）:Ci=r×Ai其中：Ai为供试品滤液中被测成分的峰面积或峰高。
必要时，再根据稀释倍数和取样量折算成标示量的百分含量，或根据稀释倍数，取样量和标示量折算成百分含量。
5 清洗和关机5.1 分析完毕后，先关检测器和数据处理机，再用适当经滤过和脱气的溶剂清洗色谱系统，正相柱一般用正已烷，反相柱如使用过分含盐流动相，则先用水洗，然后用甲醇-水冲洗，冲洗前先按4.1.1-4.1.2操作，再用分析流速冲洗，各种洗溶剂—般冲洗15-30分钟，特殊情况应延长冲洗时间。
5.2 冲洗完毕后，逐步降低流速至0，关泵，进样器也应用相应溶剂冲洗，可使用进样阀所附专用冲洗接头。
5.3 关断电源，作好使用登记，内容包括日期、检品、色谱柱、流动相、柱压、使用小时数、仪器完好状态等。
6 注意事项：6.1 色谱柱与进样器及其出口端与检测器之间应无渗漏连接，以免试样扩散影响分离。
6.2 新柱或被污染柱用适当溶剂冲洗时，应将其出口端与检测器脱开，避免污染。
6.3 使用的流动相应与仪器原保存溶剂能互溶，如不互溶，则先取下上次的色谱柱，照4.1.1-4.1.2的方法用异丙醇冲洗过渡，过渡完毕后，接上相应的色谱柱，换上本次使用的流动相，再按4.1.1顺序操作。
6.4 压力表无压力显示或压力波动时不能进行分析，应检查泵中气泡是否已排除，各连接处有无漏液，排除故障后方能进行操作。
如压力升高，甚至自动停泵，应检查柱端有无污染堵塞，可小心卸开柱的进口端螺帽，挖出被污染填冲剂后，补入同类填充剂，仔细安装好，再进行操作。
6.5 发现记录基线波动，出现毛刺等现象，首先应检查检测器流通池中是否有气泡或污染，如不是流通池引起，可等待氘灯稳定，同时检查仪器的接地是否良好，必要时换上新的氘灯。
仪器稳定后方能进行操作。
6.6 进样前，色谱柱应用流动相充分冲洗平衡，如系统适用性并不符合规定，或填充剂已损坏，则应更换新的同类色谱柱进行分析，由于同类填充剂的化学键合相的键合度及性能等存在一定差异，往往依法操作达不到预定的分离时，可更换另一牌号的同类色谱柱进行试验。
6.7 以硅胶作载体的化学键合相填充剂的稳定性受流动相pH值的影响，使用时，应详细参阅说明书，在规定的pH值范围内选用流动相，一般pH范围为（2.5～7.5）。
使用高pH值流动相时，可在泵与进样器之间连接-硅胶短柱，以饱和流动相保护分析柱，并尽可能缩短在高pH值下的使用时间，用后立即冲洗。
6.8 各色谱柱的使用应登记，以方便选择和更新。
6.9 色谱流路系统，从泵、进样器、色谱柱到检测器流通池，在分析完毕后，均应按5.1充分冲洗，特别是用过含盐流动相的，更注意先用水，再用甲醇一水，充分冲洗。
如发现泵漏液等较严重的情况，应请有经验的维修人员进行检查、维修。