水中微生物检测
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酶底物法( Enzyme Substrate Test, EST)
检测方法
➢ 多管发酵法（MTF）–共需3-5天时间
以100mL水样中大肠菌最可能数(most probable number, MPN)表示
培养基制备>试管培养（22－26小时）
阴性结果（无产酸，产气）
产酸，产气
平板培养18－24小时
水中微生物检测的全球领导者
水中微生物检测（新国标方法）
• 总大肠菌群/大肠埃希氏菌，耐热大肠菌群
固定底物技术酶底物法介绍
总大肠菌群 / 大肠埃希氏菌 及耐热(粪)大肠菌群
固定底物技术酶底物 法
微生物检测的重要性
地震等自然灾害过后水体中会被大量微生物所 污染，特别是粪便污染，如水体中含有肠道病 原菌株，并被人饮用则会爆发严重疾病如泌尿 系感染、菌血症和脑膜炎，少数肠道病原菌株 可引起急性腹泻。
通常人们用投放含氯消毒剂进行消毒，但消毒 效果如何还需要通过检测水体中是否含有总大 肠菌群和大肠埃希氏菌来判断。
指示菌的方法学定义
总大肠菌群（Total Coliforms) 大肠菌群系指一群在37℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无
芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，具有指标菌的一般特征故以此作为粪便污染指标评价 饮水的卫生质量。 耐热大肠菌群(Thermotolerant Coliforms) ，原名：粪大肠菌群（Fecal Coliforms )
背景知识
大肠菌群，耐热大肠菌群，大肠埃希氏菌
大肠埃希氏菌
耐热大肠菌群 大肠菌群
目前的粪大肠菌群检测方法是实际上是检测耐热大肠菌群而不是大肠埃 希氏菌。
有关文献报道的试验结果表明, 有15%的阳性耐热粪大肠菌群实际上属 于总大肠菌群而不是大肠埃希氏菌。这种情况的发生多数是由于耐热的
克雷伯氏菌普遍存在于自然环境中，而非来源于人畜粪便，因此与人类 疾病的产生也没有绝对的关联。
同时，（用上述方法检测）会有10%的假阴性结果，是因为大肠埃希 氏菌属有10％不会产气（注1）。
注1：目前的粪大肠菌群检测方法，产酸产气是预试验的阳性判断指标。
我国水质微生物指标(细菌)
标准
指标菌
检测量
GB5749-2006,生活饮用水标准
CJ/T206—2005 城市供水水质标准
GB3838-2002,地表水环境质量标
酶底物法大肠埃希氏菌 阳性反应原理
4-甲基-伞形葡萄糖苷酸
《生活饮用水标准检验方法》对酶底物法定义
1, 方法
本标准方法采用固定底物技术酶底物法 Defined Substrate Technology, DST
2，培养基：
采用Minimal Medium ONPG-MUG，简称 MMO-MUG培养基
•报告者：英国泰晤士水务 •样品来源：泰晤士河，样品数450个
* Jacobs et al, AEM,1986. ** Fricker et al, Water Res., 1997
3, 优点
• 假阳性,假阴性底 • 操作简单,快速 • 定性,定量（51孔/97孔定量盘法） • 50多个国家和组织认证
世界卫生组织WHO,美国EPA,水与废水标准检验法…….
科立得 应用
➢ 饮用水 ➢ 源水 ➢ 瓶装水 ➢ 再生水
➢ 废水 ➢ 食品水 ➢ 畜牧用水
➢ 医疗用水
收录于“标准测试法”内 – APHA(美国公共卫生协会), US EPA,
菌落总数, 总大肠菌群, 大肠埃希氏或菌耐热大肠 菌 细菌总数, 总大肠菌群、耐热大肠菌
粪(耐热)大肠菌群
➢菌落总数:1ml; ➢大肠菌100ml
➢细菌总数1ml, ➢总大肠菌群/耐 热大肠菌群 :100ml
➢1L
准
GB/T 14848-93地下水质量标准 GB 9667-1996,游泳场所卫生标 准
革兰氏染色，镜检
观察菌落形态，挑取特征菌落
证实试验（培养24±2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在 ）
检测方法
➢ 滤膜法（membrane filtration,MF ) —共需2-3天时间
➢ 用孔径为0.45μｍ的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基 上，经培养后，计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数 ,计数单位为菌落形成单位
细菌总数、 总大肠菌群
➢细菌总数 1ml; ➢总大肠菌群1L
检测方法
➢ 多管发酵法（Multiple Tube Fermentation, MTF) ➢ 滤膜法（Membrane Filtration, MF ) ➢ 固定底物技术酶底物法(Defined Substrate Technology, DST)
用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5℃仍能 生长的大肠菌群，称为粪大肠菌群。是水体受人畜粪便污染的比较直接指标。 大肠埃希氏菌（大肠杆菌，E.Coli.)
大肠埃希氏菌是指能产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解ONPG（Orthonitrophenyl-β-D-galactopyranoside）使培养液呈黄色，能产生β-葡萄糖醛酸酶（βglucuronidase）分解MUG（4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide）使培养液在波长 366nm紫外光下产生荧光的细菌。大肠埃希氏菌是粪大肠菌群的组成部分，是水体受人畜粪便 污染的最直接指标，水中含有大肠埃希氏菌提示有粪便污染。
CFU(colony forming unit)
储备培养基的制备>过滤（需器械灭菌等）>培养（22-24H）
阴性结果(无典型菌落）
革兰氏染色 镜检
观察菌落形态,挑取特征菌落
证实试验（培养24±2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在）
β-半乳糖苷酶
酶底物法总大肠菌群 阳性反应原理
β-半乳糖醛苷
β-葡萄糖醛酸酶
AOAC, US NCIMS,Biblioteka BaiduUK DWI , IBWA ,WHO……
假阳性比较： vs 滤膜法
60%
50%
40% 30% 20% 10% 0%
US EPA 1989
Colilert MF
MF Colilert Lewis & Fricker et al Mak 1989 1995
假阳性比较：vs 滤膜法
检测方法
➢ 多管发酵法（MTF）–共需3-5天时间
以100mL水样中大肠菌最可能数(most probable number, MPN)表示
培养基制备>试管培养（22－26小时）
阴性结果（无产酸，产气）
产酸，产气
平板培养18－24小时
水中微生物检测的全球领导者
水中微生物检测（新国标方法）
• 总大肠菌群/大肠埃希氏菌，耐热大肠菌群
固定底物技术酶底物法介绍
总大肠菌群 / 大肠埃希氏菌 及耐热(粪)大肠菌群
固定底物技术酶底物 法
微生物检测的重要性
地震等自然灾害过后水体中会被大量微生物所 污染，特别是粪便污染，如水体中含有肠道病 原菌株，并被人饮用则会爆发严重疾病如泌尿 系感染、菌血症和脑膜炎，少数肠道病原菌株 可引起急性腹泻。
通常人们用投放含氯消毒剂进行消毒，但消毒 效果如何还需要通过检测水体中是否含有总大 肠菌群和大肠埃希氏菌来判断。
指示菌的方法学定义
总大肠菌群（Total Coliforms) 大肠菌群系指一群在37℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无
芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，具有指标菌的一般特征故以此作为粪便污染指标评价 饮水的卫生质量。 耐热大肠菌群(Thermotolerant Coliforms) ，原名：粪大肠菌群（Fecal Coliforms )
背景知识
大肠菌群，耐热大肠菌群，大肠埃希氏菌
大肠埃希氏菌
耐热大肠菌群 大肠菌群
目前的粪大肠菌群检测方法是实际上是检测耐热大肠菌群而不是大肠埃 希氏菌。
有关文献报道的试验结果表明, 有15%的阳性耐热粪大肠菌群实际上属 于总大肠菌群而不是大肠埃希氏菌。这种情况的发生多数是由于耐热的
克雷伯氏菌普遍存在于自然环境中，而非来源于人畜粪便，因此与人类 疾病的产生也没有绝对的关联。
同时，（用上述方法检测）会有10%的假阴性结果，是因为大肠埃希 氏菌属有10％不会产气（注1）。
注1：目前的粪大肠菌群检测方法，产酸产气是预试验的阳性判断指标。
我国水质微生物指标(细菌)
标准
指标菌
检测量
GB5749-2006,生活饮用水标准
CJ/T206—2005 城市供水水质标准
GB3838-2002,地表水环境质量标
酶底物法大肠埃希氏菌 阳性反应原理
4-甲基-伞形葡萄糖苷酸
《生活饮用水标准检验方法》对酶底物法定义
1, 方法
本标准方法采用固定底物技术酶底物法 Defined Substrate Technology, DST
2，培养基：
采用Minimal Medium ONPG-MUG，简称 MMO-MUG培养基
•报告者：英国泰晤士水务 •样品来源：泰晤士河，样品数450个
* Jacobs et al, AEM,1986. ** Fricker et al, Water Res., 1997
3, 优点
• 假阳性,假阴性底 • 操作简单,快速 • 定性,定量（51孔/97孔定量盘法） • 50多个国家和组织认证
世界卫生组织WHO,美国EPA,水与废水标准检验法…….
科立得 应用
➢ 饮用水 ➢ 源水 ➢ 瓶装水 ➢ 再生水
➢ 废水 ➢ 食品水 ➢ 畜牧用水
➢ 医疗用水
收录于“标准测试法”内 – APHA(美国公共卫生协会), US EPA,
菌落总数, 总大肠菌群, 大肠埃希氏或菌耐热大肠 菌 细菌总数, 总大肠菌群、耐热大肠菌
粪(耐热)大肠菌群
➢菌落总数:1ml; ➢大肠菌100ml
➢细菌总数1ml, ➢总大肠菌群/耐 热大肠菌群 :100ml
➢1L
准
GB/T 14848-93地下水质量标准 GB 9667-1996,游泳场所卫生标 准
革兰氏染色，镜检
观察菌落形态，挑取特征菌落
证实试验（培养24±2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在 ）
检测方法
➢ 滤膜法（membrane filtration,MF ) —共需2-3天时间
➢ 用孔径为0.45μｍ的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基 上，经培养后，计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数 ,计数单位为菌落形成单位
细菌总数、 总大肠菌群
➢细菌总数 1ml; ➢总大肠菌群1L
检测方法
➢ 多管发酵法（Multiple Tube Fermentation, MTF) ➢ 滤膜法（Membrane Filtration, MF ) ➢ 固定底物技术酶底物法(Defined Substrate Technology, DST)
用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5℃仍能 生长的大肠菌群，称为粪大肠菌群。是水体受人畜粪便污染的比较直接指标。 大肠埃希氏菌（大肠杆菌，E.Coli.)
大肠埃希氏菌是指能产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解ONPG（Orthonitrophenyl-β-D-galactopyranoside）使培养液呈黄色，能产生β-葡萄糖醛酸酶（βglucuronidase）分解MUG（4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide）使培养液在波长 366nm紫外光下产生荧光的细菌。大肠埃希氏菌是粪大肠菌群的组成部分，是水体受人畜粪便 污染的最直接指标，水中含有大肠埃希氏菌提示有粪便污染。
CFU(colony forming unit)
储备培养基的制备>过滤（需器械灭菌等）>培养（22-24H）
阴性结果(无典型菌落）
革兰氏染色 镜检
观察菌落形态,挑取特征菌落
证实试验（培养24±2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在）
β-半乳糖苷酶
酶底物法总大肠菌群 阳性反应原理
β-半乳糖醛苷
β-葡萄糖醛酸酶
AOAC, US NCIMS,Biblioteka BaiduUK DWI , IBWA ,WHO……
假阳性比较： vs 滤膜法
60%
50%
40% 30% 20% 10% 0%
US EPA 1989
Colilert MF
MF Colilert Lewis & Fricker et al Mak 1989 1995
假阳性比较：vs 滤膜法