水中微生物的检测

综合实验二：水中细菌总数和大肠菌群的测定

一、实验目的

1学习并掌握水样采集的方法、规则及注意事项；

2了解检查水中细菌总数和总大肠菌群的测定方法及检测意义；

3学习对所检测的水样作综合分析。

二、实验原理

1.水体的微生物污染问题日趋严重：

在各种水体，特别是污染水体中存在有大量有机物质，适于各种微生物的生长；

水中的微生物污染来源：土壤，以及人类、动物的排泄物污染；

水体中少数致病微生物（主要来自人或动物的粪便污染）可导致某些肠道传染病传播。

2.水微生物检测可用于评价水质情况，预报水质的污染趋势，以保证水质的卫生安全。

在实际工作中，对水质卫生质量的评价和控制，是无法对水体中各种可能存在的致病性微生物一一进行检测。一般选择有代表性的一种或一类微生物作为指示菌，通过对指示菌的检测，来了解水体是否受到过的微生物污染，是否有肠道病原微生物存在的可能。

3.水微生物的监测指标：

⑴菌落总数

①是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。

②检测意义：作为一般性污染的指标，即评价被检样品的微生物污染程度和安全性。水样菌落总数越多，说明水被微生物污染程度越严重，病原微生物存在的可能性越大，但不能说明污染的来源。

⑵总大肠菌群

①是指一群需氧及兼性厌氧的，37℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

②检测意义：作为粪便污染的指标。水样总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染的程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在的可能。

4.多管发酵法测定总大肠杆菌群

⑴初发酵试验：采用乳糖蛋白胨培养液37℃培养24h，观察产酸产气情况，产酸产气说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。但是，有个别其他类型细菌在此条件下可能产气，而不属于大肠菌群；产酸不产气的发酵管，也不一定是非大肠菌群，因其量少，可能延迟48 h后产气，这两种视为可疑结果，需进行下面的实验，才能确定是否是大肠菌群。

⑵平板分离：对阳性管培养物及假阳性管培养物，接种于伊红美蓝培养基，观察菌落特征，将符合大肠菌群菌落特征的菌落并进行革兰氏染色和镜检，只有染色为革兰式阴性、无芽孢杆菌的菌落才是大肠菌群菌落。

⑶复发酵证实试验：将以上两次实验已证实为大肠菌群阳性的菌群，接种于乳糖蛋白胨培养液，进行复发酵证实试验，经24 h培养产酸又产气的，最终确定为大肠菌群阳性结果。

最后，根据确定有大肠菌群存在的初发酵管（瓶数目），查阅专用统计表，得出总大肠菌指数。

三、实验用品

1.溶液及试剂：

蛋白胨、Nacl、20%乳糖、2%伊红水溶液、0.5%美兰水溶液、牛肉膏、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液、草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、番红复染液、蒸馏水、NaOH溶液、HCl溶液等

2.仪器和其他用品：

试管、德汉式小管、三角瓶、注射器、搪瓷缸、培养皿、载玻片、电磁炉、玻璃棒、移液管、酒精灯、接种环、试管架、恒温培养箱、灭菌锅、显微镜等

四、实验内容及步骤

1.培养基配制

一倍乳糖蛋白胨培养液三倍乳糖蛋白胨培养液

蛋白胨2g 6g

牛肉膏0.6g 1.8g

乳糖 1 g 3g

NACL 1g 3g

1.6%溴甲酚紫乙醇溶液0.2ml 0.6ml

蒸馏水200ml 200ml

⑴将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及NaCl加热溶解于蒸馏水中，调PH至7.2~7.4，加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，分装于试管和三角瓶中（初发酵试管10支各5ml,初发酵三角瓶2个各50ml;复发酵试管12支各5ml），并加入德汉式小管。115℃灭菌20min.

伊红美兰培养基

蛋白胨2g

NACL 1g

蒸馏水200ml

20%乳糖4ml

2%伊红水溶液4ml

0.5%美兰水溶液2ml

⑵将蛋白胨、NACL加入蒸馏水加热溶化，再加入乳糖、伊红水溶液、美兰水溶液。摇匀后，115℃灭菌20min。灭菌后稍加冷却，无菌操作倒平板12个，每个培养皿约15ml。

2.自来水采样

先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5 min（经常用水的水龙头放水1～3min）后，采集水样于无菌锥形瓶，约占瓶容量80%，以便摇匀水样。

3.初发酵试验

在2个含50ml3倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入100ml水样。在10支含有5ml 3倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，做好标记，各加入10ml水样，混匀后，37℃培养24h，24h 未产气的继续培养至48h。

4.平板分离

将24h培养后产酸产气和48h培养后产酸产气的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃下培养18-24h，将符合下列特征菌落：深紫黑色，有金属光泽；紫黑色，不带或略带金属光泽；淡紫红色，中心颜色较深，其中的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。

5.复发酵试验

经涂片、染色、镜检，如果是革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一发酵管的同类型菌落1-3个，37℃培养24h，实验结果若产酸又产气，即证实有大肠杆菌群存在。证实有大肠杆菌群存在后，再根据初发酵实验的阳性管数查表，即得总大肠杆菌群。

五、注意事项

1.当接种量超过一毫升时，一般采用多倍浓度培养液。如配制3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液50ml，加入100ml水样后，总体积为150ml，培养液恢复到正常浓度。

2.做好标记。

3.注意无菌操作，避免杂菌污染，影响检测结果。

六、实验结果与分析

1.初发酵

（注：1-2为三角瓶，100ml水样；3-12为试管，10ml水样）