第九章 凝胶渗透色谱

凝胶色谱分析二〇一一年九月九日第九章凝胶色谱分析凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography, GPC），又称尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC），其以有机溶剂为流动相，流经分离介质多孔填料（如多孔硅胶或多孔树脂）而实现物质的分离。

GPC可用于小分子物质和化学性质相同而分子体积不同的高分子同系物等的分离和鉴定。

凝胶渗透色谱是测定高分子材料分子量及其分布的最常用、快速和有效的方法[1]。

凝胶渗透色谱（GPC）的创立历程如下[2,5]：1953年Wheaton和Bauman用多孔离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质，观察到分子尺寸排除现象；1959年Porath和Flodin用葡聚糖交联制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品；1964年J. C. Moore将高交联密度聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂用作柱填料，以连续式高灵敏度的示差折光仪，并以体积计量方式作图，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱。

近年来，光散射技术（如图9-1所示，一束光通过一间充满烟雾的房间，会产生光散射现象。

）广泛应用于高分子特征分析领域[3]。

将光散射技术和凝胶渗透色谱（GPC）分离技术相结合，可以测定大分子绝对分子量、分子旋转半径、第二维里系数，也可测定分子量分布、分子形状、分枝率和聚集态等。

目前，该技术在高分子分析领域已成为一种非常有效的工具，在美国，日本及欧洲广为使用，国内近年来亦引进了此项技术。

入射光散射光图9-1光散射现象9.1 基本原理9.1.1凝胶渗透色谱分离原理让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径包括粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。

如图9-2、图9-3所示，当待测聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子只能从粒子间的间隙通过，被排除在粒子的小孔之外，速率较快；较小的分子能够进入粒子中的小孔，通过的速率慢得多。

这样经过一定长度的色谱柱分离后，不同相对分子质量的物质就被区分开了，相对分子质量大的在前面流出（其淋洗时间短），相对分子质量小的在后面流出（淋洗时间长）。

从试样进柱到被淋洗出来，所接受到的淋出液总体积称为该试样的淋出体积。

当仪器和实验条件确定后，溶质的淋出体积与其分子量有关，分子量愈大，其淋出体积愈小[7]。

图9-2 不同尺寸分子通过凝胶原理图显然，凝胶色谱法的分离是严格地建立在分子尺寸基础之上的，通常不应该在固定相上发生对试样的吸着和吸附。

同时，也不应该在固定相和试样之间发生化学反应（当然，也有一些凝胶色谱填料，例如，表面磺化交联聚苯乙烯颗粒，主要是基于分子尺寸大小而进行分离的。

但其表面磺化层又与被测离子之间有轻微的离子交换作用）。

图9-3 凝胶渗透色谱分离不同分子尺寸试样示意图凝胶渗透色谱法的特点是样品的保留体积不会超过色谱柱中溶剂的总量，因而保留值的范围是可以推测的，这样可以每隔一定时间连续进样而不会造成色谱峰的重叠，提高了仪器的使用效率。

其缺点则是柱容量较小。

通常洗脱剂分子是非常小的，它们的谱峰一般是在色谱图中最后出现（此时为0t）。

显然，各被测物质均在0t 之前被洗脱，即它们的R t 均小于0t，这与液-液、液-固和离子交换色谱的情况正好相反。

9.1.2 色谱柱参数及其测定方法[6]（1） 柱参数。

将凝胶色谱柱填充剂的凝胶颗粒用洗脱剂溶胀，然后与洗脱剂一起填入柱中，此时，凝胶床层的总体积为t Vg i t V V V V ++=0 （9-1） 式（9.1）中，0V 为柱中凝胶颗粒外部溶剂体积；i V 为柱中凝胶颗粒内部吸入溶剂的体积；gV 为凝胶颗粒骨架的体积。

t V 、0V 、i V 和g V 均称柱参数。

在实验中，其数值均可以测定。

被测物质的洗脱体积i 0e KV V V += （9-2） 式（9.2）中，K 为固定相和流动相之间的被测溶质的分配系数 ie ip V V V V V K 0—==（9-3） 式（9.3）中，p V 为凝胶颗粒内部溶质能进入部分的体积。

由上可见，凝胶色谱分离的过程中，没有受到任何其它吸附现象或化学反应的影响，它完全基于分子筛效应。

① 若K=0，待测分子不能进入凝胶颗粒内部；② 若0<K<1，待测分子可以部分地进入凝胶颗粒内部； ③ 若K=1，待测分子完全浸透凝胶颗粒内部； ④ 若K>1，表面存在吸附作用等其它影响存在。

若将i V 用凝胶相的总体积x V 代替，且g i x V V V += （9-4） 则有)V -(V 000e t a x a V K V V K V +=+= （9-5） 0t 0e a V -V V -V K =（9-6）式（9.6）中，a K 、0V 和e V 都容易测定，所以在实际工作中，人们喜欢用a K 。

a K 与K 之间的关系为gi ia V V V KK += （9-7）（2） 柱参数的测定。

t V 为色谱柱的内体积。

a V 为完全不能浸入凝胶颗粒内部的溶质分子的洗脱体积。

例如，可以通过聚苯乙烯等高分子化合物来测定0V 和e V 。

例如，测定用氘标记丙酮和己烷（GPC ）的e V ，由公式i 0e KV V V += （9-8） 此时，K=1，所以0-V V V e i = （9-9） 即可求得i V 。

此外r g i S W V •= （9-10） 式中，g W 为干燥凝胶的质量，g ；r S 为凝胶内部单位质量保留溶剂的体积，mL/g 。

9.1.3 凝胶渗透色谱法校正原理用相对分子质量已知的单分散标准聚合物预先做一条淋洗体积（或淋洗时间）与相对分子质量对应关系的曲线，该线称为“校正曲线”。

然而聚合物中几乎找不到单分散的标准样，所以一使用窄分布的试样代替。

在相同的测试条件下，做一系列的GPC 标准谱图，分别对应不同相对分子质量样品的保留时间，以lgM 对t 作图，所得曲线即为“校正曲线”。

通过校正曲线，就可以从GPC 谱图上计算出各种所需相对分子质量与相对分子质量分布的信息。

聚合物中能够制得标准样的聚合物种类并不多，没有标准样的聚合物就得不到校正曲线，单独使用GPC 方法也得不到聚合物的相对分子质量和相对分子质量分布信息。

对于这种情况可以利用普适原理加以校正[7]。

9.1.4 普适校正原理由于GPC 对聚合物的分离是基于分子流体力学体积而实现的，即对于具有相同分子流体力学体积的聚合物，能在同一个保留时间流出，即它们的流体力学体积相同。

[8]依照聚合物链的等效流体力学球模型，Einstein 的黏度关系式为[]M NV /.52=η （9-11） 式中，[]η为特性黏数；M 为相对分子质量；V 为聚合物链等效球的流体力学体积；N 为阿伏伽德罗常数。

可以用[]M η来表征聚合物的流体力学体积。

两种柔性链的流体力学体积相同：[η]1M 1=[η]2M 2 （9-12）式中，脚标1和2分别代表两种聚合物，把Mark-Houwink 方程[η]=KM （9-13）21122111αα++=M k M k （9-14）两边取对数：lgk 1+(α1+1)lgM 1=lgk 2+(α2+1)lgM 2 （9-15）即如果已知标准样和被测高聚物的k 、α值，就可以由已知相对分子质量的标准样品M 1标定待测样品的相对分子质量M 2。

实验证明，该法对线性和无规则团形状的高分子的普适性较好，而对长支链的高分子或棒状刚性高分子的普适性还有待研究。

9.1.5 光散射理论[4,9]激光照射到样品时，会在各个方向产生散射光，于是我们可以在一个角度或多个角度收集散射光的强度。

1.光散射所透露的信息光散射强度与分子量和溶液的浓度成正比；散射光角度的变化与分子的尺寸大小相关。

1）当分子尺寸小于10nm 时，各角度散射强度相同；2）当分子尺寸在10与30nm 之间时，散射强度随角度增大呈现直线下降的趋势； 3）当分子尺寸大于30nm 时，散射强度随角度增大呈曲线下降的趋势。

2.基本理论通常，溶剂中分子光散射现象可用公式9-16表达：c A P M R c K w 2*2)(1+=θθ （9-16） 式中：常数 AN dc dn n K 402202*λ)/(π4= （9-17） n 0是溶剂的折光指数；c 是溶液浓度；N A 是阿伏伽德罗常数；λ0为入射光波长；d n /d c 表示溶液折射率与浓度变化的比值，它表明了聚合物在溶液中的比折光指数增量；R θ是超瑞利系数；M w 是重均分子量；A 2是第二维里系数，是溶质与溶剂相互作用的量度；P (θ)是光散射强度的函数。

•••++=2θsin λ3π161)(122022Gr P θ （9-18） 将P 代入式（1）展开得：c A r M R c K G w 22222θ*2]2θsin λ3π161[1+•••++= （9-19） 在上式中，R θ为测量值，K *c 、λ0、θ为已知值；M w 、A 2、r g 为未知值。

3.Zimm Plot如图9-4所示，为著名的Zimm 曲线。

当θ→ 0，c→ 0，简化为wM R c K 1)0(*= （9-20）图9-4 Zimm Plot可通过实验测定M w 值。

配制不同浓度梯度的溶液，在不同的角度测量其散射光强度，绘制Zimm Plot ，求得M w ，<r g 2>及A 2值。

但由于结果仅为单一平均值，因此较适用于成分单一，分布较窄的分子，对于分布较宽或有不同族群分布的样品，则较难看出全貌。

9.2 基本构成及其工作原理9.2.1 GPC 系统组成GPC 仪的组成：泵系统、（自动）进样系统、凝胶色谱柱、检测系统和数据采集与处理系统。

1.泵系统包括一个溶剂储存器、一套脱气装置和一个高压泵。

它的工作是使流动相（溶剂）以恒定的流速流入色谱柱。

泵的工作状况好坏直接影响着最终数据的准确性。

越是精密的仪器，要求泵的工作状态越稳定。

要求流量的误差应该低于0.01 mL/min 。

2.色谱柱色谱柱是GPC 仪分离的核心部件，在一根不锈钢空心细管中加入孔径不同的微粒作为填料。

每根色谱柱都存在一定的相对分子质量分离范围和渗透极限，因此色谱柱存在使用上限和下限。

色谱柱的使用上限是当聚合物最小的分子的尺寸比色谱柱中最大的凝胶的尺寸还大，这时高聚物无法进入凝胶颗粒孔径，全部从凝胶颗粒外部流过，达不到分离不同相对分子质量的高聚物的目的。

并且还会有堵塞凝胶孔的可能，影响色谱柱的分离效果，会降低其使用寿命。

色谱柱的使用下限是当聚合物中最大尺寸的分子链比凝胶孔的最小孔径还要小，这时也达不到分离不同相对分子质量的目的。

因此，在使用凝胶色谱仪测定相对分子质量时，必须首先选择一条与聚合物相对分子质量范围相配好的色谱柱。