凝胶渗透色谱法-GPC-和高效液相谱-HPLC资料讲解
GPC-1：凝胶渗透色谱操作手册
样品溶液的过滤使用 0.45μm 过滤头。在装有过滤头的注射器内倒入样品溶液， 缓慢推动注射器，将样品溶液通过过滤头滤到干净的小试管中。然后用干净的溶剂 清洗过滤头数次。
（3）装完样品后，扳动进样阀扳手从 Load 位→Inject 位→Load 位→Inject 位，共三 下，动作要利落，否则会带来保留时间的误差。此时，窗口底栏显示 Single inject-running。
6． 到 设 定 的 运 行 时 间 后 ， 仪 器 自 动 停 止 数 据 采 集 ， 窗 口 底 栏 显 示 Single inject-complete。
凝胶渗透仪操作手册
6． 开计算机 打开计算机，双击Millennium32快捷键，出现Login Window； 点Login，输入Password：manager，OK； 从 Project 框中，选择自己课题组的 Project。
五． 测试样品
1． 在Millennium32主窗口，双击Run Samples，选择R-2410-T（THF系统）或L-2410（DMF 系统）或UV（紫外检测器），进入QuickSet窗口。
−−
∑∑ ∑∑ ∑ Mn =
wi = ni
niMi = ni
NiMiBiblioteka n---摩尔数 w---重量 N---摩尔分数 M---分子量
2． 重均分子量Mw 在一个高聚物体系中，各种大小分子的重量分数与其相应的分子量相乘，所得的各个 乘积的总和，定义为重均分子量。它是按重量统计平均的。
GPC详细资料介绍
GPC详细资料介绍1、一般地，传统的单一检测器的GPC，例如：由液相色谱仪改造而来的GPC，只需要进样量20ul（微升）或稍多，而且对浓度没有很精确的要求，一般只有一个浓度范围。
这个范围对应于柱子的分离能力和检测器的量程。
而浓度的具体大小，则也与分子量有关系！当分子量越大时，浓度应该减小；反之，浓度应该增大。
但是浓度太大，则会出现堵柱子，而且也会使检测器出现平头峰；浓度太小则会出现检测器检测不到信号的情况。
一般都在几毫克/毫升的浓度比较合适。
对于先进的多检测器GPC，则进样量要大很多了，至少也要50ul，甚至100、200ul也不稀奇。
这样算下来，样品量就不少了。
之所以说可能需要很多样品，是因为与具体方法有关。
如果样品本身是没有经典的GPC方法，需要摸索、建立一个新方法的话，那么样品需要量确实会大一些，特别是对一些新合成的样品，你很难确定他用什么溶剂溶解样品更合适，这时候就需要你去尝试，或者去查文献。
此时样品消耗是很大的！例如，我在仪器信息网上介绍过的聚乳酸样品的情况就是如此：当样品高度支化甚至成为星形支化时，传统的THF溶剂已经不能用了，需要换溶剂！而做出这一判断也是非常难的！在这一过程中，样品的消耗是非常大的，虽然浓度很低。
但是由于进样频繁，所以配制的样品溶液，会较快消耗。
此外，样品量过少，也会带来样品典型性差的问题。
所以，在工业生产企业的质量检验中，往往需要较大的样品量来配制成较多的样品溶液以避免典型性不足的问题，尽管实际进样量很小。
样品量少，往往是由于聚合规模小，实验室的小型合成，或者样品是昂贵、难得的生化类样品，如：蛋白质、多糖等。
解决这类问题，可以选择微量GPC，但是价格非常昂贵。
一般地，聚合物都不存在这类问题，无非是多聚合些样品出来，样品本身不是很值钱。
而对于生化类样品，一般GPC就没办法了，要么多弄些样品，要么买微量GPC。
但是一般也是选择前者，因为你还需要作重复性和重现性呢，并不是做一次进样就完了！最起码要进两针啊。
HPLC的常用术语解释
HPLC的常用术语解释高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography\HPLC)又称"高压液相色谱'、"高速液相色谱'、"高分别度液相色谱'、"近代柱色谱'等。
它是在生化和分析化学中常用的柱层析仪。
接下来我为大家整理了HPLC的常用术语解释，希望对你有关怀哦!第一部分色谱曲线1、色谱图(chromatogram)：色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或流淌相流出体积的曲线图，或者通过适当的〔方法〕观看到的纸色谱或薄层色谱斑点、谱带的分布图。
2、(色谱)峰(chromatographic peak)：色谱柱流出3、峰底(peak base)：峰的起点与终点之间的连接的直线4、峰高(h ，peak height)：色谱峰最大值点到峰底的距离(图1 中的BE)。
5、峰宽(W ，peak width)：在峰两侧拐点(图1 中的F ，G)处所作切线与峰底相交两点的距离6、半高峰宽(W h/2 ，peak withd at half height)：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离(图1 中的HJ)。
7、峰面积(A ，peak area)：峰与峰底之间的面积8、拖尾峰(tailing peak)：后沿较前沿平缓的不对称的峰。
9、前伸峰(leading peak)：前沿较后沿平缓的不对称的峰。
(又叫伸舌峰、前延峰)10、假峰(ghost peak)：除组分正常产生的色谱峰外，由于仪器条件的转变等缘由而在谱图上出现的色谱峰，即并非由试样所产生的峰。
这种色谱峰并不代表具体某一组分，简洁给定性、定量带来误差。
(又叫鬼峰)11、畸峰(distrorted peak)：样子不对称的色谱峰，前伸峰、拖尾峰都属于这类。
12、反峰(negative peak)：也称倒峰、负峰，即出峰的方向与通常的方向相反的色谱峰。
第九章凝胶渗透色谱讲解
凝胶色谱分析二〇一一年九月九日第九章凝胶色谱分析凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography, GPC），又称尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC），其以有机溶剂为流动相，流经分离介质多孔填料（如多孔硅胶或多孔树脂）而实现物质的分离。
GPC可用于小分子物质和化学性质相同而分子体积不同的高分子同系物等的分离和鉴定。
凝胶渗透色谱是测定高分子材料分子量及其分布的最常用、快速和有效的方法[1]。
凝胶渗透色谱（GPC）的创立历程如下[2,5]：1953年Wheaton和Bauman用多孔离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质，观察到分子尺寸排除现象；1959年Porath和Flodin用葡聚糖交联制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品；1964年J. C. Moore将高交联密度聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂用作柱填料，以连续式高灵敏度的示差折光仪，并以体积计量方式作图，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱。
近年来，光散射技术（如图9-1所示，一束光通过一间充满烟雾的房间，会产生光散射现象。
）广泛应用于高分子特征分析领域[3]。
将光散射技术和凝胶渗透色谱（GPC）分离技术相结合，可以测定大分子绝对分子量、分子旋转半径、第二维里系数，也可测定分子量分布、分子形状、分枝率和聚集态等。
目前，该技术在高分子分析领域已成为一种非常有效的工具，在美国，日本及欧洲广为使用，国内近年来亦引进了此项技术。
入射光散射光图9-1光散射现象9.1 基本原理9.1.1凝胶渗透色谱分离原理让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径包括粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。
如图9-2、图9-3所示，当待测聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子只能从粒子间的间隙通过，被排除在粒子的小孔之外，速率较快；较小的分子能够进入粒子中的小孔，通过的速率慢得多。
GPC讲稿
K1、K2、α 1、α 2在固定条件下是常数，已知两种高
聚物在该条件下的K1、K2、α 1、α 2值
由标准样品的logM-Ve标定线求出被测样品高聚物的 logM-Ve标定线
GPC分析方法
计算平均分子量
可处理任何形状的GPC谱图 选20个点
选20个点
选40个点
GPC分析方法
计算平均分子量
多数聚合物的GPC谱图是对称的，近 似于高斯分布
GPC图谱
高分子材料的GPC全分析谱图
GPC分析方法
GPC图谱
单 分 散 多 分 散
横坐标色谱保留值 纵坐标代表流出液的浓度
GPC分析方法
单分散标准曲线数据处理
选用一系列不样品同类型的丌同 分子量(已知)的单分散（ Mw/Mn< 1.1）标样，不被测样 品在相同条件下进行GPC分析， 每一个标样的Ve对应其lgM，即 可得到lgM Ve曲线，称为单分 散性标样校准曲线
GPC分析方法
进样浓度范围及体积
• 分子量范围 样品浓度
–低于5,000 <1.0% –5,000～25,000 <0.5% –25,000～200,000 <0.25%
–200,000～2,000,000 <0.1%
–高于2,000,000 <0.05%
• 进样体积：50-100uL
GPC分析方法
分布
• GPC可以同时测定聚合物的相对分子质量及其分
布，方法快速有效
GPC分离原理
• 立体排斥理论
– 固定相是多孔填料，小分子样品可进入孔径内部 – 样品不固定相之间无作用力 – 迁秱时间丌同
GPC分离原理
被分离的高聚物在溶液中以无规线团的形式存在，
现代材料分析测试技术 凝胶渗透色谱 GPC
• 含有固化剂的EPOXY
酚醛树脂在室温条件下的自然 固化现象观察
8 6 4
RI/mv
2 0 -2 -4 15
1d 2d 5d 11d 19d
20
25 t/min
30
35
补充内容：水相GPC的应用
• 用于溶解于水的聚合物 • 较有机相GPC要复杂得多
水相GPC中存在的问题
• 非体积排除效应
• 分子尺寸不能直接反映分子质量及其分布 的信息。
聚合物分子量的特点
1.分子量大 2.多分散性
3.分子量统计平均值+分布系数才能确切 描述聚合物分子量
GPC分离机理
二、GPC仪器的基本配置
• • • • • • 溶剂贮存器(Solvent) 泵(Pump) 进样系统(Autosample ) 色谱柱(column) 检测器(detector) 数据采集与处理系统(Data Acquirement and Process System) • 废液池 (Waste)
（1）分子质量变化不大
• 这是由于分子链发生了氧化现象，生成了 其它物质，如羟基被氧化为醛、酮或酯的 结构，这时聚合物整体的分子链长度没有 明显的改变，但聚合物的性质发生了变化， 这时可以通过红外的方法检测其分子链结 构组成的变化。
（2）分子质量降低
• 有些高聚物的老化是因为分子链的断裂， 这时分子量急剧下降，使产品性能发生显 著的变化。如纤维强度下降，变脆，达不 到使用要求。
仪器基本配置流程图
3 2.5 2
RI/mv
1.5 1 0.5 0 -0.5 0 5 10 15 20 25 30 35 t/min
泵(515 HPLC Pump)
• 要求精度很高
凝胶渗透色谱(GPC)
凝胶渗透色谱（GPC）1. 简介凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography，简称GPC）是一种常用的分离和分析高分子化合物的方法。
该技术基于样品中高分子与凝胶基质之间的相互作用特性进行分离，并通过检测其分子量进行定性和定量分析。
2. 原理GPC的原理基于高分子在溶剂中形成的动态螺旋结构。
在这个多孔的凝胶基质中，高分子可以通过不同的速度渗透进入孔隙中，较大分子量的高分子会更难进入孔隙，而较小分子量的高分子则相对容易进入。
因此，在GPC中，高分子化合物会根据其分子量的大小在凝胶柱中得到分离，从而实现对样品的分析。
3. 实验操作3.1 样品制备：将待分析的高分子化合物溶解在合适的溶剂中，得到样品溶液。
确保样品溶液中没有明显的悬浮物或杂质。
3.2 柱装填：将凝胶柱装入色谱柱座，并根据柱座的要求进行调整和固定。
3.3 校准：使用一系列已知分子量的标准品进行校准。
将标准品溶液以一定流速注入凝胶柱中，记录各标准品的保留时间。
3.4 样品进样：使用自动进样器或手动进样器将样品溶液以适当流速注入凝胶柱中。
3.5 分离：样品在凝胶柱中进行凝胶渗透分离，不同分子量的高分子以不同的速度通过凝胶基质，完成分离。
3.6 检测：通过不同的检测器检测凝胶柱中流出的样品，常用的检测器包括紫外-可见光谱检测器、折光率检测器等。
3.7 数据处理：根据标准品的保留时间和已知分子量，结合样品的保留时间，计算出样品的分子量。
4. 应用领域GPC广泛应用于高分子化合物的分析和研究领域。
主要应用包括但不限于以下几个方面：•分析聚合物的分子量分布：通过GPC可以获得聚合物样品的分子量分布情况，了解样品中分子量大小的范围和占比，有助于进一步研究和应用。
•聚合物纯度分析：GPC可以用于判断聚合物样品的纯度，通过检测样品中的低分子量杂质，评估样品的纯净度。
•聚合物杂质分析：GPC可以用于分析聚合物样品中的杂质物质，如副产物、残留单体等。
凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱目录一、基本原理 (2)1.1 凝胶的特性 (2)1.2 色谱的分离原理 (3)1.3 凝胶渗透色谱在分离技术中的应用 (5)二、仪器设备 (6)2.1 凝胶渗透色谱仪的主要组成部分 (7)2.2 主要性能指标及选择 (9)2.3 仪器设备的清洁与维护 (9)三、样品前处理 (11)3.1 样品的选择与制备 (11)3.2 样品浓缩与净化 (12)3.3 样品检测方法的建立 (13)四、实验操作流程 (14)4.1 样品进样 (16)4.2 柱塞泵的设置与调节 (17)4.3 检测器的选择与校准 (18)4.4 数据处理与结果分析 (19)五、理论基础与数学模型 (20)5.1 凝胶渗透色谱的理论基础 (22)5.2 数学模型在凝胶渗透色谱中的应用 (23)5.3 实验数据的解释与处理 (24)六、应用领域 (26)6.1 在化学领域中的应用 (28)6.2 在生物医学领域中的应用 (29)6.3 在环境科学领域中的应用 (30)七、常见问题与解决方案 (31)7.1 常见问题及原因分析 (32)7.2 预防措施与解决策略 (33)八、实验安全与防护 (34)8.1 实验室安全规程 (36)8.2 个人防护装备的使用 (37)8.3 应急处理措施 (38)九、最新研究进展 (39)9.1 新型凝胶材料的研究与应用 (40)9.2 色谱技术的创新与发展 (41)9.3 聚合物凝胶渗透色谱法的探索 (43)一、基本原理它的基本原理是利用具有不同孔径大小的多孔凝胶颗粒作为固定相，将待分离的混合物通过凝胶柱进行分离。
在色谱过程中，待分离的混合物会与凝胶颗粒发生相互作用，从而导致不同成分在凝胶颗粒之间的分配系数和扩散速率的差异。
根据这些差异，混合物中的各个成分可以通过不同的时间顺序依次通过凝胶柱，从而实现对混合物中各组分的高效分离。
GPC的关键参数包括：凝胶颗粒的大小和形状；溶液流速；压力；洗脱剂的选择和浓度。
凝胶渗透色谱法
凝胶渗透色谱法（GPC）一、凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱Gel Permeation Chromatography（GPC)，一种新型的液体色谱，原理是利用高分子溶液通过一个装填凝胶的柱子，在柱子中按分子大小进行分离。
柱子为玻璃柱或金属柱，内填装有交联度很高的球形凝胶。
其中的凝胶类型有很多，都是根据具体的要求而确定（常用的有聚苯乙烯凝胶）。
然而，无论哪一种填料，他们都有一个共同点，就是球形凝胶本身都有很多按一定分布的大小不同的孔洞（见图1）。
图1 GPC分离原理不仅可用于小分子物质的分离与鉴定，而且可作为用来分析化学性质相同但分子体积不同的高分子同系物。
可以快速、自动测定高聚物的平均分子量及分子量分布。
现阶段，已经成为最为重要的测定聚合物的分子量与分子量分布的方法。
二、测定原理凝胶色谱法的固定相采用凝胶状多孔性填充剂，是根据样品中各种分子流体力学提及的不同进行分离的。
比凝胶孔径大的分子完全不能进入孔内，随流动相沿凝胶颗粒间流出柱外，而娇小的分子则可或多或少地进入孔内。
因此大分子流程短，保留值小；小分子流程长，保留值大，所以凝胶色谱是按分子流体力学体积的大小，从大到小顺序进行分离的。
（见图2）图2 GPC淋出曲线溶质分子的体积越小，其淋出体积越大，这种解释不考虑溶质与载体间的吸附效应以及溶质在流动相和固定相中的分配效应，其淋出体积仅仅由溶质分子的尺寸和载体的孔径尺寸决定，分离完全是由于体积排除效应所致。
凝胶色谱的特点是样品的保留体积不会超出色谱柱中溶剂的总量，因为保留值的范围是可以推测的，这样可以每隔一定时间连续进样而不会造成谱峰的重叠，提高了仪器的使用率。
三、分子量校正曲线（LogM-V曲线）凝胶色谱图计算样品的分子量分布的关键是把凝胶色谱曲线中的淋洗体积V转化成分子量M，这种分子量的对数值与淋洗体积之间的曲线(LogM-V)称之为分子量校正曲线（见图3）。
图3 分子量校正(LogM-V)曲线➢排阻极限排阻极限是指不能进入凝胶颗粒空穴内部的最小分子的分子量。
凝胶渗透色谱仪(gpc)试验工作原理
凝胶渗透色谱仪(GPC)试验工作原理凝胶渗透色谱(GelPermeationChromatography)也称为体积排除色谱或尺寸排除色谱，是液相色谱的一个分支，是高聚物表征的重要方法之一，可用于小分子物质的分离和鉴定，测定高聚物分子量及其分子量分布情况等。
和高效液相色谱HPLC一样，主要配置有输液泵、进样器、色谱柱、浓度检测器和计算机数据处理系统。
固定相是表面和内部有着各种各样、大小不同的孔洞和通道的微球，可由交联度很高的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、葡萄糖和琼脂糖的凝胶以及多孔硅胶、多孔玻璃等来制备。
当被分析的聚合物试样随着溶剂引入柱子后，由于浓度的差别，所用溶质分子都力图向填料内部孔洞渗透。
较小的分子除了能进入较大的孔外，还能进入较小的孔；较大的分子就只能进入较大的孔；而比最大的孔还要大的分子就只能停留在填料颗粒之间的空隙中。
随着溶剂洗提过程的进行，经过多次渗透扩散平衡，最大的聚合物分子从载体的粒间首先流出，依次流出的是尺寸较小的分子，最小的分子最后被洗提出来，从而达到依高分子体积进行分离的目的。
最终得出高分子尺寸大小随保留时间(或保留体积V、淋出体积V)变化的曲线，即分子量分布的色谱图。
从聚合物的GPC曲线的形状（对称、不对称、单峰、双峰等）可以粗略地得知该聚合物样品的分子量分布情况，GPC峰的峰宽则可大致反映聚合物的多分散度。
通过计算处理，可以得到聚合物的数均分子量Mn、粘均分子量Mv、重均分子量Mw和z-均分子量Mz，进而得到聚合物的多分散系数d，由此可以获得关于聚合物的多种定性信息。
GPC凝胶渗透色谱常温流动相:水相、THF、DMF、DMSO、三氯甲烷、六氟异丙醇、a-氯奈；高温流动相：DMF（（80℃），三氯苯；可以测相对分子量的流动相：水相、THF、DMF、DMSO、三氯甲烷、六氟异丙醇、a-氯奈、三氯苯；可以测绝对分子量的流动相：水相、THF、DMF、三氯苯。
GPC凝胶渗透色谱测定是高分子相对分子质量及其分布最常用、快速和有效的技术。
高效凝胶渗透色谱法测定多糖纯度及分子量
高效凝胶渗透色谱法测定多糖纯度及分子量一、本文概述多糖作为一种重要的生物大分子，广泛存在于自然界中，具有多种生物活性，如免疫调节、抗病毒、抗肿瘤等。
因此，对多糖的纯度及分子量的准确测定对于其研究和应用具有重要意义。
高效凝胶渗透色谱法（High Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC）是一种常用的多糖纯度及分子量测定方法，具有操作简便、分辨率高、重现性好等优点。
本文旨在介绍HPGPC法测定多糖纯度及分子量的原理、实验步骤、数据处理及注意事项，以期为多糖的研究和应用提供参考。
二、实验材料与方法1 多糖样品：选择待测定的多糖样品，确保其来源清晰，无杂质污染。
2 高效凝胶渗透色谱（HPGPC）柱：选择适当型号的HPGPC柱，以适用于待测多糖样品的分子量范围。
3 流动相：通常选用适当的溶剂或缓冲液作为流动相，以保证多糖样品在色谱柱上的良好分离。
4 检测器：使用示差折光检测器（RI）或紫外检测器（UV）等，以监测多糖样品在色谱柱上的分离情况。
5 其他试剂与仪器：包括样品制备所需的试剂、色谱仪、注射器、进样针等。
1 样品制备：将多糖样品溶解在适当的溶剂中，制备成一定浓度的溶液，以便进行后续分析。
2 色谱条件优化：通过预实验，优化色谱条件，包括流动相的选择、流速、柱温等，以获得最佳的分离效果。
3 进样与分离：将制备好的多糖样品溶液通过注射器注入HPGPC 仪中，通过色谱柱进行分离。
在分离过程中，利用检测器监测多糖样品的分离情况。
4 数据收集与处理：收集分离过程中的数据，利用相应软件对数据进行处理和分析，包括分子量计算、纯度分析等。
5 结果评价：根据分析结果，评价多糖样品的纯度及分子量分布情况，为后续研究提供依据。
通过以上实验材料与方法，可以高效地进行多糖纯度及分子量的测定，为后续多糖的结构研究、质量控制等提供重要支持。
三、实验结果与讨论在本研究中，我们采用了高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）对多糖样品的纯度和分子量进行了测定。
第2节 凝胶色谱(GPC)
3.凝胶色谱分离机理
3.1凝胶色谱的色谱过程方程
凝胶色谱柱是用多孔材料填充的，其分离能力与 填料孔径无关。 GPC柱的总体积有3部分组成，即填料骨架体积、 填料孔体积及填料颗粒间体积。其中填料骨架体 积对分离不起作用，柱空间体积主要由后两部分 组成。因此当把色谱方程VR＝VM+KVS用于凝胶 色谱时，VM代表填料颗粒间体积，VS代表填料孔 体积，VR也称为淋洗体积。样品在分离过程中， 大分子的保留体积为VM，小分子的保留体积为 VM+VS。分配系数K在0到1之间。
2.1间接测定法
这是通过测定淋洗体积推测相应的分子量。 如用虹吸法或计滴法来测定淋洗体积。随 着凝胶色谱的不断发展，仪器流动相速度 的稳定性不断提高，也可以直接测定保留 时间作为分子量标记。 间接法测定分子量的优点是仪器设备简单， 但不能直接得出分子量的数值，需采用标 准进行校正，数据处理较为复杂。
2.3光散射法
用此法可以直接测出淋出液中聚合物的重均分子 量，是一种测定绝对分子量的方法。 该法所使用的仪器为小角激光光散检测器（low angle laser light scattering, LALLS），其工作原 理如下：当光通过高分子溶液时，会产生瑞利散 射，散射光强度及其对散射角θ（即入射光与散射 光测量方向的夹角）和溶液浓度C的依赖性与聚合 物的分子量、分子尺寸、分子形态有关，因此可 用光散射的方法研究高分子溶液的分子量等参数。
3.2.4 热力学理论
该理论认为，决定GPC分离的因素，不仅有胶体的孔径大 小，而且包括在一定溶剂中高聚物分子构像的尺寸分布。 Casassa研究了溶液中不同构像的分子链在同一胶体孔洞 大小上的分离他假设孔洞内外的溶质分子处于平衡，而且 两相是那样的稀,以致高聚物之间无作用。他用无规飞行 统计来描述分子的构像，即符合方程式： 2 式中，Pn（r）表示距坐标原点为矢量r的位置上，无规飞 行出现n次的几率密度；b2表示聚合物链段的平均平方长 度。上式在分散（dissipative）物理过程中是基本的，适 用于各种边界条件。
第九章凝胶渗透色谱讲解
第九章凝胶渗透⾊谱讲解凝胶⾊谱分析⼆〇⼀⼀年九⽉九⽇第九章凝胶⾊谱分析凝胶渗透⾊谱（Gel Permeation Chromatography, GPC），⼜称尺⼨排阻⾊谱（Size Exclusion Chromatography, SEC），其以有机溶剂为流动相，流经分离介质多孔填料（如多孔硅胶或多孔树脂）⽽实现物质的分离。
GPC可⽤于⼩分⼦物质和化学性质相同⽽分⼦体积不同的⾼分⼦同系物等的分离和鉴定。
凝胶渗透⾊谱是测定⾼分⼦材料分⼦量及其分布的最常⽤、快速和有效的⽅法[1]。
凝胶渗透⾊谱（GPC）的创⽴历程如下[2,5]：1953年Wheaton和Bauman⽤多孔离⼦交换树脂按分⼦量⼤⼩分离了苷、多元醇和其它⾮离⼦物质，观察到分⼦尺⼨排除现象；1959年Porath和Flodin⽤葡聚糖交联制成凝胶来分离⽔溶液中不同分⼦量的样品；1964年J. C. Moore将⾼交联密度聚苯⼄烯-⼆⼄烯基苯树脂⽤作柱填料，以连续式⾼灵敏度的⽰差折光仪，并以体积计量⽅式作图，制成了快速且⾃动化的⾼聚物分⼦量及分⼦量分布的测定仪，从⽽创⽴了液相⾊谱中的凝胶渗透⾊谱。
近年来，光散射技术（如图9-1所⽰，⼀束光通过⼀间充满烟雾的房间，会产⽣光散射现象。
）⼴泛应⽤于⾼分⼦特征分析领域[3]。
将光散射技术和凝胶渗透⾊谱（GPC）分离技术相结合，可以测定⼤分⼦绝对分⼦量、分⼦旋转半径、第⼆维⾥系数，也可测定分⼦量分布、分⼦形状、分枝率和聚集态等。
⽬前，该技术在⾼分⼦分析领域已成为⼀种⾮常有效的⼯具，在美国，⽇本及欧洲⼴为使⽤，国内近年来亦引进了此项技术。
⼊射光散射光图9-1光散射现象9.1 基本原理9.1.1凝胶渗透⾊谱分离原理让被测量的⾼聚物溶液通过⼀根内装不同孔径的⾊谱柱，柱中可供分⼦通⾏的路径包括粒⼦间的间隙（较⼤）和粒⼦内的通孔（较⼩）。
如图9-2、图9-3所⽰，当待测聚合物溶液流经⾊谱柱时，较⼤的分⼦只能从粒⼦间的间隙通过，被排除在粒⼦的⼩孔之外，速率较快；较⼩的分⼦能够进⼊粒⼦中的⼩孔，通过的速率慢得多。
高效液相色谱法（hplc）
高效液相色谱法(HPLC)一．概述色谱法是一种应用范围相当广泛的分离分析技术，它已有近百年的发展史。
二十世纪五、六十年代石油及石油化工的突起促使了GC技术大发展，而七、八十年代生命科学、生化、制药工业的发展推动了HPLC的迅速发展。
目前除分析化学外，生物化学，石油化学，有机化学，无机化学等学科都普遍采用色谱技术。
现代高效液相色谱仪，以其高效，快速和自动化等特点成为当代分析仪器中发展最快的仪器。
HPLC已成为操作方便、准确、快速并能解决困难分离问题的强有力的分析手段。
1．HPLC的特点（1）适用范围广已知有机物中仅20%不经预先化学处理，可用GC分析；而其余80%有机物可用HPLC分析。
HPLC适于分离生物、医学大分子和离子化合物，不稳定的天然产物，种类繁多的其它高分子及不稳定化合物。
（2）流动相及固定均与样品分子作用，而GC仅固定相与样品分子作用。
（3）具有独特性能的柱填料（固定相）种类较多，具有多种分离方式，适于各种化合物分析。
（4）分离温度较低，提高了分离效率。
（5）具有一些独特的检测器：电化学，示差折光，可见紫外吸收及荧光检测器等。
（6）样品易回收。
2．HPLC分类按分离机理分为四类：吸附色谱（液固）：通过试样组分对活性固体表面吸附亲合力的不同实现分离。
对具有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性，早期应用较多，现在大多可用正相键合相色谱替代，常用硅胶柱。
分配色谱：不同溶质分子按其在固定相和流动相中分配系数不同得到分离。
现代分配色谱即化学键合相色谱，是将各种不同的有机基团通过化学反应键合到硅胶表面，具有很好的化学稳定性和热稳定性。
大部分分离问题都可用键合相色谱解决。
离子交换色谱：以离子交换剂为固定相，试样中电离组分与交换剂基体相反电荷的离解部位亲合力不同而分离。
用于分离无机或有机离子。
固定相为阴（阳）离子交换树脂，流动相为电解质溶液。
分子排阻色谱：按物质分子量大小进行分离。
不仅对高聚物，对分子量差别较大的低聚物或小分子化合物也可进行分离。
凝胶渗透色谱法GPC
样品 填充物颗粒 尺寸大的高分子不能渗透到凝胶孔穴中而受到排斥，只能从凝胶粒间流过，最
先流出色谱柱，即其淋出体积最小；中等体积的高分子可以渗透到凝胶的一些 大孔中而不能进入小孔，比体积大的高分子流出色谱柱的时间稍后、淋出体积 大 中
稍大；体积比凝胶孔穴尺寸小得多的高分子能全部渗透到凝胶孔穴中，最后流
超速离心沉降平衡法
粘度法 凝胶渗透色谱法GPC 飞行时间质谱
1×104～1×106
1×104～1×107 1×103～1×107 1×104以下
Mw ，Mz
粘均 Mh 各种平均 Mn ，Mw
相对
相对 相对 绝对
凝胶渗透色谱法GPC
凝胶渗透色谱法: Gel permeation chromatography, GPC； 又称体积排阻色谱法：Size exclusion chromatography, SEC； 是一种根据尺寸分离高分子的色谱技术
1 1 1 K1 lg M 2 lg M1 lg 1 2 1 2 K2
出色谱柱、淋出体积最大。
孔穴
小
因此，聚合物的淋出体积与高分子的体积即分子量的大小有关，分子量越
大，淋出体积越小。分离后的高分子按分子量从大到小被连续的淋洗出色谱柱
并进入检测器。
GPC-传统校正曲线
传统校正曲线 a)浓度检测器 b)一个使用标准分子量样品校正过的GPC/SEC柱子 c)检测相对分子量和分子量分布
浓度检测器不断检测淋洗液中高分子的浓度。
常用的浓度检测器为示差折光仪，其浓度响 应是淋洗液的折光指数与纯溶剂（淋洗溶剂）
的折光指数之差，由于在稀溶液范围内，与
溶液浓度成正比，所以直接反映了淋洗液的 浓度即各级分的含量，下图是典型的GPC谱
凝胶渗透色谱PPT课件
1953年--Wheaton和Bauman-用多孔树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物 质，观察到分子尺寸排除现象。
1959年--Porath和Flodin— 用葡聚糖凝胶分离了水溶液中不同分子量的样品。
1962年--J.C.Moore— 将连续式高灵敏度的示差折光仪接在分离柱后，并以体积计 量方式作图，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量 分布的测定仪，创立了凝胶渗透色谱技术。 凝胶渗透色谱 GPC---Gel Permeation Chromatography 也称作体积排斥色谱 SEC---Size Exclusion Chromatography 以溶剂作流动相，流经多孔填料作为分离介质的液相色谱 法。
色谱柱
预热板
加热废液管儿 放空阀
废液 溶剂
溶剂输送系统
典型分离式GPC系统示意图
I Out n
在线脱气
为GPC加热的理由
降低流动相黏度，使得谱柱内部溶剂处于接近理 想的GPC状态（如Polyethylene – Terphthalate m-Cresol + 0.05 m LiBr/100 °C）
16
18
20
– [] ST = VI / RI – H = MST [] ST – Polynomial fit to Log H
22
24
26
28
for each standard for each standard universal calibration curve
“绝对”分子量分布的测定
Log [] = Log K + Log M K 及 可随 M 变化
GPC中的大分子结构形态
凝胶渗透色谱GPC
渗透压方法 (for Mn) 光散射方法 (for Mw) 粘度方法 (for Mv) 超速离心方法 (for Mz)
间接方法
GPC (for Mn, Mw and Mz) 用标准品进样得到分子量校正曲线，间接算出 聚合物样品的相对分子量。如和标准品结构不 同，还需进行相应的计算才能得到聚合物样品 自身的分子质量。
GPC色谱柱系列
Shim-pack GPC-80X for THF Shim-pack GPC-80XC for 氯仿 Shim-pack GPC-80XD for DMF
排阻极限 (聚苯乙烯)
1.5x103(GPC-801), 5x103(GPC-802), 2x104(GPC-8025), 7x104(GPC-803), 4x105(GPC-804), 4x106(GPC-805), 4x107(GPC-806)，4x107 (mixed gel，GPC80M), 2x108(GPC-807)
凝胶过滤色谱 (GFC)
主要用于生命科学领域 以水溶液为流动相 常用固定相填料：亲水性有机凝胶(葡聚糖，琼
脂糖，聚丙烯酰胺等)
3
GPC用途
高聚物的分子量及其分布是高聚物最基本 的参数之一。高聚物的许多性质是与分子 量有关的。例如冲击强度、模量、拉伸强 度、耐热、耐腐蚀性都与高聚物的分子量 和分子量分布有关。
10 228-20812-91 11 223-05671-92
保护柱 LC工作站
GPC-800P
1
LCsolution Single 1
12 223-05655-92
GPC软件
LCsolution GPC
1
1
GPC系统与常规HPLC系统区别
GPC 凝胶渗透色谱
GPC（Gel Permeation Chromatography ） ,凝胶渗透色谱，又称为尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography,简称SEC），它是基于体积排阻的分离机理，通过具有分子筛性质的固定相，用来分离相对分子质量较小的物质，并且还可以分析分子体积不同、具有相同化学性质的高分子同系物。
凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography、GPC)1964年，由J.C.Moore首先研究成功。
不仅可用于小分子物质的分离和鉴定，而且可以用来分析化学性质相同分子体积不同的高分子同系物。
(聚合物在分离柱上按分子流体力学体积大小被分离开）1.基本原理1.1分离原理让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径有粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。
当聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子被排除在粒子的小孔之外，只能从粒子间的间隙通过，速率较快；而较小的分子可以进入粒子中的小孔，通过的速率要慢得多。
经过一定长度的色谱柱，分子根据相对分子质量被分开，相对分子质量大的在前面（即淋洗时间短），相对分子质量小的在后面（即淋洗时间长）。
自试样进柱到被淋洗出来，所接受到的淋出液总体积称为该试样的淋出体积。
当仪器和实验条件确定后，溶质的淋出体积与其分子量有关，分子量愈大，其淋出体积愈小。
（1）体积排除（2）限性扩散（3）流动分离1.2校正原理用已知相对分子质量的单分散标准聚合物预先做一条淋洗体积或淋洗时间和相对分子质量对应关系曲线，该线称为“校正曲线”。
聚合物中几乎找不到单分散的标准样，一般用窄分布的试样代替。
在相同的测试条件下，做一系列的GPC标准谱图，对应不同相对分子质量样品的保留时间，以lgM对t作图，所得曲线即为“校正曲线”。
通过校正曲线，就能从GPC谱图上计算各种所需相对分子质量与相对分子质量分布的信息。
聚合物中能够制得标准样的聚合物种类并不多，没有标准样的聚合物就不可能有校正曲线，使用GPC方法也不可能得到聚合物的相对分子质量和相对分子质量分布。
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无机凝胶： 最常用改性多孔硅胶。 主要特点是适 用范围广（包 括极性和非极 性溶剂）、尺 寸稳定性好、 耐压、 易更换溶剂、流动阻力小，缺点是吸附现象比聚苯乙烯凝胶严重。
凝胶渗透色谱法 GPC 和高效液相色谱 HPLC
（二）仪器
1．色谱柱
各 种 平均
稀溶液粘度
> 10 2
数均
> 10 2
2
凝胶渗透色谱法 GPC 和高效液相色谱 HPLC
1. 凝胶渗透色谱（ GPC ）：测定高分子材料的分子量及其分布的最常用、 快速和有效的方法。
GPC 是柱液相色谱。
测定：（ 1 ）高聚物的分子量及分布； （ 2 ）高分子材料内小分子物质的测定、支化度等某些结构分析； （ 3 ）作为分离手段，进行级分的定性和定量检测。
2. 高效液相色谱（ HPLC ）：另一种柱液相色谱。是非极性固定相，以 极性溶液为流动相。
HPLC 在高分子领域中的应用：主要是测定高分子材料中的小分子物。
由于 GPC 和 HPLC 都是液固色谱，除了柱子不同外仪器的其他部分可 以 通 用 ； 两 者 机 理 不 同 ， 因 而结 果 有很 好 的互 补 性 。
(2) 溶剂 四氢呋喃在室温下能溶解许多高分子，是最常用的 GPC 溶剂。 三氯苯多用于高温下测定，操作温度 135 ℃，适用于聚乙烯、聚丙烯、
乙 丙 橡 胶 、 丁 苯 橡 胶 、 丁 腈 橡胶 等 。
凝胶渗透色谱法 GPC 和高效液相色谱 HPLC
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凝胶渗透色谱法 GPC 和高效液相色谱 HPLC
凝胶渗透色谱法 GPC 和高效液相色谱 HPLC
一、基本原理
GPC 以 体积排除 为主要原理。 GPC 的核心部件：色谱柱内装有多孔性填料（称为凝胶），凝胶的表面和 内 部 有 各 种 大 小 不 同 的 孔 洞 和通 道 。当 被 分析 的 样 品随 着 淋 洗 溶 剂 子 后 ， 溶 质 分 子 即 向 填 料 内 部孔 洞 扩散 。 较小 的 分 子除 了 能 进 入 大 还 能 进 人 较 小 的 孔 ； 较 大 的 分子 则 只能 进 人较 大 的 孔； 而 比 最 大 的 大的分子就只能留在填料颗 粒之间的空隙中。从渗透的 深度来说，较小的分子能渗 人孔洞更深的内部。
浓度检测器
分子量检测器
凝胶渗透色谱法 GPC 和高效液相色谱 HPLC
（二）仪器
1 ．色谱柱（ Water Styragel 为例，不锈钢，内径 8 mm ，长度 400 mm ） (1) 凝胶 GPC 凝胶可分为有机凝胶与无机凝胶两大类 。
有 机 凝 胶 ： 苯 乙 烯 — 二 乙 烯 苯 共 聚 得到 的 交 联聚 苯 乙烯 凝 胶 。 特点是孔径分 布宽，分离范 围大，适用于 非极性有机溶 剂。三个系列 柱的凝 胶 颗 粒分别 为 5 、 10 和 20um ，分 别 用 于测 定低、 中 和 超高 分 子 量 的
数均
沸点升高
＜ 3×10 4
数均
冰点降低
＜ 3×10 4
数均
气象渗透压
＜ 3×10 4
数均
膜平衡渗透压
5×10 5 -10 6
数均
电子显微镜
> 5×10 5
数均
光散射
> 10 2
重均
X 光小角散射 超离心沉降平衡
> 10 2 1×10 4 -1×10 5
重均 重均，平10 7
凝胶渗透色谱法 GPC 高效液相色谱 HPLC
测定高聚物分子量的方法 :
端基分析、沸点升高、冰点降低、气相渗透压。膜平衡渗透压、光散 射、 X 光小角散射、超速离心沉降、稀溶液粘度和凝胶渗透色谱等。
表 1-4 分子量的测定方法及其大致适用范围
测定方法
使用分子量范围
平均分子量
端基分析
＜ 3×10 4
凝胶渗透色谱法 GPC 和高效液相色谱 HPLC
（三）数据处理
如果 GPC 仪没有连接分子量检测器，则 GPC 谱图的横坐标不是 分子量，而是保留体积 Ve （或时间），纵坐标是浓度检测器讯号 H 。
凝胶渗透色谱法 GPC 和高效液相色谱 HPLC
（三）数据处理
1. 校准曲线 Ve 与分子量 M 之间有如下线性关系：
凝胶渗透色谱法 GPC 和高效液相色谱 HPLC
（二）仪器和实验技术
3. 分子量检测器
分子量检测器主要有激光小角光散射检测器和自动粘度检测器两种。 （ 1 ） 激 光 小 角 光 散 射 (LALLS ） 检 测 器 ， 通 过 测 定 散 射 光 强 来 计 是测定分子量的绝对方法。
特点：快速精确。激光准直性好而不必进行角度外推（可在 2 o 测定），光强 度大而不必进行浓度外推（可稀释至 10 -4 ～ 10 -6 g/ml ），样品池体积小（ 10 µl ）而简化了除尘操作，有可能与 GPC 联用。 （ 2 ）自动粘度检测器： 是利用毛细管两端压力降的测定来求得分子量，它 仍是测定分子量的相对方法。
（二）仪器和实验技术
2. 浓度检测器
示 差 折 光 和 紫 外 吸 收 检 测 器 是 最 常 用。 还 有 红 外 、 电 导 和 介 电 常 数 等 示差折光检测器（ RI ） ：利用溶液与溶剂之间折射率之差来测定浓度的。 优 点 是 ： 通 用 性 强 ， 只 要 溶 质 与 溶 剂 有 折 射 率 差 别 就 可 以 应 用。
紫外吸收检测器（ UV ）： 有较强的选择性，它要求溶剂不能有紫外吸收，比如四氢 呋喃必须完全除掉阻聚剂 2,6— 二叔丁基对甲酚后才能使用。测定时，波长常固定在 一个单一值（如 254 nm 或 280 nm ）。
有时利用双检测器，通过比较 RI 和 UV 的检测结果，可对组成鉴定提供帮助。
丁苯橡胶型粘合剂的紫外检测的 GPC 图上， 可明显观察到两个 RI 检测不明显的峰， 说明其中含有具有强紫外吸收基团的添加剂。
因此，随着溶剂的淋洗， 大小不同的分子就得到分离， 较大的分子先被淋洗出来， 较小的分子较后被淋洗出来。
分 离 的 基 础 主 要 根 据 溶 液 中 分子 体 积 （即流体力学体积）的大小。
凝胶渗透色谱法 GPC 和高效液相色谱 HPLC
（二）仪器
仪器组成：
输液系统 （柱塞泵）
进样器 色谱柱
凝胶、溶剂