高效液相色谱分析PPT
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应用范围 高沸点不易挥发，受热不稳定易分解，分
子量大，不同极性的有机物，生物活性物质及天然产物， 化工产品及环境污染物等等。
方法局限性：
使用多种溶剂，成本高，且易产生污染，梯度洗脱 比气相色谱的程序升温复杂 缺少通用的检测器
分析具有多种沸程的石油产品，不能替代气相色谱 法也不能代替中、低压液相色谱法，尤其对受压易分解 的生物活性样品
第十章 高效液相色谱分析
(high perfomance lquid chromatography) 第一节 概述 第二节 基本原理 第三节 固定相与流动相 第四节 高效液相色谱仪 第五节 定性、定量分析
1
2
3
4
5ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
第一节 高效液相色谱法概述
与经典液相色谱法比较 与气相色谱法比较 高效液相色谱的特点
经典液相(柱)色谱法
10 ~ 200 10 ~ 50 75 ~ 600 200 ~ 30 0.001 ~ 0.1
2 ~ 50 1 ~ 10 1 ~ 20
10
第一节 高效液相色谱法概述
2. HPLC与GC的比较 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的
稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC 可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类 物质占有机物总数的80%。
11g。
9
高效液相色谱法与经典液相(柱)色谱法的比较
项目
方法
色谱柱: 柱长/cm
柱内径/mm
固定相粒度: 粒径/ m
筛孔/目
色谱柱入口压力/MPa
色谱柱柱效/(理论塔板数/m)
进样量/g
分析时间/h
高效液相色谱法
10 ~ 25 2 ~ 10 5 ~ 50
2500 ~ 300 2 ~ 20
2103 ~ 5 104 10-6 ~ 10-2 0.05 ~ 1.0
11
第一节 高效液相色谱法概述
流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰
性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流 动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了 起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用 产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制 和改进分离。
6
第一节 高效液相色谱法概述
高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱 方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色 谱(液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透 色谱)。
早 期 液 相 色 谱 ， 包 括 Tswett 的 工 作 ， 都 是 在 直 径 1~5cm, 长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的 柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150~200m范围内。 即使这样，流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很 长！
吸附系数 (KA)
分配系数 (KP)
离子色谱
高效微粒离 子交换剂
不同 pH 值 的缓冲溶液
可逆性的 离子交换
选择性系 数 (KS)
体积排阻色谱
不同孔径的 多孔性凝胶
有机溶剂或一定 pH 值的缓冲溶液
多孔凝胶的 渗透或过滤
分布系数 (KD)
13
第一节 高效液相色谱法概述
高效液相色谱的应用范围和局限性
操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
12
第一节 高效液相色谱法概述
高效液相色谱的分类
按分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较
方法 项目 固定相 流动相
吸附色谱
全多孔固 体吸附剂
不同极性 有机溶剂
分配色谱
固定液+ 载体
不同极性有 机溶剂和水
分离原理 吸附 解吸 溶解 挥发
平衡常数
全多孔微粒型 无定型全多孔微粒
23
第三节 固定相和流动相
一、固定相
薄壳型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层多孔
活性材料(如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺 等)。表面多孔型固定相的颗粒大(易装柱)、多孔层厚度小且 孔浅(渗透性好，出峰快)；但交换容量小。适于常规分离分 析。
14
第二节 基本原理
一、柱内展宽 在色谱柱内各种因素引起的色谱峰扩
展叫柱内扩展。 由气相色谱速率理论可知，范氏方程
概括了影响柱效的各种动力学因素，将范 氏方程加以修正后即可用于高效液相色谱。
15
第二节 基本原理
一、柱内展宽
1. 涡流扩散
He 2dp
填充不规则因子 填充物颗粒的平均直径
16
第二节 基本原理
8
第一节 高效液相色谱法概述
1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较
高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，
只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。
高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，
因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。
高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV—10-9g, 荧光检测器—10-
一、柱内展宽
21
第二节 基本原理
二、柱外展宽 柱外展宽是指色谱柱外各种因素引起
的色谱峰展宽。
22
第三节 固定相和流动相
一、固定相
1. 液-固色谱固定相
液-固吸附色谱所用的固定相，多是具有吸附 活性的吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、高分子 多孔微球以及分子筛。如果按结构和形态可分为：
薄壳型 球形全多孔微粒及堆积硅珠
一、柱内展宽
2. 纵向扩散
Hd
Cd Dm u
组分分子在流动 相中的扩散系数
流动相的线速度
17
第二节 基本原理
一、柱内展宽
3. 传质阻力
(1) 流动相中的传质阻力(Hm)
Hm
Cm
d
2 p
u
Dm
(2) 滞留流动相中的传质阻力(Hsm)
Hsm
Csmd 2pu Dm
18
第二节 基本原理
一、柱内展宽
(3) 固定相(液)内的传质阻力(Hs)
Hs
C
s
d
2 f
u
Ds
柱内各种因素所引起的色谱峰展宽与塔板高
度的关系归结为:
H 2 dpC d u D m C D m d m 2 pu C D ssm d m 2 pu C D sd s2 fu
19
第二节 基本原理
一、柱内展宽 上式可简写为
HABCu u
HAC u
20
第二节 基本原理
7
第一节 高效液相色谱法概述
当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少， 但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。
为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为 有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10 m ）！
直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效 固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了 分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才 真正得到广泛应用。
子量大，不同极性的有机物，生物活性物质及天然产物， 化工产品及环境污染物等等。
方法局限性：
使用多种溶剂，成本高，且易产生污染，梯度洗脱 比气相色谱的程序升温复杂 缺少通用的检测器
分析具有多种沸程的石油产品，不能替代气相色谱 法也不能代替中、低压液相色谱法，尤其对受压易分解 的生物活性样品
第十章 高效液相色谱分析
(high perfomance lquid chromatography) 第一节 概述 第二节 基本原理 第三节 固定相与流动相 第四节 高效液相色谱仪 第五节 定性、定量分析
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5ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
第一节 高效液相色谱法概述
与经典液相色谱法比较 与气相色谱法比较 高效液相色谱的特点
经典液相(柱)色谱法
10 ~ 200 10 ~ 50 75 ~ 600 200 ~ 30 0.001 ~ 0.1
2 ~ 50 1 ~ 10 1 ~ 20
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第一节 高效液相色谱法概述
2. HPLC与GC的比较 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的
稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC 可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类 物质占有机物总数的80%。
11g。
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高效液相色谱法与经典液相(柱)色谱法的比较
项目
方法
色谱柱: 柱长/cm
柱内径/mm
固定相粒度: 粒径/ m
筛孔/目
色谱柱入口压力/MPa
色谱柱柱效/(理论塔板数/m)
进样量/g
分析时间/h
高效液相色谱法
10 ~ 25 2 ~ 10 5 ~ 50
2500 ~ 300 2 ~ 20
2103 ~ 5 104 10-6 ~ 10-2 0.05 ~ 1.0
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第一节 高效液相色谱法概述
流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰
性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流 动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了 起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用 产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制 和改进分离。
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第一节 高效液相色谱法概述
高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱 方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色 谱(液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透 色谱)。
早 期 液 相 色 谱 ， 包 括 Tswett 的 工 作 ， 都 是 在 直 径 1~5cm, 长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的 柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150~200m范围内。 即使这样，流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很 长！
吸附系数 (KA)
分配系数 (KP)
离子色谱
高效微粒离 子交换剂
不同 pH 值 的缓冲溶液
可逆性的 离子交换
选择性系 数 (KS)
体积排阻色谱
不同孔径的 多孔性凝胶
有机溶剂或一定 pH 值的缓冲溶液
多孔凝胶的 渗透或过滤
分布系数 (KD)
13
第一节 高效液相色谱法概述
高效液相色谱的应用范围和局限性
操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
12
第一节 高效液相色谱法概述
高效液相色谱的分类
按分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较
方法 项目 固定相 流动相
吸附色谱
全多孔固 体吸附剂
不同极性 有机溶剂
分配色谱
固定液+ 载体
不同极性有 机溶剂和水
分离原理 吸附 解吸 溶解 挥发
平衡常数
全多孔微粒型 无定型全多孔微粒
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第三节 固定相和流动相
一、固定相
薄壳型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层多孔
活性材料(如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺 等)。表面多孔型固定相的颗粒大(易装柱)、多孔层厚度小且 孔浅(渗透性好，出峰快)；但交换容量小。适于常规分离分 析。
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第二节 基本原理
一、柱内展宽 在色谱柱内各种因素引起的色谱峰扩
展叫柱内扩展。 由气相色谱速率理论可知，范氏方程
概括了影响柱效的各种动力学因素，将范 氏方程加以修正后即可用于高效液相色谱。
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第二节 基本原理
一、柱内展宽
1. 涡流扩散
He 2dp
填充不规则因子 填充物颗粒的平均直径
16
第二节 基本原理
8
第一节 高效液相色谱法概述
1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较
高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，
只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。
高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，
因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。
高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV—10-9g, 荧光检测器—10-
一、柱内展宽
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第二节 基本原理
二、柱外展宽 柱外展宽是指色谱柱外各种因素引起
的色谱峰展宽。
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第三节 固定相和流动相
一、固定相
1. 液-固色谱固定相
液-固吸附色谱所用的固定相，多是具有吸附 活性的吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、高分子 多孔微球以及分子筛。如果按结构和形态可分为：
薄壳型 球形全多孔微粒及堆积硅珠
一、柱内展宽
2. 纵向扩散
Hd
Cd Dm u
组分分子在流动 相中的扩散系数
流动相的线速度
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第二节 基本原理
一、柱内展宽
3. 传质阻力
(1) 流动相中的传质阻力(Hm)
Hm
Cm
d
2 p
u
Dm
(2) 滞留流动相中的传质阻力(Hsm)
Hsm
Csmd 2pu Dm
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第二节 基本原理
一、柱内展宽
(3) 固定相(液)内的传质阻力(Hs)
Hs
C
s
d
2 f
u
Ds
柱内各种因素所引起的色谱峰展宽与塔板高
度的关系归结为:
H 2 dpC d u D m C D m d m 2 pu C D ssm d m 2 pu C D sd s2 fu
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第二节 基本原理
一、柱内展宽 上式可简写为
HABCu u
HAC u
20
第二节 基本原理
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第一节 高效液相色谱法概述
当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少， 但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。
为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为 有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10 m ）！
直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效 固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了 分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才 真正得到广泛应用。