超高效液相色谱PPT讲稿
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高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
《高效液相色谱仪》课件
《高效液相色谱仪》ppt课件
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
超高效液相色谱.pptx
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4 超高效液相色谱的应用
药物分析 如天然产物中复杂组分的分析
生化分析 如蛋白质、多肽、代谢组学等生化样品
食品分析 如食品中农药残留的检测
环境分析 如水中微囊藻毒素的检测
其他
如化妆品中违禁品的检测
第34页/共37页
高分辨串联质谱QTOF micro
灵敏度高(pg-fg级) 和选择性强得到的 质谱谱图数据完整、 品质高。因而，在 天然产物，新药开 发，药代研究和蛋 白质组学领域的定 性、定量分析研究 方面占有重要地位。
2.2 超高速度
高通量实验室始终要求在单位时 间内提供更多的信息和处理更多 的样品并保证提供高质量的数据。
较小的颗粒能超乎寻常地提高分析速度而不降低分离度。
L N ∝ dp
颗粒度减小后，柱长可以按 比例缩短而保持柱效不变
1
最佳流速∝ ——
dp
颗粒度越小，最佳流速也越 大，进而可以通过提高流速
来进一步加快分离速度
两元溶剂管理：
• 高压混合 • 两元梯度 • 四溶剂选择 • 在线脱气 • 低扩散设计 • UPLC的耐压能力
3.1 超高效液相色谱的C18色谱柱
固定相粒度
直径可达
dp
1.7µm
色谱柱长可
达3-5cm
第21页/共37页
色谱柱颗粒化学
第22页/共37页
色谱柱硬件
第23页/共37页
筛板、柱管和连 接件，可在超过 140MPa压力下 装填，保证色谱 柱高柱效和长寿 命。
第5页/共37页
2.理论基础
在高效液相色谱速率理论中， Van Deemter方程式的简 化表达式：
如果仅考虑固定相的粒度 对 的影响，其简化方程式可表 达为：
4 超高效液相色谱的应用
药物分析 如天然产物中复杂组分的分析
生化分析 如蛋白质、多肽、代谢组学等生化样品
食品分析 如食品中农药残留的检测
环境分析 如水中微囊藻毒素的检测
其他
如化妆品中违禁品的检测
第34页/共37页
高分辨串联质谱QTOF micro
灵敏度高(pg-fg级) 和选择性强得到的 质谱谱图数据完整、 品质高。因而，在 天然产物，新药开 发，药代研究和蛋 白质组学领域的定 性、定量分析研究 方面占有重要地位。
2.2 超高速度
高通量实验室始终要求在单位时 间内提供更多的信息和处理更多 的样品并保证提供高质量的数据。
较小的颗粒能超乎寻常地提高分析速度而不降低分离度。
L N ∝ dp
颗粒度减小后，柱长可以按 比例缩短而保持柱效不变
1
最佳流速∝ ——
dp
颗粒度越小，最佳流速也越 大，进而可以通过提高流速
来进一步加快分离速度
两元溶剂管理：
• 高压混合 • 两元梯度 • 四溶剂选择 • 在线脱气 • 低扩散设计 • UPLC的耐压能力
3.1 超高效液相色谱的C18色谱柱
固定相粒度
直径可达
dp
1.7µm
色谱柱长可
达3-5cm
第21页/共37页
色谱柱颗粒化学
第22页/共37页
色谱柱硬件
第23页/共37页
筛板、柱管和连 接件，可在超过 140MPa压力下 装填，保证色谱 柱高柱效和长寿 命。
第5页/共37页
2.理论基础
在高效液相色谱速率理论中， Van Deemter方程式的简 化表达式：
如果仅考虑固定相的粒度 对 的影响，其简化方程式可表 达为：
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速迁移过程中所引起的色谱蜂扩展程度， 将色谱过程与组分在两相间的扩散和传质 过程等动力学因素联系起来，从理论上总 结出影响塔板高度的各种因素。
van Deemter方程
H
2d p
2Dm
u
d
2 p
Dm
u
qk (1 k)2
d
2 f
Ds
u
dp —固定相颗粒平均直径
—填充不规则因子
Dm—组分在流动相中的扩散系数（cm2/s）
0.020
可达到15,000psi
通常有每米200,000理论
0.000
塔板数的柱效
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
Minutes
一分钟以内！
速度、灵敏度及 分离度的完美结合
UPLC™的技术成就
• 小颗粒色谱填料（化学品） • 超高压输液单元（能达到15,000psi） • 降低系统体积并优化流体路径 • 降低自动进样器进样周期的时间、减少交叉污染 • 超高速检测器，包括光学及质谱检测器 • 新的色谱单元之间的通讯协议 • 功能齐全的诊断功能 • 为系统完整性而专门设计的软件
同时也被其所限制。改进色谱柱填料的性 能可以给色谱过程带来速度、灵敏度及分 离度均大幅提高的好处
• 填料的颗粒度对色谱柱性能的贡献最大
速率理论
• 1956年 Van Deemter 等人在塔板理论的基
础上，提出了关于色谱过程的动力学理论— —速率理论。
• 该理论采用塔板高度的概念，但同时考虑
到H还取决于同一组分的不同分子在柱中差
4.00
5.00
6.00
0.024
Minutes
0.020
0.016
0.012
0.008
0.004
0.000
1.70 1.80 1.90 2.00 2.10 2.20 2.30 2.40 2.50 2.60 Minutes
可看到更多 的样品信息
7.00
8.00
使用1.7µm颗粒度 的填料增加灵敏度
AU
0.08
0.04
0.00
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
UPLC™
0.20
样品的组份数：5
1.7µ m颗粒度
完全分离的时间：0.60分钟
0.10
增加了样品 的通量
0.00 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 Minutes
0.00
0.012 0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 0.000 -0.002
0.00
AU
AU
0.50 0.50
1.00 1.00
从80年代到现在 3.5~5µm球形微多孔填料 1500~4000 psi 50,000~80,000塔板数/米 3.9×300mm
10 min
更小的颗粒度……
van Deemter 曲线带来的承诺
如果填料的颗粒继续演变……
填料颗粒尺寸的演变
AU
前景：
0.040
2.1×100mm色谱柱
1.7µm杂化填料颗粒
AU
0.020
0.010
1.7 µm
0.000
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
Minutes
在改进获得信息质量的前提下提高分析速度
Ultra Performance LC™
速度、灵敏度与分离度的结合
生产力：每次实验得到更多信息
AU
0.012 0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 0.000 -0.002
—弯曲因子，亦称阻碍因子
—由柱填充性决定的因子
q—与固定相性质有关的因子，均匀液膜 q为2/3
df—液膜平均厚度
Ds—组分分子在固定液中的扩散系数
填料颗粒尺寸的演变
70年代早期 40µm薄壳非多孔基质上涂布 100~500 psi 1000塔板数/米 1m长色谱柱
10 min
10 min
70年代末期 10µm不规则微多孔填料 1000~2500 psi 25,000塔板数/米 3.9×300mm
系统的技术
超高效由设计而来
检测器：
• 光学及/或质谱检测器 • 可调紫外或光电二极管矩阵 • 为UPLC™专门优化的流动池 • 高速检测
样品管理器：
• 低扩散XYZZ’形式 • 快速进样周期 • 低交叉污染 • 样品盘及/或样品瓶 • 可选样品组织器
色谱柱管理：
• 创新的枢轴转动设计 • 置色谱柱出口直接到检测器
1. Thiourea - 0.430 2. toluene - 1.034
3. propylbenzene - 1.742 4. butylbenzene - 2.413 5. hexylbenzene - 5.058
0.24
UPLC™
0.20
0.16
0.12
HPLC
样品的组份数：5 5µ m颗粒度 完全分离时间：6.00分钟
Ultra Performance LC™
速度、灵敏度与分离度的结合
60% 更快
0.050 0.040
30% 更灵敏
AU
0.030
70% 更高分离度
0.020
0.010
5.0 µm
0.000
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
0.050
Minutes
15.00
0.040
0.030
两元溶剂管理：
• 高压混合 • 两元梯度 • 四溶剂选择 • 在线脱气 • 低扩散设计 • UPLC的耐压能力
Байду номын сангаас
UPLC™ 的速度提高了！
AU AU
1. z0n.oezl0neu4een6en-e-0.-01.081.230788 5. hexylbenzene - 0.360
恒定柱长时；UPLC™的灵敏度提高1.7倍（170%）！
恒定L/dp时；UPLC™的灵敏度提高三倍（300%）！
AU
AU
0.050
0.040
0.030
0.020 0.010 0.000 0.050
5.0 µm
0.040
0.030
0.020
0.010
1.7 µm
0.000
0.00
1.00
2.00
3.00
超高效液相色谱课件
ACQUITY UPLC™
• 超高效液相色谱（Ultra Performance
LC™）是分离科学中的一个全新类别，它 借助于HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒 填料、非常低系统体积及快速检测手段等 全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及 色谱峰容量。
今天的HPLC
科学描述
• 今天HPLC分离的品质取决于色谱柱的填料；
van Deemter方程
H
2d p
2Dm
u
d
2 p
Dm
u
qk (1 k)2
d
2 f
Ds
u
dp —固定相颗粒平均直径
—填充不规则因子
Dm—组分在流动相中的扩散系数（cm2/s）
0.020
可达到15,000psi
通常有每米200,000理论
0.000
塔板数的柱效
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
Minutes
一分钟以内！
速度、灵敏度及 分离度的完美结合
UPLC™的技术成就
• 小颗粒色谱填料（化学品） • 超高压输液单元（能达到15,000psi） • 降低系统体积并优化流体路径 • 降低自动进样器进样周期的时间、减少交叉污染 • 超高速检测器，包括光学及质谱检测器 • 新的色谱单元之间的通讯协议 • 功能齐全的诊断功能 • 为系统完整性而专门设计的软件
同时也被其所限制。改进色谱柱填料的性 能可以给色谱过程带来速度、灵敏度及分 离度均大幅提高的好处
• 填料的颗粒度对色谱柱性能的贡献最大
速率理论
• 1956年 Van Deemter 等人在塔板理论的基
础上，提出了关于色谱过程的动力学理论— —速率理论。
• 该理论采用塔板高度的概念，但同时考虑
到H还取决于同一组分的不同分子在柱中差
4.00
5.00
6.00
0.024
Minutes
0.020
0.016
0.012
0.008
0.004
0.000
1.70 1.80 1.90 2.00 2.10 2.20 2.30 2.40 2.50 2.60 Minutes
可看到更多 的样品信息
7.00
8.00
使用1.7µm颗粒度 的填料增加灵敏度
AU
0.08
0.04
0.00
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
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5.00
5.50
6.00
UPLC™
0.20
样品的组份数：5
1.7µ m颗粒度
完全分离的时间：0.60分钟
0.10
增加了样品 的通量
0.00 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 Minutes
0.00
0.012 0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 0.000 -0.002
0.00
AU
AU
0.50 0.50
1.00 1.00
从80年代到现在 3.5~5µm球形微多孔填料 1500~4000 psi 50,000~80,000塔板数/米 3.9×300mm
10 min
更小的颗粒度……
van Deemter 曲线带来的承诺
如果填料的颗粒继续演变……
填料颗粒尺寸的演变
AU
前景：
0.040
2.1×100mm色谱柱
1.7µm杂化填料颗粒
AU
0.020
0.010
1.7 µm
0.000
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
Minutes
在改进获得信息质量的前提下提高分析速度
Ultra Performance LC™
速度、灵敏度与分离度的结合
生产力：每次实验得到更多信息
AU
0.012 0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 0.000 -0.002
—弯曲因子，亦称阻碍因子
—由柱填充性决定的因子
q—与固定相性质有关的因子，均匀液膜 q为2/3
df—液膜平均厚度
Ds—组分分子在固定液中的扩散系数
填料颗粒尺寸的演变
70年代早期 40µm薄壳非多孔基质上涂布 100~500 psi 1000塔板数/米 1m长色谱柱
10 min
10 min
70年代末期 10µm不规则微多孔填料 1000~2500 psi 25,000塔板数/米 3.9×300mm
系统的技术
超高效由设计而来
检测器：
• 光学及/或质谱检测器 • 可调紫外或光电二极管矩阵 • 为UPLC™专门优化的流动池 • 高速检测
样品管理器：
• 低扩散XYZZ’形式 • 快速进样周期 • 低交叉污染 • 样品盘及/或样品瓶 • 可选样品组织器
色谱柱管理：
• 创新的枢轴转动设计 • 置色谱柱出口直接到检测器
1. Thiourea - 0.430 2. toluene - 1.034
3. propylbenzene - 1.742 4. butylbenzene - 2.413 5. hexylbenzene - 5.058
0.24
UPLC™
0.20
0.16
0.12
HPLC
样品的组份数：5 5µ m颗粒度 完全分离时间：6.00分钟
Ultra Performance LC™
速度、灵敏度与分离度的结合
60% 更快
0.050 0.040
30% 更灵敏
AU
0.030
70% 更高分离度
0.020
0.010
5.0 µm
0.000
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
0.050
Minutes
15.00
0.040
0.030
两元溶剂管理：
• 高压混合 • 两元梯度 • 四溶剂选择 • 在线脱气 • 低扩散设计 • UPLC的耐压能力
Байду номын сангаас
UPLC™ 的速度提高了！
AU AU
1. z0n.oezl0neu4een6en-e-0.-01.081.230788 5. hexylbenzene - 0.360
恒定柱长时；UPLC™的灵敏度提高1.7倍（170%）！
恒定L/dp时；UPLC™的灵敏度提高三倍（300%）！
AU
AU
0.050
0.040
0.030
0.020 0.010 0.000 0.050
5.0 µm
0.040
0.030
0.020
0.010
1.7 µm
0.000
0.00
1.00
2.00
3.00
超高效液相色谱课件
ACQUITY UPLC™
• 超高效液相色谱（Ultra Performance
LC™）是分离科学中的一个全新类别，它 借助于HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒 填料、非常低系统体积及快速检测手段等 全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及 色谱峰容量。
今天的HPLC
科学描述
• 今天HPLC分离的品质取决于色谱柱的填料；