基因探针-分子杂交技术
核酸分子杂交法
核酸分子杂交法这是最早用于性病诊断的重组DNA技术。
基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
杂交的双方是待测核酸及探针。
待测核酸序列为性病病原体基因组或质粒DNA。
探针以放射核素或非放射性核素标记，以利于杂交信号的检测。
所谓杂交（hydridization）指两个以上的分子因具有相近的化学结构和性质而在适宜的条件下形成杂交体（hybrid），杂交体中的分子不是来自一个二聚体分子。
同一个二聚体中的两个分子在变性解离后重组合称为复性。
利用两条不同来源的多核苷酸链之间的互补性而使它们形成杂交体双链叫核酸杂交。
与核酸杂交技术相对应的另一项技术被称为探针技术，它是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技术，我们把标记的分子叫探针（Probe）。
将探针技术与分子杂交技术相结合，从而使分子杂交技术得以广泛推广应用。
目前所用的核酸杂交技术均应用了标记技术。
（一）DNA的变性DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，称为DNA变性。
加热、改变DNA溶液中的pH，或有机溶剂等理化因素的影响，均可使DNA变性。
变性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加。
（二）DNA复性变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性。
复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。
核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价健的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。
杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序就可以形成杂交双链。
分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间，由于DNA一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。
核酸分子杂交技术 ppt课件
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一、常见的核酸探针
（一）基因组DNA探针
基因组DNA探针的制备是将染色体DNA通过超声击断或限制性内 切酶不完全水解，获得许多染色体 DNA的随机片段，选择长度约 15-20kb的DNA片段重组到λ 噬菌体中，经体外包装感染大肠杆菌， 在固体培养基上形成许多噬菌斑。筛选出含目的基因的重组体后， 将目的基因 DNA片段再次亚克隆到大肠杆菌质粒中保存，以便需 要时扩增。 基因组DNA制备还可以通过 PCR扩增基因组DNA的特定片段，然 后将其克隆到大肠杆菌质粒中保存。由于真核基因组含有不编码的 内含子序列，因此，真核基因组 DNA 探针用于检测基因表达时杂 交效率要明显低于cDNA探针。
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(3) 酶
常用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶对核酸探针进行标记。
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(4) 荧光素
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），最大吸收波 长为490nm～495nm，最大发射波长为520nm～530nm，呈黄绿色 荧光， 四乙基罗达明：最大吸收波长为570nm，最大发射波长为595～ 600nm，呈橙红色荧光。
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二、核酸分子杂交的基本原理
根据核酸变性和复性的原理，不同来 源的 DNA 变性后，若这些异源 DNA 之间存在某些相同序列的区域，在退 火条件下则可形成DNA-DNA异源双 链；或将变性的单链 DNA 与 RNA 经 复性处理可以形成DNA-RNA杂合双 链。这种不同来源的单链核酸分子在 合适的条件下，通过碱基互补形成双 链杂交体的过程称为核酸分子杂交 （molecular hybridization）。
高中生物知识理解探针(probe)的定义和应用
定义2：分子生物学和生物化学实验中指示特定物质（如核酸、蛋白质、细胞结构等）的性质或物理状态的一类标记分子。
我的理解是：定义1是狭义的探针，即核酸分子探针（基因探针），定义2应该是广义的探针，包括单克隆抗体探针（单抗）。
下面“基因探针”的具体应用程序：
探针是一小段单链DNA或者RNA片段（大约是20到500bp），用于检测与其互补的核酸序列。双链DNA加热变性成为单链，随后用放射性同位素（通常用磷-32）、萤光染料或者酶（如辣根过氧化物酶，一种临床检验试剂中的常用酶）标记成为探针。
核酸分子杂交示意图
疑难问题：今天在讲解试题中发现，让学生应用DNA分子杂交技术的原理检测植株有没有成为转基因植株，绝大多数学生的答案是用“单抗探针”检测，而不是“目的基因探针”，说明学生对探针不够了解，造成张冠李戴。
定义1：在分子杂交中用来检测互补序列的带有标记的单链DNA或RNA片段。
Hale Waihona Puke 过程示意图 下面是“单抗探针”的具体应用程序：
单克隆抗体只与抗原分子上某一个表位（即抗原决定簇）相结合，利用这一特性就可把它作为研究工作中的探针。
此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能的关系，进而并可从理论上阐明其机理。
如用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与其结合的相应生物大分子（蛋白质、核酸、酶等）在细胞中的位置和分布。
磷-32通常被掺入组成DNA的四种核苷酸之一的磷酸基团中，而荧光染料和酶与核酸序列以共价键相连。
当将探针与样品杂交时，探针和与其互补的核酸（DNA或RNA）序列通过氢键紧密相连，随后，未被杂交的多余探针被洗去。最后，根据放射自显影、萤光显微镜、酶联放大等方法来判断样品中是否，或者何位置含有被测序列（即与探针互补的序列）。
核酸分子杂交过程
核酸分子杂交过程
核酸分子杂交是一种利用两个不同的核酸分子来检测特定基因的技术。
它通过将一个核酸分子 (称为探针) 与另一个核酸分子 (称为模板) 进行杂交来寻找特定的序列。
杂交过程通常需要高温条件来分解核酸分子的二聚体，并使探针与模板结合。
如果探针与模板匹配，则可以使用特定的技术来检测杂交产物。
常见的技术包括 Southern blotting 和 PCR (聚合酶链反应)。
在 Southern blotting 技术中，模板核酸分子被限制性酶切割后，将其电泳分离，然后将其转移到一种特定的膜上，接着用探针核酸进行杂交，再用特定的方法来检测杂交产物。
在 PCR 技术中，模板核酸分子被加热以分解二聚体，然后用特定的引物进行扩增。
这种扩增过程重复进行多次，直到产生足够的样本量。
这种方法能够在短时间内增加核酸分子的数量，因此适用于病毒、细菌和其他微生物的检测。
核酸分子杂交是一种非常重要的生物技术，广泛应用于医学诊断、基因研究、食品安全等领域。
分子杂交技术
分子杂交技术引言分子杂交技术是一种重要的实验手段，在生物学和生物化学领域被广泛应用。
它通过将两个不同源的核酸序列（DNA或RNA）进行杂交，从而得到具有特定性质和功能的新分子。
在本文中，我们将介绍分子杂交技术的原理、应用和未来发展方向。
原理分子杂交技术主要基于核酸的互补配对原理。
DNA和RNA 分子中的碱基有互补配对性质，即腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）或尿嘧啶（U）互补配对，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）互补配对。
在杂交过程中，两个互补的核酸序列会通过碱基间的氢键相互结合，形成一个稳定的双链结构。
应用分子克隆分子杂交技术在分子克隆中起到至关重要的作用。
通过将目标基因的DNA序列与载体DNA进行杂交，可以实现基因的定向克隆。
例如，使用限制性内切酶将目标基因和载体DNA切割开后，通过杂交技术将两者粘合在一起，形成重组DNA，然后可以通过转化、转染等手段将重组DNA导入到宿主细胞中，实现基因的表达。
基因探针分子杂交技术也被广泛应用于基因探针的设计和制备。
基因探针是一种用于检测目标基因在细胞或组织中表达情况的分子工具。
通过将特异性的探针与目标基因进行杂交，可以实现对目标基因的检测和定位。
分子杂交技术可以用于制备放射性或非放射性的探针，例如荧光探针或生物素标记的探针，从而实现对目标基因的高灵敏度和高特异性的检测。
基因组分析分子杂交技术还可以用于基因组分析。
例如，通过杂交技术可以将特异性的探针与目标基因组中的特定区域进行杂交，从而实现对基因组的定位和映射。
此外，分子杂交技术还可以用于研究基因组中的DNA重复序列、非编码RNA等。
DNA鉴定分子杂交技术在DNA鉴定领域也有广泛的应用。
例如，通过杂交技术可以将可疑犯罪嫌疑人的DNA样本与现场留下的DNA样本进行比对，以确定是否属于同一人。
此外，分子杂交技术还可以用于亲子鉴定、物种鉴定等。
未来发展方向随着科技的不断发展，分子杂交技术也在不断更新和发展。
未来，我们可以预见以下几个方面的发展：1.高通量分子杂交技术的发展：随着高通量测序技术的发展，分子杂交技术可以与测序技术结合，实现对大规模样本的高效分析，从而推动基因组学、转录组学等领域的研究进展。
分子杂交名词解释生物化学
分子杂交名词解释生物化学
1.分子杂交（molecularhybridization）：指在体外将两个不同种类的核酸（通常是DNA）互相杂交，形成一个新的双链分子，其中每一条链都来自于不同的原始分子。
2. 探针（probe）：一种标记有特定序列的核酸分子，用于检测样品中是否存在相同或相似的序列。
3. 单链构象（single-stranded conformation）：指单链DNA或RNA分子在特定条件下所呈现的空间结构，可用于分析核酸序列的变异或突变。
4. 限制性内切酶（restriction endonuclease）：一种具有切割特定DNA序列能力的酶，常用于制备DNA片段或检测特定序列。
5. 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）：一种通过模拟生物体内的DNA复制过程，在体外扩增DNA序列的技术。
可用于检测或分析极微量的DNA样品。
6. 荧光素酶（luciferase）：一种常用于检测生物体内基因表达水平的标记酶。
常与荧光素底物配合使用，通过检测底物发光信号来表征目标基因的表达程度。
7. 反向转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）：一种将RNA转录为cDNA，再通过PCR扩增cDNA的技术。
常用于研究基因表达调控机制。
以上是分子杂交在生物化学领域中的相关概念和术语，相信可以帮助读者更好地了解和应用分子杂交技术。
分子杂交技术
分子杂交技术分子杂交技术互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。
杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。
杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。
该检测对象可以是克隆化的基因组DNA,也可以是细胞总DNA或总RNA。
根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。
探针必须经过标记，以便示踪和检测。
使用最普遍的探针标记物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。
核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。
因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。
第一节核酸探针标记的方法核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。
下面将介绍各种类型的探针及标记方法。
一、双链DNA探针及其标记方法分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。
双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。
1. 切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时, DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。
同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。
由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。
分子杂交技术(精)
1、检测受体细胞中的标记基因是否表达，即是否表现出标记基因的性状，从而判断受体细胞中是否已导入含有目的基因的运载体。
如果检测出标记基因表达的性状，说明运载体已导入受体细胞。
2、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。
检测方法是：采用DNA分子杂交技术。
先将转基因生物的基因组提取出来；把目的基因的DNA片段用放射性同位素作标记做成探针；使探针与基因组DNA杂交，如果出现杂交带，就表明目的基因已插入染色体DNA中。
3、检测目的基因是否转录出了mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。
采用DNA与RNA分子杂交技术。
从转基因生物中提取出mRNA，把目的基因的DNA片段用放射性同位素作标记做成探针；使探针与mRNA杂交，如果出现杂交带，就表明目的基因转录出了mR NA。
4、检测目的基因是否翻译成蛋白质。
从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗进行同位素标记）进行抗原——抗体杂交；如果出现杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品。
5、个体生物学水平的鉴定。
如：一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否具有了抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验，观察害虫的存活情况或植物的患病情况以确定是否具有抗性及抗性的程度。
又如：有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能中否与天然产品相同，甚至超过天然产品。
互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。
杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。
目的基因的检测与鉴定的补充课本Southern杂交法一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。
核酸分子杂交和PCR技术
核酸的分子杂交技术一、核酸分子杂交用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原那么发生异源性结合，再经显影或显色的方式，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。
待测的核酸序列，能够是克隆的基因片段，也能够是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。
二、核酸分子杂交的分类液相杂交核算分子杂交印记杂交固相杂交原位杂交1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。
2.液相杂交：参与反映的两条核酸链都游离在液体中。
经常使用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。
三、核酸分子杂交的大体原理一、变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规那么的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。
﹡引发核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。
﹡加热变性是最经常使用的方式，一样加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。
﹡变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。
可用紫外吸收的转变来跟踪DNA的变性进程。
以A260吸收值对应温度作图，取得DNA的变性曲线或熔解曲线。
增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。
DNA热变性现象双螺旋结构即发生解体，两条链分开形成无规那么线团。
同时，一系列物化性质发生改变：260nm处紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高。
由于二级结构的丧失，也失去了部份或全数生物活性。
增色效应和减色效应当DNA分子加热变性后，其260nm的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应。
变性DNA复性后，在260nm处的吸收值减少的现象称为减色效应。
A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，现在50%的DNA分子发生了变性。
基因探针分子杂交技术
分子杂交技术的分类
❖ 根据探针来源的不同，可分为
可以与dCTP连接成地高辛-dCTP
电泳分离及变性处理
❖ 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 ❖ 变性处理 ❖ 通常DNA变性的方法：热变性、酸碱
变性、化学试剂变性 ➢ 在0.4M NaOH碱性条件下变性
0.4M NaOH 凝胶
转移并固定到滤膜上
❖ 通过毛细管虹吸法，将凝胶上的DNA转移到硝 酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射 将DNA固定在滤膜上。
同源性程度,检测特定核苷酸序列在样品中的存在及含量。
目前已知的三千多种遗传性疾病中,只有很少一部分可以通过检测基因的表达产物(蛋白质或酶)的改变予以诊断。
Southern杂交
DNA
核酸
Northern杂交
RNA
核酸
Western杂交 蛋白质
抗体
基本操作程序
印迹（blotting）
将样品在凝胶 上分离，然后 将样品通过 “影印”的方 式转移到固相 支持物上（如 滤膜）。
杂交
将已印迹有样 品的滤膜与带 有放射性标记 或其它标记的 探针进行杂交。
结果检测
通过放射自显 影或显色反应， 判断样品中是 否有与探针同 源的分子。
Southern杂交
检测样品DNA的处理 电泳分离及变性处理 转移并固定到滤膜上
探针的制备及杂交 检测与分析
检测样品DNA的处理
❖ 提取检测样品的基因组DNA ❖ 用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的DNA片段
分子杂交技术的原理和应用
分子杂交技术的原理和应用1. 引言分子杂交技术是一种重要的实验室技术，它在分子生物学研究、基因工程以及药物研发等领域得到了广泛应用。
本文将介绍分子杂交技术的原理和应用。
2. 原理分子杂交技术基于互补配对原则，利用单链核酸的碱基序列进行互补配对。
在分子杂交实验中，我们通常使用DNA或RNA进行杂交。
2.1 DNA杂交DNA杂交是一种通过碱基互补配对的技术，它可以用于检测和分离特定的DNA序列。
DNA杂交实验可以分为两类：杂交化合物的制备和杂交温度的确定。
2.1.1 杂交化合物的制备在DNA杂交实验中，我们需要制备含有目标DNA序列的探针。
探针可以使用放射性核苷酸或荧光标记的核苷酸进行标记。
在制备过程中，我们需要提取目标DNA序列，并与探针进行杂交反应。
2.1.2 杂交温度的确定杂交温度是DNA杂交实验中非常重要的参数。
通过控制杂交温度，我们可以选择性地分离目标DNA序列。
一般来说，杂交温度应高于DNA的熔解温度，但低于探针与非特异性DNA序列的杂交温度。
2.2 RNA杂交RNA杂交是一种用于检测和分离特定RNA序列的技术。
与DNA杂交类似，RNA杂交实验也基于碱基互补配对原理进行。
在RNA杂交实验中，常使用荧光标记的核苷酸或荧光标记的探针进行标记。
3. 应用分子杂交技术在多个领域中得到了广泛应用。
以下是几个典型的应用案例：3.1 基因检测和筛选分子杂交技术可以用于检测和筛选特定基因。
通过制备含有目标基因序列的探针，我们可以将探针与待测样品中的DNA或RNA发生杂交反应，从而确定目标基因的存在与否。
3.2 基因表达调控分子杂交技术可以用于研究基因的表达调控。
例如，研究人类疾病的基因调控机制时，可以利用分子杂交技术检测特定基因的表达水平。
3.3 药物研发分子杂交技术在药物研发中也得到了广泛应用。
通过制备含有药物靶标基因的探针，可以使用分子杂交技术来筛选药物候选化合物，从而加快药物研发过程。
3.4 产业应用分子杂交技术在农业和畜牧业中也有重要应用。
分子杂交技术名词解释
分子杂交技术名词解释
分子杂交技术（Molecular Hybridization）是一种用于研究DNA或RNA序列的方法。
它通过将DNA或RNA样本与一个已知序列的探针进行杂交，然后利用探针的标记来检测目标序列是否存在。
这种方法可以用于许多应用，例如基因定位、基因诊断和基因组分析等领域。
在分子杂交技术中，探针通常是一条短的DNA或RNA序列，它与目标序列互补匹配，并且可以带有一种标记，如荧光素或辐射性同位素，以便于检测。
通过将样本与探针进行杂交，可以形成一个稳定的DNA或RNA双链，这种双链可以通过多种方法进行检测，例如放射性测量或荧光显微镜观察。
分子杂交技术的一种常见的应用是Southern blotting，它可以用于检测特定的DNA序列。
在Southern blotting中，DNA样本首先通过电泳分离，并转移到膜上。
然后，与目标序列互补的DNA探针与膜上的DNA进行杂交，形成一个稳定的DNA双链，这可以通过标记的探针进行检测。
另一种常见的分子杂交技术是Northern blotting，它用于检测RNA序列。
在Northern blotting中，RNA样本首先通过电泳分离，并转移到膜上。
然后，与目标序列互补的RNA探针与膜上的RNA进行杂交，形成一个稳定的RNA双链，这可以通过标记的探针进行检测。
总之，分子杂交技术是一种广泛应用于生物学和医学领域的方法，它可以用于检测和分析DNA和RNA序列。
它的应用范围包括基因定位、基因诊断、基因组分析和疾病诊断等领域。
核酸分子杂交的原理和实验方法
核酸分子杂交的原理和实验方法原理所谓DNA探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。
如果靶基因和探针的核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。
在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成掺入地高辛的DNA链。
以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。
一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。
免疫检测采用过氧化物酶系统，DAB显色。
敏感性很高。
可用于膜上杂交和原位杂交。
操作程序(1) 随机引物标记操作程序如下：①用灭菌去离子蒸馏水稀释1μg DNA至总体积16μl。
②DNA热变性：把DNA瓶置于沸水中，水浴10分钟。
然后，迅速地插入碎冰中3分钟以上。
③加4μl DIG Random Labeling Mix(高效),混匀后再离心2000/r.p.m×5分钟。
④置37℃反应至少120分钟。
时间越长，产量越高。
延长反应时间至20小时可明显增加地高辛标记DNA的产量。
应根据需要控制反应时间。
⑤加入2μ1 10mM EDTA以中止反应，对于原位杂交和膜上杂交反应来说，标记反应可告结束，上述反应液置-20℃保存至少一年以上。
且可反复使用。
可根据下表估计标记产量：DNA模板量标记一小时标记二十小时10ng 45ng 600ng30ng 130ng 1050ng100ng 270ng 1500ng300ng 450ng 2000ng1000ng 850ng 2300ng3000ng 1350ng 2650ng(2)核酸探针膜上杂交原理和操作（一）杂交总原则脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成DNA的一级结构。
两条碱基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋，构成DNA的二级结构。
DNA分子杂交技术
DNA分子杂交技术在高中生物教材中，多次提到DNA分子杂交技术，但对于DNA分子杂交技术所用到的工具、依据的原理及应用领域等都只是一带而过，让许多教师和学生深感疑惑，从而导致对此知识理解不深，造成教学和学习上的困难。
在此，笔者对其在高中生物教材中出现过的一些内容进行补充介绍，以期加深理解，达到解疑释惑的目的。
1、什么叫DNA分子杂交技术？DNA分子杂交技术又称DNA探针技术，是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，对某一特异性DNA序列进行探查的新技术。
2、DNA分子杂交技术的原理DNA分子杂交的原理是,具有互补碱基序列的DNA分子,可以通过碱基对之间形成氢键等,形成稳定的双链区。
在进行DNA分子杂交前,先要将两种生物的DNA分子从细胞中提取出来,再通过加热或提高pH的方法,将双链DNA分子分离成为单链,这个过程称为变性。
然后,将两种生物的DNA单链放在一起杂交,其中一种生物的DNA单链事先用同位素进行标记。
如果两种生物DNA分子之间存在互补的部分,就能形成双链区。
由于同位素被检出的灵敏度高,即使两种生物DNA分子之间形成百万分之一的双链区,也能够被检出。
3、DNA分子杂交技术的工具 ------ ＤＮＡ探针DNA探针是利用放射性同位素(如32P)、荧光分子等标记的特定DNA片断，该片断可大至寄生虫基因组DNA，小至20个碱基。
DNA探针具有特异性；由于用放射性同位素（如32P）或生物素标记探针，使杂交试验同时具有高度的敏感性。
4、DNA分子杂交技术的应用(1) 不同种生物之间亲缘关系的判断不同种生物之间亲缘关系的判断，常采用比较不同生物DNA分子差异来进行,常用DNA分子杂交法。
将两种生物的DNA分子单链放在一起,如果这两个单链具有互补的碱基序列,就会形成杂合双链区。
互补的碱基序列越多，形成的杂合双链区就越多，说明两种生物间的亲缘关系就越近(如图)。
或者是把两个物种的DNA单链融合在一起，然后对这条新的DNA加热。
常用的分子生物学基本技术核酸分子杂交技术
常用的分子生物学基本技术核酸分子杂交技术由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。
其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。
杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。
核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。
根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。
固相杂交固相杂交（solid-phasehybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。
斑步杂交（dot hybridization）是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。
该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。
该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。
印迹杂交（blotting hybridization）Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。
可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。
Northern印迹杂交:由Southerm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。
分子杂交技术原理
分子杂交技术原理分子杂交技术是一种重要的分子生物学技术，它可以用于研究DNA、RNA和蛋白质等生物分子的结构、功能和相互作用。
分子杂交技术的原理主要包括杂交、探针和探针标记三个方面。
首先，杂交是指两条不同DNA或RNA分子之间的碱基互补配对。
在实验室中，可以通过将一条标记有放射性同位素或荧光染料的DNA或RNA探针与待检测的DNA或RNA样品进行杂交，来检测目标分子的存在和数量。
杂交的原理是基于DNA和RNA的碱基互补配对规律，即腺嘌呤（A）与鸟嘌呤（T）之间形成两个氢键，胞嘧啶（C）与鸟嘌呤（G）之间形成三个氢键，因此可以利用这种互补配对关系来进行特异性的分子识别。
其次，探针是分子杂交技术中的重要组成部分，它是一段已知序列的DNA或RNA分子，可以与待检测的目标分子特异性地进行杂交。
探针的选择对于分子杂交技术的准确性和灵敏度有着重要的影响，因此需要根据待检测目标的特点来设计合适的探针序列，以确保杂交的特异性和稳定性。
最后，探针标记是指在探针上标记放射性同位素、荧光染料或酶等标记物，用于检测探针与目标分子的杂交情况。
通过标记探针，可以使其在杂交后产生特定的信号，如放射性同位素探针可以通过放射性测定来检测目标分子的数量，荧光标记探针可以通过荧光显微镜或荧光成像系统来观察目标分子的位置和表达水平，酶标记探针可以通过酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法来检测目标分子的存在和活性。
综上所述，分子杂交技术的原理包括杂交、探针和探针标记三个方面，通过这些原理可以实现对DNA、RNA和蛋白质等生物分子的检测和分析。
分子杂交技术在基因工程、生物医学研究和临床诊断等领域具有重要的应用价值，对于揭示生命活动的分子机制和疾病发生发展的机理具有重要意义。
希望本文对分子杂交技术的原理有所帮助，谢谢阅读！。
简述分子杂交技术的一般实验流程
简述分子杂交技术的一般实验流程title: 分子杂交技术的实验流程
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分子杂交技术是一种常用的基因工程技术，可用于研究DNA或RNA 序列相似性和寻找同源基因，广泛应用于生物学、医学和农业等领域。
下面我们就来简述一下分子杂交技术的一般实验流程。
1、提取RNA/DNA：首先需要从所研究的生物体中提取RNA或DNA，可以用CTAB法、酚-氯仿法、盐法等各种方法进行提取。
这一步是确
保我们得到高质量的RNA/DNA样本。
2、切割DNA/RNA：若是研究DNA，我们需要使用限制性内切酶切
割DNA；若是用RNA做实验，则需要将RNA转录为cDNA，再使用DNA
酶切割。
这一步的目的是将DNA或RNA分成大量不同大小片段，方便
后续操作。
3、膜上杂交：将DNA或RNA片段与检测DNA/RNA杂交。
这一步需
要将DNA或RNA固定在膜上（通常是聚丙烯腈或硝酸纤维素等），再
用检测DNA或RNA分子与固定的DNA或RNA分子进行杂交反应，以寻
找相同的序列。
4、洗膜：反应后用高盐缓冲液和低盐缓冲液交替洗膜，以去除无
法杂交的DNA/RNA分子，保留杂交的分子。
5、探针检测：将探针（单链RNA或DNA）标记为荧光物等，将其与膜上DNA或RNA分子进行杂交，检测所寻找的DNA/RNA序列是否存在。
如果存在，则探针与目标DNA/RNA分子杂交结合并发出信号，证明样本中有这一特定的序列存在。
综上，这是分子杂交技术的一般实验流程，不同的实验目的会增加一些额外的步骤或调整实验参数。
因此实验过程中要特别注意各操作的条件和细节，以保证实验结果的真实性和可靠性。
DNA分子杂交技术及其原理
什么是DNA分子杂交技术？给你做个比喻，希望对你理解有帮助。
将宿主DNA（一般做克隆是有很多宿主DNA）比喻成很多还没装锁的“门”，而你希望插入宿主DNA上（或替换掉一段序列）的目的基因比做是一把特定的“锁”，而这个基因探针就是能开那把锁唯一的“钥匙”。
如果你能用“钥匙”打开某个“门”，说明“锁”已经装上了。
也就是说如果能检测到杂交信号，说明目的基因已经接到宿主DNA上了。
杂交的原理其实就是碱基互补配对。
至于怎么看出来是否杂交上，这个是要在探针上做标记（标记可以有很多种，生物的、荧光的、放射性的等等），杂交后是要洗脱的，只有这种特异性的杂交才被保留下来，再通过检测探针上的标记来看出是否杂交上。
比如上面的“钥匙”，就像你用一串的“钥匙”去试，但你可以先在要的那个“钥匙”上做个标记，你不要认识“钥匙”的齿（这里的齿你可以想像成探针的序列），只要认识“钥匙”上的标记就行。
（这个比喻有点漏洞，就是原始的那些“门”不管用不用钥匙都不能打开，但我暂时没想到其它比方）什么是DNA分子杂交原理？DNA分子杂交：DNA分子杂交的基础是，具有互补碱基序列的DNA分子，可以通过碱基对之间形成氢键等，形成稳定的双链区。
在进行DNA分子杂交前，先要将两种生物的DNA分子从细胞中提取出来，再通过加热或提高pH的方法，将双链DNA分子分离成为单链，这个过程称为变性。
然后，将两种生物的DNA单链放在一起杂交，其中一种生物的DNA单链事先用同位素进行标记。
如果两种生物DNA分子之间存在互补的部分，就能形成双链区。
由于同位素被检出的灵敏度高，即使两种生物DNA分子之间形成百万分之一的双链区，也能够被检出。
DNA分子杂交的意义：分类学上不同物种的DNA分子之间可以进行分子杂交，但是，远缘物种的DNA分子之间进行杂交分子的可能性远比近缘物种的要小得多。
例如，细菌与真核细胞DNA分子之间形成杂交分子的可能性很小；不同细菌的DNA分子之间杂交时，能形成某些互补片段；人的DNA分子与小鼠的DNA分子之间杂交时，只有少量的人DNA单链和小鼠DNA单链能形成杂交分子，而且只是部分碱基配对。
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Northern杂交 检测对象为RNA RNA。 1、检测对象为RNA。 Southern杂交不同的是 杂交不同的是： 2、与Southern杂交不同的是：1）不需 要限制性核酸酶切； 要限制性核酸酶切；2）变性方法不是碱 变性，而是采用化学试剂变性法。 变性，而是采用化学试剂变性法。 3、主要用于检测某一组织或细胞中已知 的特异mRNA的表达水平， mRNA的表达水平 的特异mRNA的表达水平，或比较不同组 织或细胞的同一基因的表达情况。 织或细胞的同一基因的表达情况。
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基因探针 ——分子杂交技术 分子杂交技术
基因探针
基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记， 基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记， 且序列已知的， 且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列 (DNA或RNA)。 或
分子杂交技术的分类
根据其检测对象不同， 根据其检测对象不同，可分为
检测对象 Southern杂交 杂交 Northern杂交 杂交 Western杂交 杂交 DNA RNA 蛋白质 探针 核酸 核酸 抗体
基本操作程序
结果检测 杂交 印迹
将样品在凝胶 上分离， 上分离，然后 将样品通过 影印” “影印”的方 式转移到固相 支持物上（ 支持物上（如 滤膜）。 滤膜）。
可以与dCTP 可以与dCTP连接成 dCTP连接成 地高辛地高辛-dCTP
原理： 原理： 地高辛 + 抗地高辛抗体 （带有荧光素或酶的标记） 带有荧光素或酶的标记）
杂交 预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂 预杂交： 液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA 或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本 身对探针的吸附。 杂交： 杂交：在一定的温度和溶液条件下，将标记的探 针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针 同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链， 从而吸在滤膜上。
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转移的方法
毛细管虹吸法、电转移法、 毛细管虹吸法、电转移法、真空转移法
探针的制备 一、探针的合成 PCR、化学合成等方法 二、探针的标记 同位素：3H、35S、32P等 非同位素：地高辛、生物素、荧光素等
地高辛： 地高辛：
杂交炉
安装杂交管
洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除 去。
检测与分析
1、放射自显影：适用于放 放射自显影： 射性同位素标记的探针 化学发光检测 2、比色或化学发光检测： 比色或化学发光检测： 适于非同位素标记的探针 通过放射自显影或生化检 测，就可判断滤膜上是否 存在与探针同源的DNA DNA分子 存在与探针同源的DNA分子 及其分子量。 及其分子量。
将已印迹有样 品的滤膜与带 有放射性标记 或其它标记的 探针进行杂交。 探针进行杂交。
通过放射自显 影或显色反应， 影或显色反应， 判断样品中是 否有与探针同 源的分子。 源的分子。
Southern杂交
检测样品DNA的处理 的处理 检测样品 电泳分离及变性处理 转移并固定到滤膜上
Western杂交
1、基本原理和基本过程与Southern 、基本原理和基本过程与 杂交基本相同 杂交基本相同 2、检测对象为蛋白质（或酶） 、检测对象为蛋白质（或酶） 3、SDS-PAGE电泳分离 、 电泳分离 4、用“抗体 抗原”免疫反应或 抗体-抗原 抗原” 、 “DNA-protein”结合反应鉴别滤膜 ” 上的蛋白质。 上的蛋白质。
0.4M NaOH 凝胶
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转移并固定到滤膜上
通过毛细管虹吸法，将凝胶上的 通过毛细管虹吸法，将凝胶上的DNA转移到硝 转移到硝 酸纤维素膜或尼龙膜上。 酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射 固定在滤膜上。 将DNA固定在滤膜上 固定在滤膜上
探针的制备及杂交
检测与分析
检测样品DNA的处理
提取检测样品的基因组DNA 提取检测样品的基因组 用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的DNA片段 用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的 片段
电泳分离及变性处理
琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 片段 琼脂糖凝胶电泳分离 变性处理 通常DNA变性的方法：热变性、酸碱 变性、化学试剂变性 在0.4M NaOH碱性条件下变性 碱性条件下变性