哺乳动物Shaker家族电压依赖型钾通道的晶体结构

哺乳动物Shaker家族电压依赖型钾通道的晶体结构电压依赖型钾通道，顾名思义，当膜电压发生变化时，会运输钾离子穿越细胞膜，从而通过控制细胞形态以及动作电位的频率来调节神经元的兴奋性。

本文章报道了一个分辨率为2.9埃的哺乳动物的Kv通道（Kv1.2通道）晶体结构，这个通道属于Shaker型钾通道家族成员。

该通道与一个氧化还原酶的β亚基形成复合结构。

在细胞原始环境下，这一氧化还原酶β亚基可以调控哺乳动物的Kv通道。

在通道内端与细胞质之间存在一个很大的侧向入口沟通两者。

侧向入口的静电性能以及T1域和β亚基的位置与门控失活的电生理学研究是吻合的，钾通道可能受到β亚单位的调控。

电压依赖型钾通道是电压依赖型阳离子通道家族的成员，这个家族包括钾通道，钠通道以及钙通道。

这些通道普遍存在于广阔的生物王国中。

在真核细胞中，他们与其他离子通道相互协作共同参与或调控细胞的电生理活动。

这种电生理活动在电敏感细胞如神经元以及肌肉细胞以及非电敏感细胞的许多生理活动中都发挥重要作用。

在典型的易兴奋细胞神经元细胞中，Kv通道帮助膜电压在动作电流后回复到静息电位，并且能够调整动作电流的形状以及控制动作电流的激发率。

我们大部分对于Kv通道的了解来源于对黑腹果蝇Shaker钾通道以及在哺乳动物中其他家族成员的研究。

由于Shaker家族通道可以轻松的在非洲爪蟾蜍卵母细胞中表达，因而被广泛的用于电生理学研究。

但是不同的是，我们对于钾通道结构的了解却仅限于原核生物的研究。

这是因为它们可以在大肠杆菌（Escherichia coli）中高水平表达。

这些研究揭示了很多关于孔、选择性滤器以及门控的知识。

真核生物Kv通道在许多方面都和原核生物有相似之处。

由于选择性过滤器非常保守，我们猜测其结构在所有Kv通道中本质上都是一样的。

‘孔螺旋形成漏斗形，选择性过滤器位于接近胞外的宽口端’这一说法被认为是一个保守的特征。

然而，除了它们保守的孔以及一些调控通道开放的特定的域，真核生物Kv通道有一些与众不同的特征。

例如，在S6内部螺旋（在选择性滤器细胞内端），有一段高度保守序列Pro-X-Pro（X可以是任意的氨基酸），存在于Shaker家族Kv通道，但是并不存在于原核生物Kv通道。

突变实验显示这一段序列对于门控相当重要，但是原因还不清楚。

由此可以推测Shaker Kv通道的内部孔腔（由S6内螺旋围成）与原核生物不相同。

Shaker家族Kv通道对于真核生物来说是特有的，不存在于原核生物中，这有利于我们了解真核生物Kv通道与原核生物的区别。

在第一个跨膜螺旋S1之前，N端在细胞内形成T1域。

分别来自于四个Shaker Kv通道亚基的四个T1域在细胞膜内表面形成一个四聚体。

四聚体处在通道孔腔与细胞质之间的入口处，这意味着跨膜通道需要与细胞质通讯从而让钾离子自由的在细胞与跨膜通道之间流动。

这一入口不仅足够钾离子通过，而且在一些Shaker 家族Kv通道中还能允许通道N端进入介导门控失活。

T1域在真核生物Kv通道中充当β亚基的对接平台。

β亚基形成一个与醛固酮还原酶有关的四聚体蛋白，这是一种基于NADPH的具有α-β桶结构的氧化还原酶。

β亚基四聚体以及β-T1复合体的晶体结构显示酶活位点包括一个NADP+辅因子以及氢转移催化残基。

但是由于β亚基的功能未知，所以其活性位点还是个谜。

它是一个被Kv通道调控的酶还是作为Kv通道的传感器帮助细胞通过氧化还原状态影响膜的电生理活动。

差不多所有的在哺乳动物神经系统中的Shaker家族Kv通道都有这些β亚基氧化还原酶。

实验证据表明在真核生物以及原核生物中电压依赖的门控本质上是相似的，而且它们的电压传感器的结构是类似的。

但是关于Shaker家族Kv通道的结构研究可以提示更多的信息。

原核生物Kv通道KvAP的结构揭示完整的磷脂双分子层细胞膜对于保证电压传感器正确的导向孔有重要作用。

但是在分离通道的过程中，细胞膜被去除。

这使得推导电压传感器和孔之间的电偶联的所有尝试都变得含糊不清。

Kv通道的电压传感器被细胞内的T1域束缚，以维持它和孔脆弱的作用。

Kv1.2-β亚基复合体的结构。

T1域和β亚基的结构很严格，而且在β亚基层被包装的很好。

孔位于细胞膜上，相对来说比较自由，电压传感器与周围的蛋白分子作用少，自由度最高。

β亚基，T1域，孔以及S4-S5 linker的结构模型基本完整，保存了大部分侧链。

电压传感器的四个片段（S1-S4）构建起的结构没有S1-S2，S2-S3以及S3-S4之间的环。

由于这一区域侧链的电子密度最弱，所以先前对于KvAP结构的了解能够帮助构建电压传感器。

T1域与S1之间的连接是用两个甘氨酸螺旋构建。

T1-S1 linker像一个垫片一样将跨膜孔道与通道胞内部分隔开。

孔螺旋与电压传感器螺旋之间以一种不寻常的方式关联。

电压传感器与相邻亚基的孔锁在一起。

从细胞外俯视时可以看得更清楚。

见下图。

电压传感器与孔之间依靠S4-S5 linker 连结，S4-S5 linker与细胞内表面平行，和内螺旋束crossing在一个水平面。

在KcsA中内螺旋束是指在选择性过滤器在细胞内排成一排的四个右转内螺旋束。

这样一个可膨胀可压缩的结构对于离子通道的打开和关闭起着至关重要的作用。

在Kv1.2-β2晶体结构中，电压传感器螺旋貌似倾斜着存在于膜中，但是它们有一个天然的跨膜定位信号——在膜表面螺旋之间的疏水环。

运输离子的孔。

四个不同原核生物钾通道（KcsA，MthK，KirBac以及KvAP）的结构已经通过X射线晶体学解析出来。

对比这些通道可以总结出钾通道的两个重要方面：1.孔细胞外端的钾离子选择性滤器是高度保守的；2.内孔腔（在选择性滤器与细胞内液之间）形态各异。

钾离子选择性滤器的保守性提示其对于钾离子的选择性机制也是保守的，而内孔腔的多变可能是由于通道开放关闭时构象的变化导致。

在已公布的结构中，KcsA以及KirBac 在孔内螺旋束最窄地方的大小上看起来像是关闭状态的通道。

而MthK和KvAP看起来就像是开放状态。

在图中，A和B，Kv1.2孔的两个亚基和KcsA（关闭，灰色）以及KvAP（开放，蓝色）叠加。

Kv1.2的内螺旋在KcsA与KvAP之间，但是更接近KvAP。

Kv1.2的孔在bundle crossing处的直径大约是12埃，这表明晶体结构中的通道是打开的。

Kv1.2的内螺旋包含氨基酸序列Pro-V al-Pro，这一序列在Shaker家族Kv通道中高度保守。

这些氨基酸使S6内螺旋弯曲，使得在细胞内表面它们几乎相互平行。

弯曲的内螺旋似乎是Kv通道特有的。

在KvAP（一个原核生物Kv通道）的内螺旋上，一个甘氨酸残基使其产生类似的弯曲。

因此，序列Pro-x-Pro和甘氨酸是使内螺旋弯曲的两种途径。

连接T1域到S1的α螺旋linkers从孔中央向外发散，在孔与T1域之间形成一个很大的空间。

这可以实现两个功能：①在通道开放时使得内螺旋构象变化时不会接触到T1域以或者linkers；②在通道入口与细胞质之间形成一个低阻力的扩散途径。

四个侧向门户每个的直径从15到20埃不等。

这一区域的表面上有许多带负电的氨基酸，尤其是侧向门户的边缘，它们产生的静电势会吸引阳离子。

通道的这一特征让人想起乙酰胆碱受体离子通道细胞内的入口通道。

侧向门户的大小以及静电学特性提供了关于Shaker家族钾通道子成员重要门控形式N-type或者‘链球模型’激活的信息。

在膜去极化后，这一子成员形成瞬时的钾电流，称为A电流，而不是维持延迟整流钾电流。

A电流通道和延迟整流通道给予细胞不同的电流特征。

例如，延迟整流通道（如Kv1.2）使细胞膜电位在动作电流后回复到静息电位，而A电流通道调整特定的神经元的动作电流频率使其输出占总神经元电流一定比例的电流。

从结构透视图可以看出A电流通道和延迟整流通道的细微差别：A电流通道细胞内的N端或者说关联的β亚基的N末端全是right composition of amino acids，这允许末端可以进入内孔腔，使通道在开放后失活。

这种N末端被称为失活门或者失活多肽，导致A电流Kv通道的瞬变现象。

膜去极化时，通道开放输送钾离子，但是接着通道就失活，这已被Aldrich和他的同事证实。

他们还确定了N末端阻断Shaker家族Kv通道孔所必须的氨基酸。

前十个氨基酸主要是疏水性质的，亲水以及带正电的氨基酸紧随其后。

疏水部分深埋到疏水环境中，而亲水的正电氨基酸对于失活门与孔之间的静电作用有重要作用。

有关人Kv1.4通道的进一步研究表明疏水N末端进入由疏水氨基酸组成的内孔腔，而亲水部分的正电氨基酸则和T1域以及T1-S1 linker上的负电氨基酸发生静电作用。

我们可以再Kv1.2的结构中看到侧向门户上的负电氨基酸。

可以想象一条蛇形的氨基酸从侧向门户插入到孔疏水环境中，并与门户表面的负电发生静电作用。

孔，T1域以及β亚基催化位点之间的关系。

到目前为止，Shaker Kv通道第一个也是唯一已经确定的功能是参与失活。

β1亚基N末端有一段氨基酸序列还有其它的功能。

β亚基可以影响通道表达的水平，它们也许起到通道伴侣的作用。

β亚基酶活位点上存在保守的氢转移催化残基，提示β亚基在行使催化功能中起着重要作用。

Kv通道可以调控β亚基的活性，或者更可能是，β亚基调控通道的活性。

β亚基就像一个氧化还原传感器，将细胞的氧化还原状态与膜上的电活动偶联在一起。

β亚基的活性位点有一个NADP+辅助因子以及一些氢转移催化残基。

这一辅助因子存在于Kv1.2-β 2 晶体结构中。

（左图所示为NADP+辅助因子的省略电子密度被限制在β亚基的活性位点）另外，在我们所有的电子密度图上都有一些不清楚的其他的电子密度覆盖在活性位点上。

在活性位点缝隙表面有许多芳香族氨基酸而且高度疏水。

这些电子密度不是来自于多肽链就是来自于大型有机分子。

如果它是一个多肽链，那么它可能是通道的一部分或者是在通道纯化过程中脱离出来的。

通道的晶体结构T1域的N端有31个混乱的氨基酸，C端有78个。

将N端还是C端结合在β亚基活性位点，与辅助因子的氧化和还原有密切关系，这会影响Kv通道的功能。

例如，在一些Shaker家族Kv通道中，与T1前面多肽链的结合影响失活门的性能。

由于C末端多肽直接连接在内孔区螺旋，它在通道开放与关闭过程中肯定会经历大的位移，很可能会影响门控。

Kv1.2-β2晶体结构能够帮助我们验证这些想法。

总结。

文章描述了哺乳动物Shaker家族Kv通道Kv1.2与β2形成的复合物的晶体结构。

两者都在Pichia pastoris中表达。

两个因数对于得到晶体并解析结构起着必不可少的作用。

去垢剂和脂质的混合物被用于纯化和结晶化，为了减少氧化作用还采取了许多其他措施。

脂质在这项工作中的重要性提示了在膜蛋白结构研究中脂质的一般用途。