细胞工程-第九章 转基因动物与生物反应器11.10PPT幻灯片
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研究者将高度活跃的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 (PEPCK-C)基因注入老鼠胚胎。基因转化的老鼠在运 动时有效利用身体脂肪产生能量，同时避免产生大
8
量乳酸。
4.无所畏惧老鼠
不怕猫的老鼠。在科学家展示的照片中，一只褐色老鼠离一 只猫不到一英寸，在猫的身边嗅来嗅去。
研究人员确认并移除了老鼠大脑嗅球上的某些感受器，结果 这些老鼠变成了一群无所畏惧的啮齿动物，在天敌面前转来转去， 显示出极强的好奇心，永远不知道危险的存在。
31
6、体细胞核移植法
将外源基因导入到体细胞中，再将该细胞 进行培养，选择其中带有外源基因的细胞 进行扩增，用这种细胞的细胞核进行核移 植（把体细胞核植入一个去了核的卵母细 胞中，融合并激活），将重组胚进行体外 培养或者植入同步化的假孕动物的输卵管。
32
7.其它方法… …
性腺转基因方法
33
总结：转基因动物的制作方法
28
4.精子载体导入法
29
5 酵母人工染色体载体法（YAC） 利用酵母人工染色体(ＹＡＣ)作为载体制作转基因动物的方法。 酵母人工染色体（ＹＡＣ）载体是近年来发展起来的新型载体, 能克隆百万对碱基的大片段ＤＮＡ。
30
优点：
保证大片段ＤＮＡ的完整性 。 保证较长外源片段在转基因动物研究中的整合率提 高。 保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整性 , 因而 可以消除或减弱基因整合后的位置效应。
9
2003年7月11日由陈系古教授领导的“人类转基因动物模 型的制作”课题组历时5年，研制成功了四种转基因小鼠。其 中，荧光鼠为胚胎干细胞、人类基因功能、人体组织工程和 克隆器官等研究提供了基础；患白化病的小鼠转导了酪氨酸 酶基因后长出了黑毛；四环素调控系统和丙肝核心抗原的转 基因小鼠分别传到第四、第三代，为制备人类丙肝病毒感 染的双基因动物模型提供了父代、母代。
36
基因敲除（gene knock out），指外源DNA与受体细胞基因 组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体 细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的 基因组中,而获得的内源目的基因缺失或功能丧失的转基因 动物。
37
基因替换（gene knock in），指外源DNA与受体基因组中 特定的内源基因发生同源重组而相关的两个内源基因中的 一个基因的编码区被另一个基因的编码区的拷贝所置换的 基因动物。
转基因小鼠模型
历史
1974, Jaenisch等人,整合SV40基因的小鼠 1980, Gordon 等人,育成人胸苷激酶的转基因小鼠 1982, Palmiter等人, 转大鼠生长激素（GH）基因
的小鼠
1
转GH基因超级小鼠
2
转基因兔、牛、猪、羊、 鱼、小鼠… …
3
6
2.蜘蛛羊
7
3.超级老鼠
1、受精卵雄原核显微注射法 2、胚胎干细胞（ES细胞）法 3、逆转录病毒感染法 4、精子载体法 5、 YAC法 6、体细胞核移植法
34
二、培育转基因动物的方法
显微注射法 病毒介导的生物学方法 胚胎干细胞法 精子载体法 酵母人工染色体载体法 其它 基因打靶
35
基因打靶 利用细胞脱氧核糖核酸(DNA)可与外源性 DNA同源序列发生同源重组的性质，定向改 造生物某一基因的技术。 1、基因敲除（gene knock out） 2、基因替换（gene knock in）
38
基因打靶 1. 基因敲除（gene knock out）将基因组特定内源基因定点突变 2. 基因替换（ gene knock in）将基因组特定内源基因进行定向重组
39
二、培育转基因动物的方法
显微注射法 病毒介导的生物学方法 胚胎干细胞法 精子载体法 酵母人工染色体载体法 其它 基因打靶
24
3.胚胎干细胞方法
25
优点： 外源基因整合情况的可控性高。 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平 及插入的稳定性。 外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定 及筛选方便。
26
缺点：
ES细胞系建立及培养困难 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体
27
Leabharlann Baidu
目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用 比较成熟，在大动物上应用较晚。
受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵子的损害 宿主范围广 可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高
23
缺点： 容纳大小有限(<10-15kb) 重组逆转录病毒的长末端容易甲基化，影响外
源基因的表达 潜在致癌性,载体复杂 整合率不高,胚胎自我保护机制对其有抗性
3. 对经济大动物，由于需要大量的供体和受体，耗时 长、费用昂贵，受到很大的限制。
21
2、逆转录病毒感染法
将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成 高滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎 （也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单 层培养细胞共同培养以达到感染目的), 获得 转基因动物的方法。
22
优点：
15
目的基因的来源
1. 采用限制性内切酶，从生物组织中获取目的基因； 2. 通过mRNA合成cDNA； 3. 人工合成的DNA片段； 4. 目的基因的克隆。
16
二、培育转基因动物的方法
显微注射法 病毒介导的生物学方法 胚胎干细胞法 精子载体法 酵母人工染色体载体法 其它
17
1. 显微注射转基因技术
利用显微操作技术转移外 源基因的方法。此法转入 基因长度可达数百kb；并 能随机地整合在受体体细 胞染色体DNA上，因此应 用范围广。
18
microinjection
19
受精卵显微注射制备转基因动物的缺点
1. 外源基因整合至基因组的效率很低，对经济大动物 （猴、牛、羊）的整合效率更低；
2. 随机整合，转基因整合的位点和拷贝数无法控制， 造成转基因的表达差异很大，筛选高表达转基因 动物的工作量很大；
10
11
12
13
转基因动物模型优势：
可以从整体水平、器官水平、组织水平、 分子水平进行多层次、全方位、深入而 又系统的综合研究。
14
一、转基因动物（transgenetic animal）
借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外 源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并 能稳定的移转给后代的动物称为转基因动物。
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量乳酸。
4.无所畏惧老鼠
不怕猫的老鼠。在科学家展示的照片中，一只褐色老鼠离一 只猫不到一英寸，在猫的身边嗅来嗅去。
研究人员确认并移除了老鼠大脑嗅球上的某些感受器，结果 这些老鼠变成了一群无所畏惧的啮齿动物，在天敌面前转来转去， 显示出极强的好奇心，永远不知道危险的存在。
31
6、体细胞核移植法
将外源基因导入到体细胞中，再将该细胞 进行培养，选择其中带有外源基因的细胞 进行扩增，用这种细胞的细胞核进行核移 植（把体细胞核植入一个去了核的卵母细 胞中，融合并激活），将重组胚进行体外 培养或者植入同步化的假孕动物的输卵管。
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7.其它方法… …
性腺转基因方法
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总结：转基因动物的制作方法
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4.精子载体导入法
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5 酵母人工染色体载体法（YAC） 利用酵母人工染色体(ＹＡＣ)作为载体制作转基因动物的方法。 酵母人工染色体（ＹＡＣ）载体是近年来发展起来的新型载体, 能克隆百万对碱基的大片段ＤＮＡ。
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优点：
保证大片段ＤＮＡ的完整性 。 保证较长外源片段在转基因动物研究中的整合率提 高。 保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整性 , 因而 可以消除或减弱基因整合后的位置效应。
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2003年7月11日由陈系古教授领导的“人类转基因动物模 型的制作”课题组历时5年，研制成功了四种转基因小鼠。其 中，荧光鼠为胚胎干细胞、人类基因功能、人体组织工程和 克隆器官等研究提供了基础；患白化病的小鼠转导了酪氨酸 酶基因后长出了黑毛；四环素调控系统和丙肝核心抗原的转 基因小鼠分别传到第四、第三代，为制备人类丙肝病毒感 染的双基因动物模型提供了父代、母代。
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基因敲除（gene knock out），指外源DNA与受体细胞基因 组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体 细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的 基因组中,而获得的内源目的基因缺失或功能丧失的转基因 动物。
37
基因替换（gene knock in），指外源DNA与受体基因组中 特定的内源基因发生同源重组而相关的两个内源基因中的 一个基因的编码区被另一个基因的编码区的拷贝所置换的 基因动物。
转基因小鼠模型
历史
1974, Jaenisch等人,整合SV40基因的小鼠 1980, Gordon 等人,育成人胸苷激酶的转基因小鼠 1982, Palmiter等人, 转大鼠生长激素（GH）基因
的小鼠
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转GH基因超级小鼠
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转基因兔、牛、猪、羊、 鱼、小鼠… …
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2.蜘蛛羊
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3.超级老鼠
1、受精卵雄原核显微注射法 2、胚胎干细胞（ES细胞）法 3、逆转录病毒感染法 4、精子载体法 5、 YAC法 6、体细胞核移植法
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二、培育转基因动物的方法
显微注射法 病毒介导的生物学方法 胚胎干细胞法 精子载体法 酵母人工染色体载体法 其它 基因打靶
35
基因打靶 利用细胞脱氧核糖核酸(DNA)可与外源性 DNA同源序列发生同源重组的性质，定向改 造生物某一基因的技术。 1、基因敲除（gene knock out） 2、基因替换（gene knock in）
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基因打靶 1. 基因敲除（gene knock out）将基因组特定内源基因定点突变 2. 基因替换（ gene knock in）将基因组特定内源基因进行定向重组
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二、培育转基因动物的方法
显微注射法 病毒介导的生物学方法 胚胎干细胞法 精子载体法 酵母人工染色体载体法 其它 基因打靶
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3.胚胎干细胞方法
25
优点： 外源基因整合情况的可控性高。 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平 及插入的稳定性。 外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定 及筛选方便。
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缺点：
ES细胞系建立及培养困难 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体
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Leabharlann Baidu
目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用 比较成熟，在大动物上应用较晚。
受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵子的损害 宿主范围广 可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高
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缺点： 容纳大小有限(<10-15kb) 重组逆转录病毒的长末端容易甲基化，影响外
源基因的表达 潜在致癌性,载体复杂 整合率不高,胚胎自我保护机制对其有抗性
3. 对经济大动物，由于需要大量的供体和受体，耗时 长、费用昂贵，受到很大的限制。
21
2、逆转录病毒感染法
将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成 高滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎 （也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单 层培养细胞共同培养以达到感染目的), 获得 转基因动物的方法。
22
优点：
15
目的基因的来源
1. 采用限制性内切酶，从生物组织中获取目的基因； 2. 通过mRNA合成cDNA； 3. 人工合成的DNA片段； 4. 目的基因的克隆。
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二、培育转基因动物的方法
显微注射法 病毒介导的生物学方法 胚胎干细胞法 精子载体法 酵母人工染色体载体法 其它
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1. 显微注射转基因技术
利用显微操作技术转移外 源基因的方法。此法转入 基因长度可达数百kb；并 能随机地整合在受体体细 胞染色体DNA上，因此应 用范围广。
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microinjection
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受精卵显微注射制备转基因动物的缺点
1. 外源基因整合至基因组的效率很低，对经济大动物 （猴、牛、羊）的整合效率更低；
2. 随机整合，转基因整合的位点和拷贝数无法控制， 造成转基因的表达差异很大，筛选高表达转基因 动物的工作量很大；
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转基因动物模型优势：
可以从整体水平、器官水平、组织水平、 分子水平进行多层次、全方位、深入而 又系统的综合研究。
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一、转基因动物（transgenetic animal）
借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外 源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并 能稳定的移转给后代的动物称为转基因动物。