化学发光免疫分析方法
血检四项化学发光法调查
血检四项化学发光法调查目前血检四项（HBsAg、HCV、HIV、TP）的检测方法主要有酶联免疫（ELISA）、核酸扩增（PCR）、胶体金标记、以及化学发光（CLIA）。
现就CLIA在血检项目中的应用情况做一调查分析。
一．化学发光免疫分析法简介。
化学发光免疫分析法(Chemiluminescence imnunoassay，CLIA)是建立在放射免疫分析技术(radioimmunoassay，RIA)理论的基础上，以标记发光剂为示踪物信号建立起来的一种非放射标记免疫分析法。
CLIA是利用化学反应中释放大量自由能，产生激发态中间体，当其回到稳定的基态时发射出光子（hν），用发光信号测量仪对所发出的光量子进行定量测量。
鲁米诺(1umino1)、异鲁米诺(isolumino1)及其衍生物、吖啶酯(acIidinim ester)衍生物、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是目前CLIA中使用最多的四类标记物。
表1 化学发光法类型注：* 严格意义上属于荧光免疫。
二．国内外化学发光法的仪器和试剂情况。
国外化学发光法检测仪器的生产厂家以贝克曼、雅培、罗氏、拜耳这四家的市场占有率较高。
其中罗氏拥有唯一的电化学发光技术，雅培则独占微粒子酶联免疫（EMIA）。
不同厂家的仪器有各自的优势检测项目，主流的仪器型号如下：表2 国外主要化学发光免疫分析仪厂家国内也逐渐有厂家研制化学发光试剂，配合国外引进的仪器（多为半自动）共同销售，也有自发研制的化学发光仪（泰格科信）。
针对血检四项（HBsAg、HCV、HIV、TP），除北京科美生物（科美东雅）外，所有厂家试剂均只有HBsAg试剂。
表3 国内主要厂家仪器和试剂情况国外厂家的试剂大多随仪器配送，并没有在SFDA单独注册。
目前SFDA注册的血检四项化学发光法试剂列表如下。
就检测项目来看，除梅毒外，其余三项均可使用化学发光法；就现有资料，国内外只有北京科美东雅配有梅毒检测试剂。
荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法荧光和化学发光免疫分析方法是一种常用的生物分析技术，广泛应用于生命科学研究、临床诊断和药物研发等领域。
本文将详细介绍荧光和化学发光免疫分析方法的原理、应用以及优缺点等方面。
首先，荧光免疫分析方法利用标记有荧光物质的抗体或抗原与待检测物相互作用，通过检测荧光信号来定量分析目标物。
其原理是当荧光标记物被激发后，会发射出特定波长的荧光信号，利用荧光光谱仪测量荧光强度来确定目标物的浓度。
荧光免疫分析方法具有高灵敏度、高选择性和多样性的优点，可用于检测蛋白质、核酸、细胞等生物分子。
化学发光免疫分析方法则是利用特定的化学反应产生荧光信号来检测目标物。
常用的化学发光免疫分析方法有酶免疫分析和化学发光免疫分析。
在酶免疫分析中，酶标记的抗体或抗原与待检测物相互作用后，加入底物，酶催化底物发生化学反应产生荧光信号。
而化学发光免疫分析则是通过特定的化学反应产生激发态分子，激发态分子发生无辐射跃迁产生荧光信号。
化学发光免疫分析方法具有高灵敏度、快速、稳定性好的特点，常用于临床诊断和药物研发等领域。
荧光和化学发光免疫分析方法在生命科学研究中有广泛的应用。
例如，在蛋白质研究中，可以利用荧光免疫分析方法检测蛋白质的表达水平、相互作用以及酶活性等。
在细胞研究中，荧光免疫分析方法可以用于检测细胞的分子分布、内源性蛋白质的表达和细胞信号传导等。
此外，荧光和化学发光免疫分析方法还可以用于检测病原体、药物残留和环境污染物等。
荧光和化学发光免疫分析方法具有许多优点。
首先，这些方法具有高灵敏度，可以检测到非常低浓度的目标物。
其次，这些方法具有高选择性，能够在复杂的样品中准确地检测目标物。
此外，荧光和化学发光免疫分析方法还可以实现高通量分析，节省时间和成本。
然而，荧光和化学发光免疫分析方法也存在一些缺点。
首先，荧光信号受到背景干扰的影响，可能导致误差的产生。
其次，荧光标记物的稳定性较差，容易受到光照和温度等因素的影响。
化学发光免疫分析技术
Φ CL = 发光的分子数/ 参加反应的分子数
(4)
2.3 化学发光免疫分析的原理
化学发光免疫分析法是化学发光和免疫分析结合的产物。 它同时具有化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的高选择 性。化学发光免疫分析是用化学发光反应的试剂标记抗原 或抗体, 标记后的抗原和抗体与待测物经过一系列的免疫 反应和理化步骤,最后以测定发光强度形式测定待测物的含 量。
此外，化学发光成像技术、化学发光免疫分析与分离 技术的联用，可以使免疫分析的选择性、灵敏度和检测速 度、检测通量得到进一步提高。为了更好地适应临床、环 境等领域的实际应用，需要大力发展微型化、集成化和自 动化的化学发光免疫分析仪器。随着分子生物学及纳米与 传感技术的进步，新的化学发光免疫分析原理与高灵敏的 免疫分析方法将得到不断发展，开发催化活性更高、稳定 性更好、发光动力学曲线更符合免疫分析的酶和底物并推 广到临床检测，发展新型标记技术用于信号放大，建立化 学发光免疫分析新方法，都将是未来的发展方向及研究重 点。
定性检测。
化学发光免疫测定是目前世界公认先进的标记免疫测定技 术，化学发光免疫分析技术具有高度的准确性和特异性， 成为检验方法中最为重要的技术之一。化学发光免疫分析 技术作为疾病诊断的主要手段已被广泛用于机体免疫功能 、传染性疾病、内分泌功能、肿瘤标志物、性激素、甲状 腺功能等方面的体外诊断实验中。
㈠ 辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析 该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标 记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标 本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包 被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体复合 物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发 光增强剂使产生化学发光。
辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图
血检四项化学发光法调查
血检四项化学发光法调查目前血检四项（HBsAg、HCV、HIV、TP）的检测方法主要有酶联免疫（ELISA）、核酸扩增（PCR）、胶体金标记、以及化学发光（CLIA）。
现就CLIA在血检项目中的应用情况做一调查分析。
一．化学发光免疫分析法简介。
化学发光免疫分析法(Chemiluminescence imnunoassay，CLIA)是建立在放射免疫分析技术(radioimmunoassay，RIA)理论的基础上，以标记发光剂为示踪物信号建立起来的一种非放射标记免疫分析法。
CLIA是利用化学反应中释放大量自由能，产生激发态中间体，当其回到稳定的基态时发射出光子（hν），用发光信号测量仪对所发出的光量子进行定量测量。
鲁米诺(1umino1)、异鲁米诺(isolumino1)及其衍生物、吖啶酯(acIidinim ester)衍生物、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是目前CLIA中使用最多的四类标记物。
表1 化学发光法类型注：* 严格意义上属于荧光免疫。
二．国内外化学发光法的仪器和试剂情况。
国外化学发光法检测仪器的生产厂家以贝克曼、雅培、罗氏、拜耳这四家的市场占有率较高。
其中罗氏拥有唯一的电化学发光技术，雅培则独占微粒子酶联免疫（EMIA）。
不同厂家的仪器有各自的优势检测项目，主流的仪器型号如下：表2 国外主要化学发光免疫分析仪厂家国内也逐渐有厂家研制化学发光试剂，配合国外引进的仪器（多为半自动）共同销售，也有自发研制的化学发光仪（泰格科信）。
针对血检四项（HBsAg、HCV、HIV、TP），除北京科美生物（科美东雅）外，所有厂家试剂均只有HBsAg试剂。
表3 国内主要厂家仪器和试剂情况国外厂家的试剂大多随仪器配送，并没有在SFDA单独注册。
目前SFDA注册的血检四项化学发光法试剂列表如下。
就检测项目来看，除梅毒外，其余三项均可使用化学发光法；就现有资料，国内外只有北京科美东雅配有梅毒检测试剂。
化学发光免疫分析
化学发光免疫分析化学发光免疫分析，也称为化学发光法或发光免疫测定法，是一种高灵敏度和高特异性的生物分析技术。
它结合了免疫学、生物学和化学的原理，利用特异性抗体与其抗原（或其他生物分子）相互作用，通过化学反应使其辐射出光信号，从而定量地检测目标物质的存在和含量。
一、化学发光免疫分析原理化学发光免疫分析原理基于化学发光原理和免疫学原理。
化学发光原理就是将化学反应的能量通过光子的辐射转换为光的能量。
免疫学原理是利用特异性免疫反应来识别和区分不同的抗原或抗体。
化学发光免疫分析技术的基本步骤如下：1.选择特异性的抗体与目标物质的结合；2.引入辐射源激活化学发光前体（例如，过氧化物或二氧化硫酞）；3.目标物质与抗体发生结合后，释放了辐射源激活前体，使其进一步分解并产生化学发光；4.测定样品中的荧光强度，用于定量分析目标物质的存在和含量。
化学发光免疫分析发出的荧光信号对于抗原-抗体的结合非常敏感和特异。
比较常见的荧光标记物包括酶（如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、荧光染料（如荧光素和荧光素衍生物）、金纳米粒子等。
二、化学发光免疫分析的应用化学发光免疫分析的应用涉及生物分子、环境污染、中药等领域。
下面将从这些不同应用领域来介绍化学发光免疫分析技术的具体应用。
1.生物分子分析生物分子分析是化学发光免疫分析技术的主要应用领域之一。
常见的生物分子包括蛋白质、核酸、糖等。
如免疫荧光分析技术可以快速、准确地分析细胞表面分子、内部生物分子和变态反应特异性IgE。
同时，化学发光免疫分析技术可以用于患者体液中的特定免疫球蛋白或蛋白质的定量检测。
2.环境污染分析环境污染分析是化学发光免疫分析技术的另一个主要应用领域。
通过测量土壤、水、空气等样品中的污染物含量，可以快速精准地确定其存在和含量。
化学发光免疫分析技术可用于检测重金属、有机污染物、致癌物等。
该技术不仅检测灵敏，而且简便易行。
3.中药分析中药分析中常用的技术包括高效液相色谱法、气相色谱法、电化学法等。
化学发光免疫分析方法
化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。
其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析。
化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。
化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。
免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。
化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。
待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的。
一、化学发光免疫分析方法的类别化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为 3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。
（一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。
目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。
1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。
鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。
在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。
因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。
酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。
鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。
鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。
2. 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析吖啶酯用于化学发光免疫分析方法（ChemiluminescentImmunoassay，CLIA）由于热稳定性不是很好，Klee 等研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。
荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应，应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。
由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。
本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。
一、免疫免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。
免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。
特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。
而对变异或其他抗原毫无作用。
1、抗原1.1抗原的定义抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答（免疫原性），并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质（免疫反应性）。
抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。
1.2抗原的分类完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。
半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。
如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性，1.3抗原的性质决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。
抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。
因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。
2、抗体2.1抗体的定义抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。
2.2抗体的结构抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。
免疫化学发光法
免疫化学发光法免疫化学发光法是一种具有高灵敏度、高特异性的免疫分析方法，在生物医学领域得到了广泛应用。
下面是关于免疫化学发光法的各个方面的介绍。
1.直接法直接法是一种简单的免疫化学发光技术，通过将特异性抗体与发光标记物直接结合，形成免疫复合物，然后测定复合物发出的光强度，从而实现对目标分子的定量检测。
直接法的应用范围广泛，如肿瘤标志物、病毒和细菌等微生物的检测。
使用直接法时需要注意保证抗体的特异性，以及避免非特异性结合的影响。
2.间接法间接法是通过将特异性抗体与酶或化学发光物质结合，形成酶或化学发光标记的抗体，然后将该抗体与目标分子反应，形成免疫复合物，最后加入相应的底物或激发剂，根据发光强度实现对目标分子的定量检测。
间接法的灵敏度较高，适用于多种生物分子的检测。
需要注意的是，要确保抗体的特异性以及发光标记物的稳定性。
3.竞争法竞争法是一种免疫化学发光技术，通过将特异性抗体与目标分子和发光标记的竞争性抗体结合，形成免疫复合物，然后测定复合物发出的光强度，实现对目标分子的定量检测。
竞争法的应用范围包括激素、病毒和肿瘤标志物等生物分子的检测。
使用竞争法时需要注意保证竞争性抗体的特异性，以及避免非特异性结合的影响。
4.夹心法夹心法是一种免疫化学发光技术，通过将特异性抗体与目标分子和发光标记的抗体分别结合，形成夹心状的免疫复合物，然后测定复合物发出的光强度，实现对目标分子的定量检测。
夹心法的灵敏度较高，适用于多种生物分子的检测。
需要注意的是，要确保抗体的特异性和发光标记物的稳定性。
5.斑点免疫法斑点免疫法是一种将特异性抗体或抗原点状固定在支持物上的免疫分析方法。
在斑点免疫法中，待测样品中的目标分子与已固定的抗体或抗原相互作用，形成免疫复合物，然后加入发光标记物，形成点状发光。
通过测量发光强度，实现对目标分子的定量检测。
斑点免疫法的优点是灵敏度高、特异性强、操作简便，适用于多种生物分子的检测。
需要注意的是，要确保固定化抗体或抗原的特异性和稳定性。
荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法荧光和化学发光免疫分析方法是现代生物医学研究和临床诊断中常用的分析方法。
这两种方法在原理和应用中有一些差异，但都具有高灵敏度、高选择性和高自动化程度的特点。
以下将详细介绍荧光和化学发光免疫分析方法的原理、应用和优缺点。
荧光免疫分析方法是基于荧光分子的发射特性进行分析的一种方法。
其原理是，通过标记抗体或抗原的荧光物质，使其具有荧光，并与待测物发生特异性的免疫反应。
然后，通过荧光测定仪器对免疫反应产生的荧光进行检测和分析。
荧光免疫法具有高灵敏度、高选择性、多样化的荧光标记物选择以及可通过多色荧光分析多个指标等特点。
因此在生物医学研究、肿瘤标志物筛查、病毒感染和免疫补体等方面具有广泛的应用。
荧光免疫分析方法主要分为直接荧光免疫分析和间接荧光免疫分析。
直接荧光免疫分析通过将荧光标记物直接结合到抗体或抗原上，实现荧光信号的检测和分析。
间接荧光免疫分析则是先将抗体与细胞或蛋白质结合，然后再用荧光标记的二级抗体结合到一级抗体上，以增强荧光信号。
这两种方法各有优缺点，可以根据具体需要选择使用。
化学发光免疫分析方法是基于化学发光反应进行分析的一种方法。
其原理是，在特定的化学反应条件下，荧光标记的抗体或抗原与待测物发生免疫反应，产生化学发光信号。
然后通过化学发光仪器对化学发光信号进行检测和分析。
化学发光免疫方法具有高灵敏度、快速、特异性高、背景干扰低等优点，因此在临床诊断和分子生物学研究中得到广泛应用。
化学发光免疫分析方法主要分为催化化学发光和基因工程发光两种类型。
催化化学发光是通过特定的酶促发光底物，在酶的作用下产生化学发光信号。
催化化学发光免疫分析方法常用于免疫分析和临床诊断。
基因工程发光则是通过将荧光基因植入生物体内，利用生物体自身的酶促发光反应产生化学发光信号。
基因工程发光免疫分析方法主要用于分子生物学研究领域。
荧光和化学发光免疫分析方法在临床诊断和生物医学研究中具有广泛的应用。
它们可以用于检测血液中的肿瘤标志物、感染性疾病的病原体抗原和抗体、免疫系统功能等指标。
化学发光免疫分析方法的种类
【化学发光免疫分析种类】
1.直接化学发光
A 吖啶酯发光
原理：纳米磁珠分离后的吖啶酯标记的抗原抗体复合物，在含H2O2的强酸、强碱激发底物的作用下，快速发出可见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强度RLU与待测抗原浓度成函数关系。
特点：发光过程在5秒内完成，激发发光程序简单，测试速度快，但发光标记物吖啶酯在缓冲液中不稳定，易水解，影响试剂稳定性。
代表仪器：拜耳公司的ACS180。
【化学发光免疫分析种类】
B 异鲁米诺发光
原理：发光过程和原理与吖啶酯完全相同，但激发发光速度更快，在3秒内完成整个过程，测试速度最快，而且克服了吖啶酯在缓冲液不稳定、易水解的缺点。
代表仪器：德国Byk–Sangtec公司的LIAISON
C 电化学发光
原理：纳米磁珠分离后的三联吡啶钌标记的抗原抗体复合物，在三丙胺的作用下，发生氧化还原反应，发出可见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强度RLU与待测抗原浓度成函数关系。
特点：激发发光过程复杂，时间长，每一个发光过程约需25秒，测试速度慢。
代表仪器：瑞士ROCHE公司的ELECSYS 1010和ELECSYS 2010。
【化学发光免疫分析种类】
•2、酶促化学发光或持久发光
•原理：酶促化学发光一般是将碱性磷酸酶标记在抗体或抗原上，纳米磁珠分离后的碱酶标
记的抗原、抗体复合物在发光底物AMPPD作用下，持续发出可见光，通过光电倍增管读取光信号。
•特点：激发发光时间长，测试速度慢，因为酶易受环境温度的影响，试剂的稳定性不如直接化学发光好。
•代表仪器：美国贝克曼公司的ACCESS，雅培公司的AXSYM。
化学发光免疫分析技术
化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术（Chemiluminescence Immunoassay，简称CLIA）是一种用于检测物质浓度的生化分析技术。
该技术利用免疫反应，在荧光底物的作用下产生可见光发射，从而实现对物质的检测和定量分析。
化学发光免疫分析技术的基本原理是将待测物与对应的抗原或抗体结合，形成免疫复合物。
然后，将荧光标记的抗体或抗原加入到体系中，与免疫复合物结合。
接下来，加入荧光底物，在适当的条件下，底物被激活，产生化学反应，释放出能量，从而形成荧光。
荧光信号可以通过荧光仪进行检测和定量分析。
荧光仪通过光电倍增管等装置将荧光信号转化为电信号，经过控制和处理，最终得到物质的浓度。
化学发光免疫分析技术的优势在于其灵敏度高。
由于发光底物的特殊性质，即使在低浓度下，也能产生明显的发光信号。
此外，化学发光免疫分析技术的特异性强，能够准确识别目标物质，避免误判。
另外，与其他传统的免疫分析方法相比，化学发光免疫分析技术反应速度快，可以在较短的时间内得到结果。
此外，操作简单，无需复杂的设备和技术，具有很高的实用性。
化学发光免疫分析技术在医学诊断中有着广泛的应用。
比如，可以用于检测血清中肿瘤标志物的浓度，从而实现早期诊断和预测疾病进展的风险。
此外，化学发光免疫分析技术还可以应用于感染性疾病的快速诊断，如艾滋病、结核病等。
此外，化学发光免疫分析技术还被广泛应用于生物制药工业中的药物分析。
在食品安全领域，也可以利用化学发光免疫分析技术检测食品中的有害物质，从而保障食品的质量安全。
总之，化学发光免疫分析技术是一种灵敏、特异、操作简单的生化分析技术。
在医学诊断、药物检测、食品安全检测等领域有着广泛的应用前景。
随着技术的不断发展和创新，化学发光免疫分析技术将进一步完善，并在更多的领域发挥重要的作用。
化学发光免疫分析法-自己整理
化学发光免疫分析法（CLIA）A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法：（竞争法：用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体，待检抗原与检测信号成反比）、原理：本实验采用竞争法，酶标抗原与标准品抗原竞争抗体，标准品抗原浓度越大，结合到抗体上的酶标抗原越少，RLU越小，B/B o值越小。
例：A为一种抗原小分子，有免疫反应性。
实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析，使待测A、辣根过氧化物酶标记的A（A-HRP在均相体系中与异硫氰酸荧光素（FITQ标记的兔抗A抗体（FITC-A抗体）发生竞争性免疫反应，再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒，反应生成物结合在磁微粒上，在磁场经分离、洗涤后加发光底物，用冷光分析仪检测发光强度（RLU，测定尿液中A的含量、仪器:Flash ' n glow LB955管全自动进样冷光分析仪（Berthold公司）; 高速离心机（Beckman公司）,转速13000 r/min磁性分离器（北京科美生物技术有限公司定制，磁场强度2800高斯） XW80旋涡混合器（上海精科实业有限公司）试管12 X 60 mm®江拱东医用塑料厂）磁性微粒子（磁性分离剂,Adaltis公司）三、试剂1、A标准品2、A单克隆抗体•0——AFBi-BSA^HRP *：F!TC H AFB I +^4}抗FITCEFITC庐合別比FITCr^t I--r i詩玩FITC AFB1 FrrOAFBt^JMI 时fTC旳舸更片单丸垮序汗士体-F：障羊舍和料TJ5H笛箭♦—厲FR1 AF61^■ —FITC(- 歼ITC一餅3、A-BSA吉合物4、抗FITC抗体包被的磁性微粒子（5mg/mL）5、F ITC标记的A单克隆抗体6 HRP标记的A7、P BST 洗涤液L PBS,含% Tween-20）8、分析缓冲液mol/L的PBS缓冲溶液,pH ,含%BSA %的水解明胶、％的Procli n-300）9、发光底物液（鲁米诺、过氧化氢和对碘苯酚溶液）实验用水为二次蒸馏水四、试剂处理1、用分析缓冲液为稀释液，梯度稀释标准品；2、取A-BSA-HR溶液，以分析缓冲液为稀释液，梯度稀释,配制1:1000、1:2000、1:5000的A-BSA-HRP溶液,4 C保存.FITC-A单克隆抗体溶液的配制：取FITC-A 单克隆抗体溶液，以分析缓冲液为稀释液，梯度稀释，配制1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12000的FITC-A单克隆抗体溶液，4 C保存。
电化学发光免疫分析法 ppt课件
免疫分析法 发光和化学发光 化学发光免疫分析法 电化学发光
电化学发光免疫分析法
化学发光免疫分析
chemiluminescence immunoassay（ CLIA）
CLIA是将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一 种新的免疫分析技术。
这种方法兼有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的 高度特异性。
化学发光分析优点
化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发光，就避免 了荧光分析中激发光杂散光的影响有很高的灵敏度， 并且不象放射分析那样存在强烈的环境污染和健康危害， 是一种非常优秀的定量分析方法。
化学发光分析缺点
虽然化学发光具备很高的特异性和很小的干扰，但 化学分析本身的不特异性，制约了整个方法的使用。
3 2+
三联吡啶钌（ [Ru(bpy)3]2+ ）特 点 ] 衍生物与免疫球蛋白结合的分子比超过20仍 [Ru(bpy)
3 2+
不会影响抗体的可溶性和免疫活性；
[Ru(bpy)3]2+分子量小，空间位阻小 ，即便小分子的核酸 也能标记，使检测的菜单大大丰富，更重要的是为其检测 菜单的开发前景提供了广阔空间。
化学发光免疫分析（ CLIA）分类
按分离方法不同分
微粒子化学发光免疫测定 磁颗粒化学发光免疫测定
化学发光免疫分析（ CLIA）分类
按发光剂不同分为
发光酶免疫测定（chemiluminescence enzyme immunoasssay， CLEIA ） 化学发光免疫测定技术 （chemiluminescence immunoassay， CLIA ）
电致化学发光（ECL)
化学发光免疫分析法
化学发光免疫分析法
化学发光免疫分析法（Chemiluminescent Immunoassay，CLIA）是一种用于高
灵敏性和特异性检测抗原和抗体的分析方法。
它可以用于测定血清中和其他生物样品中的多种抗原和抗体，包括肿瘤抗原、抗生素和其他药物物质，也可用于研究免疫应答机制，因此在生物分析、临床诊断和科学研究中受到普遍的应用。
该分析法的原理是利用酶或其他生物分子介导的亲和免疫反应，一种特定的抗
原或抗体与抗原或抗体受体上的一种指定的抗体结合后，再加上一种特定的子细胞质因子，这种反应会产生化学发光。
由于这种反应发生的时间很短，后续过程不容易受到干扰，并且其发光参量也比一般的发光反应更高，因此检测结果具有高灵敏性和特异性。
CLIA结果的准确性和可靠性在生物分析的领域得到了认可，其快速、实用性、特异性和准确性为生物技术提供了更有力的保证。
它不仅普遍用于临床诊断，还可用于研究生物的抗原和抗体的交互作用，有助于更好地研究免疫应答机制和其他相关科学问题。
化学发光免疫分析
化学发光免疫分析（Chemiluminescent Immunoassay，CLIA）介绍化学发光免疫分析（CLIA）是一种测定抗原和抗体的实验方法，它是一种特殊的免疫分析，可以用来测定血清中的抗原和抗体的含量。
CLIA的原理是利用抗原和抗体之间的特异性结合，将抗原和抗体结合在一起，然后将特异性结合物添加到一种特殊的化学发光物质中，当发生反应时，特异性结合物会产生发光，并且发光的强度与抗原和抗体的含量成正比。
因此，可以根据发光的强度来测定血清中的抗原和抗体的含量。
优势CLIA的优势在于它有很高的灵敏度和特异性，可以测定血清中抗原和抗体的含量，而且结果准确可靠，可以用于诊断疾病，比如癌症、HIV感染、肝炎等疾病。
此外，CLIA的操作简单，可以在实验室中快速完成，而且它还可以用于大量样本的检测，从而节省时间和成本。
应用CLIA可以用于多种疾病的诊断，比如甲状腺机能减退症（Hypothyroidism）、甲状腺功能亢进症（Hyperthyroidism）、慢性肝病（Chronic Liver Disease）、肝炎病毒感染（Hepatitis Virus Infection）、癌症（Cancer）、HIV感染（HIV Infection）等。
此外，CLIA还可以用于检测抗生素，如青霉素、氨苄西林、头孢菌素等，以及肝素、血清素等药物的含量。
结论CLIA是一种灵敏度和特异性很高的免疫分析方法，可以用来测定血清中抗原和抗体的含量，而且可以用于多种疾病的诊断，比如癌症、HIV感染、肝炎等疾病。
此外，CLIA的操作简单，可以在实验室中快速完成，可以用于大量样本的检测，从而节省时间和成本。
因此，CLIA可以作为一种有效的免疫分析方法，为疾病的诊断提供重要的帮助。
化学发光免疫分析方法.
为85.5％。Magliulo 等［20］建立了牛奶中黄曲霉毒素M1的化学发光酶
免疫分析方法，通过将黄曲霉毒素M牛血清白蛋白包被在聚丙烯板上，
通过酶标二抗在含有鲁米诺的基板上进行检测。该方法的最低检测限为
1 pg/mL，且板间板内数据的变异系数均低于9％，回收率在96％～
122％之间。 Lin 等［21］建立了农产品中黄曲霉毒素B1 的化学发光免 疫分析方法。该方法线性检测范围在0.05～10 ng/g 之间 ，检测灵敏度 为0.01 ng/g，板间及板内变异系数分别为12.2％及 10.0％。 农产品中样 品添加回收率在79.8％～115.4％之间。 同时， 将建立的分析方法与黄 曲霉毒素商品化酶联免疫试剂盒进行了相关性试验，相关系数为
菌素B1 的 ELISA 方法相比，其方法灵敏度提高了10 倍。 且通过样品的
添加回收率试验表明其有良好的回收率，其分析结果与ELISA 分析方法
与 HPLC 方法有良好的相关性。
Yang等［17］建立了食品中葡萄球菌肠毒素B（SEB）的碳纳米管的化
学发光免疫分析方法，通过将SEB 抗体吸附在碳纳米管表面 ， 然后将抗
方面报道还有Perschel 等［13］通过化学发光免疫分析对原发性醛固酮
过多症（PHA）进行快速筛选， Tudorache等［14］利用磁颗粒免疫支
持液膜方法（m-ISLMA）检测唾液中的孕酮含量，Iwata 等［15］利用双
夹心化学发光免疫分析方法测定血浆中内皮素－1的含量等。关于这方
面的应用，化学发光免疫分析方法应用的最为广泛，正是在医学检测方
种生物化学领域中最新的超灵敏的碱性磷酸酶底物，其特点是反应速度
快，在很短时间内提供正确可靠的结果。在它的分子结构中有两个重要
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化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。
其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析。
化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。
化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。
免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。
化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。
待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的。
一、化学发光免疫分析方法的类别化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为 3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。
（一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。
目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。
1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。
鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。
在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。
因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。
酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。
鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。
鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。
2. 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析吖啶酯用于化学发光免疫分析方法（ChemiluminescentImmunoassay，CLIA）由于热稳定性不是很好，Klee 等研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。
在含有H2O2的碱性条件下，吖啶酯类化合物能生成一个有张力的不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N－甲基吖啶酮，当其回到基态时发出一最大波长为430 nm 的光子。
吖啶酯类化合物量子产率很高，可达0.05。
吖啶酯作为标记物用于免疫分析，发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，且标记效率高，本底低。
吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于CLIA，通常采用HNO3+H2O2和NaOH 作为发光启动试剂，有些在发光启动试剂中加入Triton X－100，CTAC，Tween－20等表面活性剂以增强发光。
（二）化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（Chemiluminescent Enzyme Immunoassay,CLEIA）是以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。
目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），它们有各自的发光底物。
HRP 最常用发光底物是鲁米诺及其衍生物。
在CLEIA 中，使用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH和H2O2）作用下鲁米诺发光，酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强度。
此传统的化学发光体系（HRP－H2O2－lumi-nol）为几秒内瞬时闪光，存在发光强度低、不易测量等缺点。
后来，在发光系统中加入增强发光剂，以增强发光信号，并在较长时间内保持稳定，便于重复测量，从而提高分析灵敏度和准确性。
碱性磷酸酶（ALP）已广泛用于酶联免疫分析和核酸杂交分析。
碱性磷酸酶和1，2－二氧环己烷构成的发光体系是目前最重要、最灵敏的化学发光体系。
这类体系中具有代表性的是Bronstein 等提出的ALP－AMPPD 发光体系。
AMPPD 为1，2－二氧环己烷衍生物，它是一种生物化学领域中最新的超灵敏的碱性磷酸酶底物，其特点是反应速度快，在很短时间内提供正确可靠的结果。
在它的分子结构中有两个重要部分，一个是联接苯环和金刚烷的二氧四节环，它可以断裂并发射光子；另一个是磷酸根基团，它维持着整个分子结构的稳定。
（三）电化学发光免疫分析方法电化学发光是指由电化学反应引起的化学发光过程。
Leland［3］等已对三联吡啶钌体系的电化学发光机理进行了深入的研究。
电化学发光的反应在电极表面进行，发光底物为三联吡啶钌［Ru （ b p y）32+］，三丙胺（TPA）用来激发光反应。
在阳极表面，两种物质同时失去电子。
在电极板上Ru （bpy）32+被氧化成Ru （b p y）33+，TPA也被氧化成阳离子自由基（TPA+ *），TPA+ *自发地释放一个质子而变成非稳定分子（TPA*），将一个电子递给Ru （bpy）33+，形成激发态的Ru （bpy）32+*。
Ru （bpy）32+*在衰减的同时发射一个波长为620 nm 的光子，重新回到基态Ru （bpy）32+。
这一过程在电极表面反复进行，产生高效、稳定的连续发光，并不断增强。
二、化学发光免疫分析方法的应用自1977 年Halman 等创立化学发光免疫分析方法以来，免疫化学分析方法在医学检验、食品安全及环境科学方面的应用取得了很大的进展。
（一）医学检测肺结核病常以人体血清中CA125 含量为疾病标记物，上海交通大学Wang 等建立了CA125 的毛细管化学发光免疫分析方法，以实现对肺结核病的检测。
其方法的线性检测范围为2.5×10－11～1.0×10－9mol/L，检测限（S/N=3）为1.0×10－12mol/L，且标样的添加回收率为93％～109％。
甲胎蛋白（AFP）为肿瘤疾病标志物，Yang等利用链霉素化毛细管柱，建立了AFP 的化学发光免疫分析方法。
该方法的最低检测限为0.1ng/mL，线性检测范围为0.5～200 ng/mL。
研究结果表明该方法具有结构简单、更好的实用性及较宽的线性范围等优点。
Zhang等［7］利用磁性微粒子和包被小管建立了AFP 的化学发光酶免疫分析方法。
在该方法中，AFP抗体首先包被于两种不同的固相载体上，如磁性微粒子和包被小管。
再分别对这两种包被模式建立的化学发光免疫分析方法进行比较，通过再抗体包被浓度、标记于抗体上HRP 的稀释比例，分析所需时间，化学发光动力学等角度进行衡量，显示磁性微粒子具有较大的优势。
Zhan 等［8］建立了C 反应蛋白的电化学发光免疫分析方法。
首先用生物素标记含有Ru （bpy）32+的脂质体后与亲和素反应，再与生物素化的C 反应蛋白抗体结合得到抗体包被的脂质体，同时亲和素包被的磁性微粒子与生物素化的抗体反应，得到抗体包被的磁性微粒子。
两种抗体与C 反应蛋白结合，构成双亲和素桥联的、磁性微粒子为固相分离剂的反应模式。
通过溶解脂质体释放出Ru （bpy）32+测定其强度进行测定。
该方法的最低检测限为100ng/mL，检测范围为100ng/mL～10μg/mL。
Knight 等［9］采用化学发光免疫夹心分析方法对梅毒病毒进行检测，并与传统的分析方法快速血浆素反应（RPR）和酶免疫分析方法（ELISA）进行比较，通过对多种样品进行检测，并与RPR 及ELISA分析方法结果有99.1％的正确率。
茶碱是一种磷酸二酯酶（PDE）抑制剂，用于呼吸系统疾病的治疗。
Zhou等［10］建立了茶碱的化学发光免疫分析方法，该方法的最低检测限为0.51mg/L，线性范围为0.51～40mg/L，板内及板间变异系数分别为3.20％和3.57％。
通过与FPIA 结果对30 例茶碱浓度进行比较，其相关系数为0.993。
Peter 等［11］通过合成生物素睾酮标记物建立了睾酮的化学发光免疫分析方法，该方法的检测范围为0.2～20.0 nmol/L，最低检测限为0.125 nmol/L，板间方法的精密度为13％～16％，通过质谱仪器确证其方法的回收率为95％，显示了方法良好的灵敏度和准确率。
Mirasoli等［12］建立了唾液中皮质醇的固相竞争化学免疫分析方法。
通过人工重组的发光蛋白标记皮质醇而建立的免疫分析方法检测限为3nmol/L，线性检测范围为10～1 000 nmol/L。
其他关于这方面报道还有Perschel 等［13］通过化学发光免疫分析对原发性醛固酮过多症（PHA）进行快速筛选，Tudorache等［14］利用磁颗粒免疫支持液膜方法（m-ISLMA）检测唾液中的孕酮含量，Iwata 等［15］利用双夹心化学发光免疫分析方法测定血浆中内皮素－1的含量等。
关于这方面的应用，化学发光免疫分析方法应用的最为广泛，正是在医学检测方面大量成功的应用，带动了化学发光免疫分析方法在其他学科方面的普及。
（二）食品安全检测Quan 等［16］建立了食品中伏马菌素B1 的化学发光酶免疫分析方法，经方法优化后其线性检测范围为0.14～0.9μg/L，方法的灵敏度（IC50）为0.32 μg/L，方法的最低检测限（IC10）为0.09 μg/L，与伏马菌素B1 的ELISA 方法相比，其方法灵敏度提高了10 倍。
且通过样品的添加回收率试验表明其有良好的回收率，其分析结果与ELISA 分析方法与HPLC 方法有良好的相关性。
Yang等［17］建立了食品中葡萄球菌肠毒素B（SEB）的碳纳米管的化学发光免疫分析方法，通过将SEB 抗体吸附在碳纳米管表面，然后将抗体－碳纳米管固定在聚碳酸酯表面，再通过增强化学发光免疫法测定SEB 含量。
牛奶、苹果汁和婴儿食品中的SEB 最低检测限为0.01 ng/mL，而ELISA 的最低检测限为1 ng/mL。
Lin 等［18］人建立了食品中氯霉素的化学发光免疫分析方法，其方法灵敏度（0.05 ng/mL）、精密度、特异性及准确度等指标均与ELISA 分析方法类似。
10个样品的板内和板间变异系数分别小于8％和20％，且样品的添加回收率在87％～100％。
四川大学华西医学院杨秀岑等人［19］建立了食品中沙门氏菌的化学发光免疫分析方法。
该方法选用聚氯乙烯平片作为载体固定细菌，再与一抗及HRP 标记二抗温育，以化学发光免疫法测定食品中沙门氏菌。
利用该方法对62 份食品样品进行检测，以P/N≥3作为阳性标准，符合率为85.5％。
Magliulo 等［20］建立了牛奶中黄曲霉毒素M1的化学发光酶免疫分析方法，通过将黄曲霉毒素M牛血清白蛋白包被在聚丙烯板上，通过酶标二抗在含有鲁米诺的基板上进行检测。
该方法的最低检测限为1 pg/mL，且板间板内数据的变异系数均低于9％，回收率在96％～122％之间。