化学发光免疫分析法自己整理

合集下载

化学发光免疫测定

化学发光免疫测定

时间分辨荧光法 消除样品背景干扰的另一种方法是时间分辨荧 光法。样品背景的荧光寿命一般为10ns,而镧 系鳌合物的荧光寿命一般为10-100μs。且斯托 克斯位移较大,很适用于时间分辨法进行测定。
时间分辨荧光免疫原理图
(Time-resolved Fluorescence Immunoassay)
3 化学生物发光免疫分析法的特点 (1)优点: 高灵敏度 宽的线性范围 分析速度快 高选择性 高稳定性 花费少 所用试剂无毒 消除放射性同位素的污染。
(2)缺点: 实验结果的重复性方面存在一定问题 发光免疫测定是一种瞬时的化学反应 免疫反应中各种因素的干扰 氧化反应中各种因素的干扰 对催化反应原理有的还不十分清楚,对 实验的反应条件不易控制,干扰现象不 易估计和说明。
2. 发光标记物 (1)发光反应中消耗掉的标记物 a.Luminol及其衍生物 Luminol偶联于配体后,其发光效率较低 Isoluminol及其衍生物被广泛应用 Luminol的氨基取代导致Ф降低 Isoluminol的氨基取代导致Ф增加 此类标记可用于各种分析物,但CL需催化 剂,因此有较高的背景信号。
荧光免疫分析法优点: 消除放射性同位素的污染 稳定性较好 缺点: 高的背景光,限制了灵敏度 干扰测定
三.化学发光免疫分析法 这种分析方法既有发光检测的高灵敏度,又有免 疫分析法的特异性。 1.主要发光体系 鲁米诺,异鲁米诺及其衍生物 焦焙酚 光泽精 吖啶酯 1,2-双氧基化合物 过氧化草酸酯 萤火虫发光体系 细菌发光体系
3 酶免疫分析法
用酶标记抗原或抗体 例:酶联免疫法测定氯霉素 微量反应板——羊抗兔IgG抗体 兔抗氯霉素抗体+氯霉素酶结合物 +氯霉素样品 没有结合的酶结合物被洗去,再向相应孔中加入 过氧化氢和邻苯二胺,作用一定时间后,结合后的酶 结合物将无色的邻苯二胺转化为蓝色的产物,加入终 止液后颜色由蓝变黄,用波长450nm(双波长时最适 参考波长≥600nm)酶标仪进行检测,吸光值与样品 中氯霉素含量成反比。 酶不稳定、光度分析线性范围窄

化学发光免疫分析法-自己整理

化学发光免疫分析法-自己整理

化学发光免疫分析法(CLIA)A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法:(竞争法:用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体,待检抗原与检测信号成反比)一、原理:本实验采用竞争法,酶标抗原与标准品抗原竞争抗体,标准品抗值越小。

例:A为一原浓度越大,结合到抗体上的酶标抗原越少,RLU越小,B/B种抗原小分子,有免疫反应性。

实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析,使待测A、辣根过氧化物酶标记的A(A-HRP)在均相体系中与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗A抗体(FITC-A抗体)发生竞争性免疫反应,再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒,反应生成物结合在磁微粒上,在磁场经分离、洗涤后加发光底物,用冷光分析仪检测发光强度(RLU),测定尿液中A的含量。

二、仪器:1、Flash’n glow LB955 30 管全自动进样冷光分析仪(Berthold 公司);2、高速离心机(Beckman 公司), 转速13000 r/min3、磁性分离器(北京科美生物技术有限公司定制, 磁场强度2800 高斯)4、XW80 旋涡混合器(上海精科实业有限公司)5、试管12 × 60 mm(浙江拱东医用塑料厂)6、磁性微粒子(磁性分离剂, Adaltis公司)三、试剂1、A标准品2、A单克隆抗体3、A-BSA结合物4、抗FITC抗体包被的磁性微粒子(5mg/mL)5、FITC标记的A单克隆抗体6、HRP标记的A7、PBST 洗涤液(0.05mol/L PBS, 含0.05% Tween-20)8、分析缓冲液(0.05 mol/L 的PBS 缓冲溶液, pH 7.4, 含2.0%BSA、0.5 %的水解明胶、0.1%的Proclin-300)9、发光底物液(鲁米诺、过氧化氢和对碘苯酚溶液)实验用水为二次蒸馏水四、试剂处理1、用分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释标准品;2、取A-BSA-HRP溶液, 以分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000 的A-BSA-HRP 溶液,4 ℃保存. FITC-A单克隆抗体溶液的配制: 取FITC-A单克隆抗体溶液, 以分析缓冲液为稀释液,梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12000 的FITC-A单克隆抗体溶液, 4 ℃保存。

化学发光免疫分析

化学发光免疫分析

化学发光免疫分析的类型介绍更新:2012-05-16 12:26:51 | 来源:标签:化学发光反应参与的免疫测定分为以下几种类型:(一)化学发光酶免疫测定化学发光酶免疫测定(CLEIA)是采用化学发光剂作为酶反应底物的酶标记免疫测定。

经过酶和发光两级放大,具有很高的灵敏度。

以过氧化物酶为标记酶、以鲁米诺为发光底物、并加入发光增强剂以提高敏感度和发光稳定性。

应用的标记酶也可以为碱性磷酸酶,发光底物为dioxetane磷酸酯,固相载体为磁性微粒医学教|育网搜集整理。

(二)化学发光免疫测定化学发光免疫测定(CLIA),是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的一类免疫测定方法。

吖啶酯是较为理想的发光底物,在碱性环境中即可被过氧化氢氧化而发光。

用作标记的化学发光剂应符合以下几个条件:1.能参与化学发光反应。

2.与抗原或抗体偶联后能形成稳定的结合物试剂。

3.偶联后仍保留高的量子效应和反应动力。

4.应不改变或极少改变被标记物的理化特性,特别是免疫活性。

鲁米诺类和吖啶酯类发光剂等均是常用的标记发光剂。

(三)微粒子化学发光免疫分析该免疫分析技术有两种方法:一是小分子抗原物质的测定采用竞争法;二是大分子的抗原物质测定采用双抗体夹心法。

该仪器所用固相磁粉颗粒极微小,其直径仅1.0μm,这样大大增加了包被表面积,增加抗原或抗体的吸附量,使反应速度加快,也使清洗和分离更简便。

其反应基本过程:(1)竞争反应:用过量包被磁颗粒的抗体,与待测的抗原和定量的标记吖啶酯抗原同时加入反应杯温育,其免疫反应的结合形式有两种,一是标记抗原与抗体结合成复合物;二是测定抗原与抗体的结合形式。

(2)双抗体夹心法:标记抗体与被测抗原同时与包被抗体结合成一种反应形式,即包被抗体-测定抗原-发光抗体的复合物。

(四)电化学发光免疫测定电化学发光免疫测定(ECLI)是一种在电极表面由电化学引发的特异性发光反应,包括电化学和化学发光两个部分。

分析中应用的标记物为电化学发光的底物三联吡啶钌或其衍生N-羟基琥珀酰胺(NHS)酯,可通过化学反应与抗体或不同化学结构抗原分子结合,制成标记的抗体或抗原。

化学发光免疫分析

化学发光免疫分析

3
在血循环中,约99.5%的T3与TBG结合,但T3与TBG的亲和力明显低于T4;T3不与TBPA结合
参考范围:0.58—1.62 ug/dL 临床意义: T3升高:⑴见于甲状腺功能亢进的病人,轻型甲亢、早期甲亢、亚临床甲亢的变化较T4明显,适合轻型甲亢、早期甲亢和亚临床甲亢以及甲亢治疗后复发的诊断;T3型甲亢仅有T3和FT3升高; ⑵与T4一样,T3亦受TBG变化影响,但受影响程度不及T4。 T3降低: ⑴仅于较重甲状腺功能减退的病人,T3和T4均下降,轻型甲减T3不一定下降; ⑵重症全身性疾病状态或慢性病变可导致T3下降,多见于慢性肾功能不全、慢性心功能不全、糖尿病、心梗等疾病的患者。
参考范围:5.0—14.5ug/dl(CENTAUR) 临床意义: T4升高:⑴见于甲状腺功能亢进的病人,但轻型甲亢、早期甲亢、亚临床甲亢的变化未如T3明显; ⑵凡引起TBG升高的因素均可使T4升高,如妊娠、应用雌激素、葡萄胎、淋巴瘤、血卟啉病等;⑶药物如胺碘酮、含碘造影剂、β受体阻断剂、奋乃近、海洛因等 T4降低: ⑴见于甲状腺功能减退的病人,轻型甲减、亚临床甲减的变化较T3明显; ⑵缺碘性甲状腺肿可见T4降低或在正常低限,而T3正常; ⑶肾病综合征、肝功能衰竭、遗传性TBG缺陷症、肢端肥大症、重症全身性疾病状态等;⑷以及应用糖皮质激素、雄激素、生长激素、苯妥英钠等药物
血清FT3和FT4降低: ⑴甲减病人两者皆下降,但轻型甲减、甲减初期多以FT4下降为主;⑵低T3综合征仅有FT3下降; ⑶某些药物,如苯妥英钠、多巴胺、糖皮质激素也可使FT3和FT4降低。
临床意义:
T3、T4均升高:高TBG血症、甲亢、甲状腺激素不敏感综合征。 T4升高,T3正常或下降:家族性白蛋白异常性高T4血症;胰高血糖素瘤;药物普萘洛尔、胺碘酮、胆囊造影剂;全身性疾病、精神性疾病;苯丙胺成瘾;T4型甲亢、甲亢伴T4转换T3障碍。 T4正常,T3升高:T3型甲亢;甲减用T3或者其他甲状腺激素制剂替代治疗后 T4正常,T3下降:患有全身性疾病时;5’单脱碘酶活性下降;血皮质醇升高的各种情况;营养不良综合征。 T4下降、T3升高:医源性甲亢;甲状腺功能正常病人服用甲状腺激素制剂。 T4下降,T3正常:轻至中度甲减;碘缺乏;苯妥英钠、卡马西平。 T3和T4均下降:中至重度甲减;重症全身性疾病;低TBG血症;大剂量使用水杨酸制剂

化学发光标记免疫分析法

化学发光标记免疫分析法
525nm处的 FITC发光信号降 低
不同IgG浓度下CRET免疫传感器的荧光光谱。IgG浓度分别为:0 (a), 0.5 (b), 1 (c),1.5 (d), 2 (e), 2.5 (f), 3 (g), 3.5 (h), 及4 nM (i)。插入的曲线为荧 光强度比率(R=I425/I525)随浓度变化曲线
01 吖啶酯 Add your texts here
02 三联吡啶钌
03 鲁米诺及其衍生物 04 AMPPD
化学发光剂
吖啶酯:在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm 的光,具有很高的发光效率,其激发态产物N-甲基吖啶酮 是该发光反应体系的发光体。
化学发光剂
三联吡啶钌: [RU(bpy)3]2+是电化学发光剂,它和电子供 体三丙胺(TPA)在阳电极表面可同时失去一个电子而发生 氧化反应。
化学发光剂
电化学发光剂反应原理
化学发光剂
鲁米诺:化学名称为3-氨基邻苯二甲酰肼 鲁米诺发光原理
化学发光剂
AMPPD:化学名称为 3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧 酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐
AMPPD发光原理
标记技术
发光物标记 酶标记 元素标记
标记技术:将
化学发光剂的 分子与某些分 子结合,直接 或间接地测定 待测组分。通 过分析被标记 物来完成对待 测组分的测定
人体免疫球蛋白A检测
化学发光夹心法检测lgA装置:多毛细管玻璃板的微孔示意图
化学发光免疫分析检测IgA过程
化学发光强度和lgA浓度的关系
人体免疫球蛋白A检测 集束板与96孔板检测lgA的比较
冲洗后
(2) 加入碱 (pH>10)
发光

临床免疫检验:直接化学发光免疫分析

临床免疫检验:直接化学发光免疫分析
糖尿病和 心血管疾病
胰岛素 C-肽 肌红蛋白 肌钙蛋白
思考题
LOGO
1.直接化学发光免疫分析的原理是什么?方法类型有哪些? 2.常用的直接化学发光剂是什么?
小结
01
直接化学发光免疫分析的检测原理
02
直接化学发光免疫分析的方法类型
03 直 接 化 学 发 光 免 疫 分 析 的 关 键 技 术
04
直接化价
活化吖啶酯可直接标记抗 原或抗体,结合物稳定, 不影响吖啶酯发光效率及
抗原或抗体免疫活性
吖啶酯具有化学发光反应 简单、快速,发光本底较 低,无需催化剂等优点
02 01
LOGO
固相载体采用纳米磁性微球
03
可增大包被面积,加快反应
“分离-洗涤”简便、快捷
吖啶酯发光为瞬间发光,持
04
续时间短,对信号检测仪的
灵敏度要求较高
临床应用
激素
甲状腺激素 生殖激素
肾上腺激素 垂体激素
治疗药物监测
茶碱 地高辛 环孢素 巴比妥
贫血因子
维生素B12 叶酸
红细胞叶酸 铁蛋白
过敏性疾病
总lgE 特异性lgE
肿瘤标记物
AFP CEA PSA CA19-9
骨代谢
骨胶原酶 脱氧吡啶啉
LOGO
病原体血清 标志物
HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb
现对超微量物质的定量分析方法
化学发光剂
LOGO
化学发光免疫分析使用的发光剂是吖啶酯
方法类型
LOGO
夹心法
1
间接法
2
竞争法
3
检测原理
LOGO
发光标记物的制备
LOGO

(完整版)荧光和化学发光免疫分析方法

(完整版)荧光和化学发光免疫分析方法

荧光和化学发光免疫分析方法免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法,即利用抗原与抗体的特异性反应, 应用制备好的抗原或抗体作为试剂,以检测标本中的相应抗体或抗原.由于免疫的特异性结合,免疫分析方法具有很好的选择性,荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。

本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。

一、免疫免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质,并通过免疫应答排除抗原性异物,以维持机体生理平衡的功能。

免疫是人体的一种生理功能,人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分,从而破坏和排斥进入人体的抗原物质,或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等,以维持人体的健康.特异性免疫系统,是一个专一性的免疫机制,针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞(浆细胞)分泌的抗体,只能对同一种抗原发挥免疫功能.而对变异或其他抗原毫无作用。

1、抗原1。

1抗原的定义抗原:是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答(免疫原性) ,并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。

抗原一般为大分子物质,其分子量在10kD以上.1。

2抗原的分类完全抗原:同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原,如细菌、病毒、异种动物血清等。

半抗原:仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性,而无免疫原性的物质。

如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质,它们本身不具免疫原性,但当与蛋白质大分子结合后形成复合物,便获得了免疫原性,1。

3抗原的性质决定簇是指抗原分子表面的基团,它直接决定免疫学反映的特异性.抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合,从而激活淋巴细胞,引起免疫应答,抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。

因此,抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构,也是免疫反应具有特异性的物质基础。

2、抗体2.1抗体的定义抗体:是机体受抗原刺激后,由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。

2.2抗体的结构抗体是机体受抗原刺激后,由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白,因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。

化学发光免疫分析

化学发光免疫分析

化学发光免疫分析化学发光免疫分析,也称为化学发光法或发光免疫测定法,是一种高灵敏度和高特异性的生物分析技术。

它结合了免疫学、生物学和化学的原理,利用特异性抗体与其抗原(或其他生物分子)相互作用,通过化学反应使其辐射出光信号,从而定量地检测目标物质的存在和含量。

一、化学发光免疫分析原理化学发光免疫分析原理基于化学发光原理和免疫学原理。

化学发光原理就是将化学反应的能量通过光子的辐射转换为光的能量。

免疫学原理是利用特异性免疫反应来识别和区分不同的抗原或抗体。

化学发光免疫分析技术的基本步骤如下:1.选择特异性的抗体与目标物质的结合;2.引入辐射源激活化学发光前体(例如,过氧化物或二氧化硫酞);3.目标物质与抗体发生结合后,释放了辐射源激活前体,使其进一步分解并产生化学发光;4.测定样品中的荧光强度,用于定量分析目标物质的存在和含量。

化学发光免疫分析发出的荧光信号对于抗原-抗体的结合非常敏感和特异。

比较常见的荧光标记物包括酶(如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、荧光染料(如荧光素和荧光素衍生物)、金纳米粒子等。

二、化学发光免疫分析的应用化学发光免疫分析的应用涉及生物分子、环境污染、中药等领域。

下面将从这些不同应用领域来介绍化学发光免疫分析技术的具体应用。

1.生物分子分析生物分子分析是化学发光免疫分析技术的主要应用领域之一。

常见的生物分子包括蛋白质、核酸、糖等。

如免疫荧光分析技术可以快速、准确地分析细胞表面分子、内部生物分子和变态反应特异性IgE。

同时,化学发光免疫分析技术可以用于患者体液中的特定免疫球蛋白或蛋白质的定量检测。

2.环境污染分析环境污染分析是化学发光免疫分析技术的另一个主要应用领域。

通过测量土壤、水、空气等样品中的污染物含量,可以快速精准地确定其存在和含量。

化学发光免疫分析技术可用于检测重金属、有机污染物、致癌物等。

该技术不仅检测灵敏,而且简便易行。

3.中药分析中药分析中常用的技术包括高效液相色谱法、气相色谱法、电化学法等。

化学发光免疫分析

化学发光免疫分析

化学发光免疫分析化学发光免疫分析化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)在近十年来得到了很大发展,与微离子发光酶免疫分析(microparticle luminescence immunoassay, MLIA)、生物发光免疫分析(bioluminescence immunoassay, BLIA)、增强化学发光分析(enhanced chemiluminescence, EC)和电化学发光分析(electrochemical luminescence, ECL)等相比,以其灵敏度高(可达10-18mol)、检测速度快、操作简便、所用试剂对人体无危害的优点,成为非放射性免疫分析技术中最具有发展前途的方法之一。

(一)化学发光免疫分析的基本原理化学发光指化学反应引起的发光现象,当物质吸收化学反应过程中释放的化学能之后,能使自身分子受激发而发光;如在生物体中产生此种能源来自生物活体的发光现象,称为生物发光;若产生发光信号的能量来源于电激发,如从多环芳烃的自由基阴离子上除去一个电子,往往产生激发状态的中间物质,当其回到基态时,将产生光辐射,此种发光称为电化学发光。

化学发光反应所发出的光的强度依赖于化学发光反应的速度,而反应速度又依赖于反应物的浓度。

因此,通过检测化学发光强度可以直接测定反应物的浓度,从而进行物质的定性和定量分析。

化学发光与荧光的根本区别是形成激发态分子的激发能源不同。

荧光是发光物质吸收了激发光后使分子产生发射光,化学发光是化学反应过程中所产生的化学能使分子激发产生的发射光。

因此,化学发光反应中反应过程必须产生足够的激发能是产生发光效应的重要条件。

(二)化学发光兔疫分析中的标记物质化学发光免疫分析所使用的标记物根据其参与的化学反应不同,可分为三类:①直接参与发光反应的标记物;②以催化作用或能量传递参与发光反应的酶标记物;③以能量传递参与氧化反应的非酶标记物。

化学发光免疫分析法-自己整理

化学发光免疫分析法-自己整理

化学发光免疫分析法(CLIA)A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法:(竞争法:用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体,待检抗原与检测信号成反比)、原理:本实验采用竞争法,酶标抗原与标准品抗原竞争抗体,标准品抗原浓度越大,结合到抗体上的酶标抗原越少,RLU越小,B/B o值越小。

例:A为一种抗原小分子,有免疫反应性。

实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析,使待测A、辣根过氧化物酶标记的A(A-HRP在均相体系中与异硫氰酸荧光素(FITQ标记的兔抗A抗体(FITC-A抗体)发生竞争性免疫反应,再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒,反应生成物结合在磁微粒上,在磁场经分离、洗涤后加发光底物,用冷光分析仪检测发光强度(RLU,测定尿液中A的含量、仪器:Flash ' n glow LB955管全自动进样冷光分析仪(Berthold公司); 高速离心机(Beckman公司),转速13000 r/min磁性分离器(北京科美生物技术有限公司定制,磁场强度2800高斯) XW80旋涡混合器(上海精科实业有限公司)试管12 X 60 mm®江拱东医用塑料厂)磁性微粒子(磁性分离剂,Adaltis公司)三、试剂1、A标准品2、A单克隆抗体•0——AFBi-BSA^HRP *:F!TC H AFB I +^4}抗FITCEFITC庐合別比FITCr^t I--r i詩玩FITC AFB1 FrrOAFBt^JMI 时fTC旳舸更片单丸垮序汗士体-F:障羊舍和料TJ5H笛箭♦—厲FR1 AF61^■ —FITC(- 歼ITC一餅3、A-BSA吉合物4、抗FITC抗体包被的磁性微粒子(5mg/mL)5、F ITC标记的A单克隆抗体6 HRP标记的A7、P BST 洗涤液L PBS,含% Tween-20)8、分析缓冲液mol/L的PBS缓冲溶液,pH ,含%BSA %的水解明胶、%的Procli n-300)9、发光底物液(鲁米诺、过氧化氢和对碘苯酚溶液)实验用水为二次蒸馏水四、试剂处理1、用分析缓冲液为稀释液,梯度稀释标准品;2、取A-BSA-HR溶液,以分析缓冲液为稀释液,梯度稀释,配制1:1000、1:2000、1:5000的A-BSA-HRP溶液,4 C保存.FITC-A单克隆抗体溶液的配制:取FITC-A 单克隆抗体溶液,以分析缓冲液为稀释液,梯度稀释,配制1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12000的FITC-A单克隆抗体溶液,4 C保存。

化学发光免疫分析技术

化学发光免疫分析技术

一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质 激发到能发射光的电子激发态,若被激发的是一个 反应产物分子,则这种反应过程叫直接化学发光。
反应过程可简单地描述如下:
A + B C* + D C* C + h1
1.2 化学发光的种类

间接化学反应发光
若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子F 上,使F分子激发到电子激发态,F分子从激发态 回到基态时发光,这种过程叫间接化学发光。 反应过程可表示如下:
immunoassay, ECLIA
• 在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应, 用电化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+标记Ab,通 过Ag-Ab反应和磁珠分离技术,根据三联吡啶钌在 电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定 性。 电化学发光、免疫分析检测、生物素-抗生素、固相磁 珠技术
局限性:方法选择性较差、发光体系相对较少、仪器 商品化不够
A. 吖啶酯
代表性物质:光泽精 (lucigenin)
CH3 N
+
CH3
Oxidation OH N+ CH3 .2NO3
-
N
NMA
*
O
+
LIGHT
N-METHYLACRIDONE (NMA)
Lucigenin
max = 445 nm
氧化剂:H2O2 还原剂:乳酸 尿酸 抗坏血酸
催化剂:过渡金属离子、酶
⑤在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。
2.2 化学发光剂种类 直接化学发光剂,间接化学发光剂
直接化学发光剂 直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催 化作用,直接参与发光反应,它们在化学结构上有 产生发光的特有基团,可直接标记抗原或抗体。

化学发光免疫分析方法.

化学发光免疫分析方法.

为85.5%。Magliulo 等[20]建立了牛奶中黄曲霉毒素M1的化学发光酶
免疫分析方法,通过将黄曲霉毒素M牛血清白蛋白包被在聚丙烯板上,
通过酶标二抗在含有鲁米诺的基板上进行检测。该方法的最低检测限为
1 pg/mL,且板间板内数据的变异系数均低于9%,回收率在96%~
122%之间。 Lin 等[21]建立了农产品中黄曲霉毒素B1 的化学发光免 疫分析方法。该方法线性检测范围在0.05~10 ng/g 之间 ,检测灵敏度 为0.01 ng/g,板间及板内变异系数分别为12.2%及 10.0%。 农产品中样 品添加回收率在79.8%~115.4%之间。 同时, 将建立的分析方法与黄 曲霉毒素商品化酶联免疫试剂盒进行了相关性试验,相关系数为
菌素B1 的 ELISA 方法相比,其方法灵敏度提高了10 倍。 且通过样品的
添加回收率试验表明其有良好的回收率,其分析结果与ELISA 分析方法
与 HPLC 方法有良好的相关性。
Yang等[17]建立了食品中葡萄球菌肠毒素B(SEB)的碳纳米管的化
学发光免疫分析方法,通过将SEB 抗体吸附在碳纳米管表面 , 然后将抗
方面报道还有Perschel 等[13]通过化学发光免疫分析对原发性醛固酮
过多症(PHA)进行快速筛选, Tudorache等[14]利用磁颗粒免疫支
持液膜方法(m-ISLMA)检测唾液中的孕酮含量,Iwata 等[15]利用双
夹心化学发光免疫分析方法测定血浆中内皮素-1的含量等。关于这方
面的应用,化学发光免疫分析方法应用的最为广泛,正是在医学检测方
种生物化学领域中最新的超灵敏的碱性磷酸酶底物,其特点是反应速度
快,在很短时间内提供正确可靠的结果。在它的分子结构中有两个重要

电化学发光免疫分析法电化学发光免疫分析法

电化学发光免疫分析法电化学发光免疫分析法
• 化学发光是指在某些特殊的化学反应中, 反应的中间体或产物由于吸收了反应释 放的化学能而处于电子激发态,当其回 到基态时伴随产生的光辐射现象。
化学发光 反应包括 两个关键 步骤,即 化学激发 和发光。
化学发光反应能级图
化学发光分析
• 根据化学发光反应在某一时刻的发光强 度或反应的发光总量来确定反应中相应 组分含量的分析方法,称为化学发光分 析。
方法评价
• “链霉亲和素-生物素”是是具有很强的非共 价相互作用的一对化合物,具有牢固而特 异的结合,应用此放大系统,使检测的灵 敏度大大提高;
方法评价
• 利用氧化铁的磁性,使用电磁场分离结 合态和游离态,方便迅速,实现了精确 的全自动化; • 标记物的再循环利用,使发光时间更长、 强度更高、易于测定。
• • • • •
免疫分析法 发光和化学发光 化学发光免疫分析法 电化学发光 电化学发光是通过在电极上施 加一定波形的电压或电流信号进行电解 反应的产物之间或与体系中共存组分反 应产生化学发光的现象。
电致化学发光(ECL)
• ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光反 应,而CL是通过化合物混合启动发光反 应。因此ECL反应易精确控制,具有灵活 性。
三联吡啶钌 ( [Ru(bpy)3]2+ )特点
三联吡啶钌( [Ru(bpy)3]2+ )特点
• [Ru(bpy)3]2+衍生物与免疫球蛋白结合的分子 比超过20仍不会影响抗体的可溶性和免疫 活性; • [Ru(bpy)3]2+分子量小,空间位阻小 ,即便 小分子的核酸也能标记,使检测的菜单大 大丰富,更重要的是为其检测菜单的开发 前景提供了广阔空间。
ECLI原理
• 在电极表面由电化学引发的特异性化学发 光反应,用电化学发光剂三联吡啶钌 [Ru(bpy)3]2+标记Ab,通过Ag-Ab反应和磁珠 分离技术,根据三联吡啶钌在电极上发出 的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定性。

化学发光标记免疫分析法

化学发光标记免疫分析法

化学发光标记免疫分析法化学发光标记免疫分析法(Chemiluminescent Immunoassay,CLIA)是一种常用于检测生物样本中特定分子的高灵敏度和高特异性的方法。

该技术利用化学发光效应,通过特异性抗体与抗原结合,进而检测出样品中的目标物质。

本文将探讨化学发光标记免疫分析法的原理、应用领域以及优点。

化学发光标记免疫分析法的原理是在化学反应中产生发光信号,该信号与目标物质的浓度成正相关。

这种发光反应一般是通过酶-底物体系进行催化反应来实现的。

常用的催化体系有辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)。

当特异性抗体与抗原结合时,HRP或AP被引入,与底物反应,产生可观察的发光信号。

该发光信号可以通过光子计数器或相关设备进行测量和定量,从而获得目标物质的浓度。

化学发光标记免疫分析法在许多领域中得到广泛应用。

在临床诊断中,它常用于检测生物体内的各种生物标志物,如肿瘤标志物、病毒抗原、抗体和药物浓度等。

在食品和环境安全领域,它可以用于检测食品中的农药残留、重金属和有毒物质等。

此外,化学发光标记免疫分析法还可应用于药物研发、生物学研究和环境监测等各个领域。

化学发光标记免疫分析法具有不少优点。

首先,它具有极高的灵敏度。

由于信号的产生是通过酶催化反应而非染色反应完成的,因此其灵敏度高于传统的染色法。

其次,该方法具有极高的特异性。

由于特异性抗体与抗原的结合是特异性的,因此它不会受到其他物质的干扰。

第三,化学发光标记免疫分析法的操作相对简单。

只需要将样品与标记抗体和底物反应,然后测量发光信号即可得到结果。

最后,该方法具有广泛的线性范围。

不同浓度的目标物质都可以在一定范围内进行准确测量。

尽管化学发光标记免疫分析法具有许多优点,但也存在一些局限性。

首先,该技术需要贵重的设备和试剂,因此成本较高。

此外,发光信号的持续时间较短,限制了信号的记录和测量时间。

最后,由于发光信号的产生涉及一系列的酶反应,因此在一些特殊样品(如高脂血样品)中可能会受到脂质干扰,影响结果的准确性。

整理免疫分析法

整理免疫分析法

免疫分析法1,熟悉免疫分析法的根底知识,了解放射免疫分析法,嗨免疫分析法,化学发光免疫分析法,荧光免疫分析法第一:概述根本原理根本条件方法分类免疫分析法(Immunoassay,IA):是指以特异性抗原-抗体反响为根底的分析方法.1959年,由美国Yallow和Berson等人将放射性同位素示踪技术的高灵敏性和免疫反响的高特异性结合起来,首先测定了糖尿病人血浆中的胰岛素含量,从而创立了放射免疫分析方法(Radioimmunoassay,RIA).嗨免疫分析法,化学发光免疫分析法,荧光免疫分析法,时间分辩免疫分析方法等.一,根本原理(一)竞争抑制原理实质都是抗原一抗体竞争结合反响Ag*:标记抗原Ag:未标记抗原Ab:特异抗体Ag*-Ab:标记抗原-抗体结合物,Ag-Ab代表未标记抗原一抗体结物K:平衡常数(K=K1/K2).抗原-抗体反响须满足以下条件:Ag*与Ag(待测物)必须是相同的生物活性物质;所参加Ag*和Ab的量应是固定的;Ag*与Ag的量之和应大于Ab的结合位点;Ag*,Ag及Ab须处在同一反响体系中.这种竞争抑制的数量关系成为免疫分析的定量根底(二)竞争抑制曲线(剂量反响曲线)用待测物的标准品配置一系列浓度的标准溶液,再参加一定量的标记抗原和抗体待抗原抗体反响到达平衡后,测定系列标准溶液的Ag*-Ab的结合率.B代表结合的标记抗原;F代表游离的标记抗原;T代表总的标记抗原.B/F-[Ag]B/(B+F) X 100%[Ag](三)抗原一抗体反响的特点1.特异性一种抗原分子只能与由它刺激产生的抗体发生特异性结合反响.抗原的特异性主要取•决于抗原决定簇(Cluster)的数量,性质及立体构型.抗体的特异性那么取决于抗原结合段(fragment of antigen binding,IgFab) 与相应抗原决定簇的结合水平.交叉反响(cross reaction): 结构相近似的其它药物或化合物与抗体的结合^2.可逆性抗原与抗体的特异性结合是由于两者的分子结构及立体构型相互吻合,它仅发生在分子的外表,并依靠抗原一抗体分子间的静电力作用,疏水作用,氢键作用及范德华引力等而存在. 是可逆反响,改变反响条件可使结合物发生水解.3.最适比例性抗原抗体的结合反响具有一定的量比关系.只有当抗原抗体两者的分子比例适宜时,才能发生最强的结合反响.以沉淀免疫反响为例二,根本条件三种根本试剂:标记抗原,未标记抗原和特异抗体(一)抗原及其制备1.全抗原与半抗原抗原(Antigen):能在机体中引起特异性免疫应答反响的物质.物质的抗原性包括免疫原性和抗原特异性.免疫原性(Immunogenicity):抗原注入动物体内后能促使动物产生特异抗体.抗原特异性(Antigenic Specifiety): 抗原能与特异抗体相作用的性质.1.全抗原与半抗原全抗原:同时具有免疫原性和抗原特异性的物质.半抗原(Hapten):只能与特异抗体作用但不引起机体免疫应答的物质.人工完全抗原:药物(半抗原)本身不具免疫原性,只有当它们与某些大分子的载体物质 (如蛋白质或多肽)共价结合后,才具有免疫原性.这种小分子半抗原和大分子载体物质结合后所形成的全抗原.2.人工抗原的制备(1)载体(carrier)的选择:作为载体应考虑药物与载体结合后其免疫活性是否高,溶解度是否大,对化学反响合有机溶剂导致的变形作用有足够的反抗力,价廉易得载体的本质是蛋白质-动物血清蛋白最常用.牛血清白蛋白(BSA),兔血清白蛋白(RSA),人血清白蛋白(HSA)(2)半抗原的选择药物本身必须具有适宜的活性官能团,如-COOH,-NH2,-OH,-C=C^.(3)载体与半抗原的结合①碳二亚胺法利用碳二亚胺为缩合剂,将药物分子中的愈基与蛋白质分子中的氨基相连形成肽键②混合酸酊法③戊二醛法④琥珀酸酊法⑤重氮化的对氨基苯甲酸法3.人工抗原的鉴定鉴定的目的:测定人工抗原(药物)与蛋白质的结合比光谱分析法化学分析法放射性同位素法(1)光谱分析法结合物水解后,光谱法测定水解药物和蛋白质的含量,从而推算出它们的分子结合比.(2)化学分析法利用三硝基苯磺酸钠或二硝基酚,测定蛋白质与半抗原结合前后游离氨基数目的差异.反响出蛋白质与药物的结合程度,可求出结合物中药物的含量.⑶放射性同位素标记法在制备人工抗原时,在量的药物中参加定量的放射性同位素标记药物,然后通过测定结合物中的放射性强度,便可计算出参加的标记药物的总量中已与蛋白质结合的比例. 4.标准抗原(Standard antigen)标准抗原:在免疫测定中用来制作标准曲线或制备标记抗原用的药物标准品,是免疫分析的定量依据. 蛋白质,多肽类可使用纯度较低的产品,但一般不应低于90%,尤其是其中不能含有化学结构相类似的干扰杂质,否那么会使样品的测定结果偏高.(二)特异抗体的制备及鉴定1.特异抗体(Specific Antibody)特异抗体:(高度特异性)是指抗原(免疫原)作用于机体产生免疫反响,在血清中产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白.在免疫球蛋白中,免疫球蛋白G (IgG)含量最高(约占70%),是免疫分析中最常用的抗体.2.抗体的制备单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb): 将预先免疫过的小鼠脾细胞与体外培养的骨髓瘤细胞,经细胞融合技术而得到的杂交瘤细胞.该瘤细胞通过体外培养,可大量复制,产生出特异的结构相同的均质抗体,此即单克隆抗体.多克隆抗体(Polyclonal Antibody) 的制备是将抗原直接免疫动物而得到.抗体:单克隆抗体和多克隆抗体(抗血清)两大类(1)免疫原的制备免疫原(Immunogen):人工将抗原制成能刺激机体引起体液及细胞免疫反响的物质^水剂:抗原中参加一定量的无菌生理盐水所制成的免疫原.福氏完全佐剂(Freund's Complete Adjuvant): 其制法是:取羊毛脂一石蜡油(1:3)混合,高压灭菌,等体积地与一定浓度的抗原混合,按3 mg/ml的量参加卡介苗,研磨或于无菌注射器中对拉,使之成为油包水的程度(放入冰水中不扩散)即可.福氏不完全佐剂在福氏完全佐剂中去掉卡介苗.(2)免疫接种动物家兔不仅对抗原的免疫反响较好,而且产生的抗体也较均一,是首选的免疫动物.羊,豚鼠微量免疫法的免疫抗原量在微克级内,常量免疫法的免疫抗原量通常在1〜10 mg左右,大量免疫法的免疫抗原量在50〜100 mg.(3)抗血清的获得采血时应注意无菌操作,尽可能将血放人面积较大的无菌容器中,先室温凝固30min左右, 再放人30C温箱约2h使凝固,最后放入4C冰箱过夜.次日吸取血清,将血块用无菌的玻璃棒轻轻拨离并捣碎,在4000-10000 r/min 离心20min,即得抗血清.大动物免疫羊局部采血家兔等小动物杀死动物一次性放血.3.抗体的鉴定⑴滴度(Titer)滴度又称效价或工作稀释度.滴度用免疫反响液中抗体(实指抗血清)的稀释度表示,稀释倍数越大,表示滴度越高.测定滴度可采用标记抗原法.RIA法测定抗血清的效价为例首先将抗血清用空白血清按比例稀释,然后精密吸取各稀释抗血清等量,分置假设干支试管中,再于各试管中分别参加定量的放射性同位素标记药物(设放射性强度为T),温育.待反响到达平衡后,于反响液中加人别离剂(如沉淀剂),别离与抗体结合的标记药物(沉淀局部),测定各管中沉淀的放射性强度(B),并计算各管中标记药物的结合百分率(B/T%).当抗血清稀释度足够低时,其结合率趋于极值,该值称为"过量抗体结合率"(标记药物全被结合),如图中曲线的AB段,可用来衡量标记药物的质量.自AB段以后,随着抗血清稀释倍数增大,其标记药物的结合率逐渐降低,实际工作中多采用结合率为50%寸(C点)的抗血清稀释度(D点).⑵活度(Avidity)活度:抗体与相应抗原的亲和力(Affinity).活度可反映出抗体分子和抗原分子之间的结合水平.活度高,说明形成抗原一抗体结合物的速度快而解离小.抗体活度上下与免疫分析方法的灵敏度密切相关,它主要表现在剂量反响曲线的斜率上,斜率越陡,说明活度越高,测定效果越好.⑶特异性(Specificity)特异性:抗原和抗体的结合水平与其它结构相类似的干扰物的结合水平的比拟^如果抗体与抗原的结合水平越强,而与其它类似结构的干扰物结合水平(称为交叉反响) 越弱,那么说明抗体的特异性越强.三,方法分类1.按标记物的种类分(1)放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)(2)嗨免疫分析(enzyme immunoassay,EIA)(3)化学发光嗨免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay,CIZIA)(4)荧光免疫分析法(fluorescence immunoassay,FIA)荧光免疫分析法底物标记荧光免疫分析(Substrate labeled fluorescence immunoassay,SLFM)荧光偏振免疫分析(fluorescence polarization immunoassay,FPIA)荧光淬灭免疫分析(Fluorescent Quenching Immunoassay,FQM)荧光增强免疫分析(Fluorescent Enchancement Immunoassay,FEIA)时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluorescence immunoassay,TRFIA) 2.按是否参加别离剂分(1)均相免疫分析(Itomogeneous lmmunoassay)在某些免疫分析中,当抗原一抗体反响到达平衡后,反响液中结合的标记药物与游离的 标记药物之中有一种不产生信号或信号消失,因此无需将反响液分作两相,即可在均相溶液中进行测定,故称为均相免疫分析.如嗨放大免疫测定技术(enzyme multipliedimmunoassay technique,EMIT).(2)非均相免疫分析(heterogeneous immunoassay)在某些免疫分析中,当抗原一抗体反响到达平衡后,只有在反响液中参加别离剂,将游离 标记药物和结合标记药物分开之后,才能测出各自局部的标记药物浓度 .否那么,测定的是两者的总浓度.由于这种信号的测定需将反响液分成液 -固两相后,才能分别测定,故称为非均相免疫分析.如放射免疫测定(Radioimmunoassay,RIA) 第二放射免疫分析 放射性同位素标记抗原 F 与B 的别离技术 放射免疫测定仪 标准曲线的制备与样品测定步骤方法评价 应用举例 放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA):利用放射性同位素的测量方法与免疫反响根本原理相结合的一种同位素分析技术 ^特点:灵敏度高,特异性强,样品用量少,标记物容易制备以及放射性强度容易检测 一,放射性同位素标记抗原在体内药物分析中,常采用放射性同位素.放射性同位素是指能自发放射出射线而变成 其它元素的不稳定同位素.放射性同位素在发生核衰变时,会发射出a -射线,8 -射线及 Y -射线.用相关仪器检测产生的射线1. 放射性强度放射性强度(严格说应为放射性活度(desintegration per-second,dps), 即旧q=1dps.1居里是指每秒钟放射性同位素发生 2. 放射性比度 放射性比度或称比放射性或比活性:放射性同位素单位重量或体积中所含的放射性强度mci x g -1 或 mcix ml-1 3. 放射性化学纯度(放化纯度)放化纯度是指供使用的放射性药物中所需要的标记药物的放射性强度占总放射性强度 的百分比.一般实验要求放化纯度大于 90%. (二)标记抗原(Iabeled Antigen)标记抗原又称放射性标记药物,供标记的药物通常应是待测药物的纯品 .标记抗原的纯 度决定RIA 的特异性,而标记抗原的放射性比度那么决定 RIA 的灵敏度.因此,标记抗原是 RIA 测定技术中最关键的成分.1.对标记抗原的一般要求① 有高的放射性比度;② 标记后抗原仍具有原来的抗原性;标记物稳定性要好,不致因辐射引起化合物分解.2.标记放射性同位素的选择125I 的特点是:,即可用于于定量分析.):每秒钟放射性同位素的原子核发生的衰变数 其单位为贝可(Bq).1贝可相当于每秒1次核衰变,3.7 X 1010次核衰变.①化学性质活泼,易于标记;②标记物在衰变中放出的Y-射线能量较高,易于测定;③标记物的放射线半衰期相对较短,须经常标记;④碘原子的半径较大,标记后可改变药物的化学结构或掩盖药物分子的特异功能基团, 易使药物分子的抗原性受到影响.3H的特点是:①用3H标记后的药物可获得较高的放射性比度;②标记后的药物的抗原性不会受到影响,由于氢原子的半径较小,且3H只是与药物分子的1H发生交换,不涉及化学元素的改变③3H的半衰期很长,可达12〜16年;④3H发射出的8射线能量较低,须采用价格较贵的液体闪烁计数器才能测定其放射性强度. 〔三〕标记方法1.125I标记抗原的制备取代反响将其标记在药物或药物的衍生物上^用碘标记时一般采用氧化法,常用的氧化剂有H2O2及氯胺T等,目前应用最多的是氯胺T.氧化法是指先用氧化剂将放射性碘离子〔I-〕氧化成游离的放射性碘分子〔12〕,然后再进行标记.大分子药物可直接采用放射性碘标记.小分子物质一般先将药物制成含酪氨酸,组氨酸或含酚基的衍生物,然后再进行标记,使药物分子中的氢被带正电荷的放射性碘取代.2.3H标记抗原的制备H标记可分为定位标记和非定位标记两种方法^非定位标记通常采用气体曝射法,即将药物与M 〔3H〕气密封在一起,放置几天或几周,使3H与药物分子的1H 发生交换定位标记采用特殊的合成路线,即先将3H引入药物分子结构中的指定位置,制成含有不饱和双键的标记药物前体,然后再对双键部位进行催化加H .这种制备3H标记物的方法称为定位标记.二,F与B的别离技术游离的标记药物〔F〕和结合的标记药物〔B〕1,沉淀法2,吸附法3,固相法4,双抗体法〔一〕沉淀法用蛋白沉淀剂将抗体沉淀,从而可使与蛋白〔抗体〕相结合的药物也一起沉淀下来,而游离的药物由于未与蛋白结合,便留在于溶液中.常用的沉淀剂:硫酸铉,亚硫酸氢钠,乙醇,异丙醇.方法:在免疫反响到达平衡后的反响液中参加一定量的饱和硫酸铉溶液,使最终浓度为1.6-2.0mol/L 〔约40%-50%勺饱和度〕,立即混匀,在4C条件下反响20〜30min后,离心,别离沉淀物,用40%勺硫酸铉饱和溶液洗涤沉淀,然后测定放射性强度.优点:快速,简便,价廉.缺点:不能使F和B完全别离,沉淀物对放射性标记抗原有非特异性吸附,因而空白值较高. 〔二〕吸附法吸附法是利用固体吸附剂能在反响液中吸附游离抗原的原理而使F与B别离.常用的吸附剂:右旋糖酊包裹的活性炭〔Dextron Coated Carbon,DCC〕,纤维素,硅酸盐等.原理:DCC是利用活性炭的强吸附性和右旋糖酊的分子筛作用,使小分子的游离药物能通过分子筛的网眼被内层的活性碳选择性吸附,而与抗体相结合的药物由于分子体积大那么不能通过网眼而被留在液相中.方法:当免疫反响到达平衡后,于反响液中参加DCO附剂,待吸附达平衡后,离心.离心后的结果正好与沉淀法相反,上清液中是与抗体相结合的标记药物〔B〕,而沉淀中那么是游离的标记药物〔F〕.优点:快速,简便缺点:如药物一抗体结合物的离解常数较高时,测定结果不稳定.〔三〕固相法原理:通过物理涂敷或化学结合方法将抗体结合在不溶性固相载体外表,待抗原与抗体形成结合物〔B〕后就附在固相物上,而游离的抗原〔F〕那么仍留在反响液中,从而实行别离.该法实质上是一种固相免疫测定法〔solid-phase immunoassay〕, 其固相本身就是一些特异的免疫吸附剂.常用的固相载体:葡聚糖凝胶,聚苯乙烯,纤维素,试管等.方法:采用试管固相法,即将抗体直接附着于试管底部的内壁上,测定时于试管中参加样品和试剂,当放射免疫反响到达平衡后,结合物就附在管壁上,游离抗原那么留在液相中.通过离心或采用简单倾去法便可将两相别离^优点:简便,快速,实用.缺点:有时难以获得重复的结合率,其次是固相载体本身也有可能吸附游离标记药物,导致结果误差增大.〔四〕双抗体法别离原理:药物〔半抗原〕与抗体结合后,虽然分子量增大,但还缺乏以生成沉淀而处于"溶解"状态, 这种抗体通常被称为第一抗体,它可通过将抗原注入家兔,豚鼠等动物体内免疫获得.然后再将第一抗体作为新的抗原注入羊,马,牛等较大动物,那么可免疫获得第二抗体〔抗一抗体〕.当往第一抗体的反响液中参加第二抗体后,第一抗体能与第二抗体结合使分子量增大,从而生成沉淀.离心后与抗体结合的标记药物〔抗原-第一抗体-第二抗体结合物〕处在沉淀中,而游离的标记抗原那么留在上清液中.优点:别离效果好,适用范围广.缺点:抗体的制备有一定难度,且操作流程较长.三,放射免疫测定仪一类是T计数器〔T -Counter〕,其所用的闪烁体是碘化钠等固态闪烁晶体 ,为提升其发光效率,还在晶体内参加有0.1%-0.5%的铭作为激活剂,该仪器适合测定1251,1311等同位素发射出的能量较高的8-射线.一类是液体闪烁测量仪〔Liquid Scintillation Counter〕, 由于该仪器放出的8射线能量低,射程短,不可能穿人和激发固态闪烁晶体,而只能在特定的闪烁液中进行,由8 -射线激发液体闪烁剂而产生闪光现象.该仪器适合测定3H,14c等同位素发射出来的8 -射线.〔一〕测量原理液体闪烁测量仪是利用放射性同位素标记药物所发射出的8-射线能作用于闪烁液而发出荧光〔闪光〕,该荧光与放射性药物在单位时间内的核衰变次数有关,通过检测闪烁次数便可求出待测组分含量.1.溶剂作用:溶解闪烁剂和放射性样品;同时还起着吸收和转移8-射线能量的作用.条件:溶剂分子必须具有高度共弛的双键,只要受到能量低的8 -射线的辐射,其兀电子就能跃迁至激发态.一类是烷基苯类,甲苯,对-二甲苯,1,2,4-三甲苯等,主要适用于脂溶性药物的测定. 另一类是酰类,1,4-二氧六环,适用于水溶性药物的测定.种类2.闪烁剂作用:接受激发态溶剂分子退激时所释放的能量T激发态T基态T发射出闪烁的荧光〔光子〕T光电倍增管T光电转换测量系统记录.要求:性能稳定,闪烁效率〔闪烁剂放出光子的能量〕高,淬灭耐受性好,发光衰减时间短.常用的闪烁剂有:对联三苯〔TP〕,2,5-二苯基恶0坐〔PPO〕,2-苯基-5-〔4-联苯基〕-1,3,4-恶-二0坐〔PBD〕等.〔二〕仪器简介1.计数瓶计数瓶〔或称闪烁杯〕:一个具盖的玻璃或塑料小瓶〔10〜20m1〕,用于盛装样品和闪烁液.当放射性药物分子与闪烁液接触时,溶剂吸收放射能量并转给闪烁剂,闪烁剂将吸收的能量转变为光能〔荧光〕,荧光透过计数瓶壁,进入光电倍增管.2.光电倍增管光电倍增管:光阴极,倍增极和阳极构成.进入光电倍增管的荧光〔光子〕通过光阴极外表的透明面板后,直接撞击光阴极,光阴极吸收光子能量后随即发射出光电子,光电子经数个倍增极依次放大,使电子数剧增.这些电子最后被阳极收集,产生一个电压脉冲,并由记录器记录下来3.记录器用于记录单位时间内所产生的电压脉冲数,该脉冲数反映了单位时间内放射性药物的核衰变次数〔闪烁次数〕.通常采用每分钟计数〔counts per minate,cpm〕, 作为放射性同位素药物的放射性强度.四,标准曲线的制备与样品测定步骤〔一〕标准曲线的绘制取标准抗原,用无放射活性的空白血清或血浆稀释成5-8个系列浓度.参加定量标记抗原,其总放射性〔T〕应能满足准确测量的需要.参加定量的已稀释好的特异抗体,其抗体的量应满足灵敏度的要求.将标准抗原,标记抗原,特异抗体与缓冲液混匀后,在适当条件下温育,待反响平衡后测定总计数率〔T〕.参加别离剂,使结合局部〔B〕与游离局部〔F〕别离.测定各管结合局部或游离局部的计数率.标准曲线通常以标准抗原〔待测药物标准品〕的浓度为横坐标,以结合率〔B%〕为纵坐标作图. 纵坐标B%勺计算有两种方法:一种是将与抗体结合的标记药物的放射性强度〔B〕与参加的标记药物总放射性强度〔T〕比拟,即B%=〔B/T〕X 100%另一种是用零标准管〔不加药物标准品〕的放射性强度B0代替T比拟,即B%=〔B/B0〕X 100%.〔二〕样品测定步骤下述情况样品需进行简单处理:测定方法不够灵敏,可将被测物适当浓集;测定方法不很专属,可将被测物与其它干扰物质别离;待测物以缀合物形式存在,可设法使其游离,然后进行测定.例:125I-RIA〔DCC沉淀法〕测定血清中地高辛浓度待测血清样品50 [11 t样品管中;含不同浓度地高辛标准品的血清50〔11 t标准曲线各管中;50 & l空白人血清t零标准管.各管中依次参加保温液100从l t抗体溶液100曰—125I标记的地高辛〔溶液〕100曰摇匀t在室温〔15〜25C〕放置30min^ T-计数器测定各管的总计数T〔即加人的协I总放射性剂量〕t在电磁搅拌〔或手摇〕下,迅速向各管内加人1ml工作液〔全部加完限制在5min内〕,摇匀t离心10min〔3000r/min〕t倾去上清液t T-计数器测定各管中沉淀的计数F〔游离协I地高辛放射性强度〕^计算出标准曲线各管和样品各管的结合率.五,方法评价灵敏度高,特异性强,取样量少,适用于大批量样品的测定.需用放射性同位素标记抗原,其放射性对操作人员的健康,对环境的污染都会造成危害, 而且还需有专用的同位素实验室及免疫测定仪器,本钱较高,因而使其普及受到限制.六,应用例如固相放射免疫分析试剂盒测定血清中地高辛浓度的方法1.主要试剂2.测定方法3.结果计算〔1〕标准曲线法以地高辛标准品血清浓度为横坐标,B标/T(%)为纵坐标,在半对数坐标纸上绘出标准曲线..以地高辛标准品血清浓度为横坐标,但用(B标-BNSB)/(B0-BNSB)(%)为纵坐标作标准曲线,当测得血清样品的(B样-BNSB)/(B0-BNSB)(%)值后,也可从标准曲线上得到对应的血清药浓(2)回归方程计算法以logx为自变量(x为血清中地高辛标准品的浓度),以logitY为因变量进行直线回归第三嗨免疫分析法嗨标记抗原均相嗨免疫分析非均相嗨免疫分析方法评价应用例如嗨免疫分析(Enzyme Immunoassay,EIA)是以嗨作为标记物的免疫测定方法.嗨免疫分析法是1971年由Engvall等人在RIA的根底上开展产生起来的一种新的免疫分析方法.一,嗨标记抗原(一)标记嗨的选择特异性强,嗨蛋白分子中应具有足够的活性基团,以便能与药物结合.活性要高,即当底物浓度低时,确有较高的催化反响率.嗨的活性不易受样品中其它成分影响,有较好的稳定性.嗨的纯度要高,且生物体液中应无标记嗨,底物,抑制剂及其它干扰物质存在.嗨的活性测量方法应简单,灵敏,精密和快速.嗨的来源,纯化,供给等应方便,价廉.最常用的标记嗨1.辣根过氧化物嗨(HRP):约有50%勺EIA使用此嗨.2.碱性磷酸酯嗨(AP):AP标记的结合物性质稳定,其活性可用分光光度计或荧光计测量.3.6-磷酸葡萄糖脱氢嗨(G-6-PD):通常用于均相EIA.4.8 -半乳糖吾嗨(8 -Gal):适用于均相EIA和非均相EIA.5.苹果酸脱氢嗨(MDH):多用于尿样的均相EIA.(二)底物的选择①无色,无毒能溶水;②化学性质稳定,不受光照的影响;③转化率高,在嗨催化下可产生大量的有色物质;④显色产物的量在一定范围内与嗨的浓度或活性成正比;⑤应有终止嗨反响的试剂.常用嗨的底物1,辣根过氧化物嗨的底物:邻苯二胺(OPD),5-氨基水杨酸(5-ASA),四甲基联苯胺及其硫酸盐(TMB/TMBS)2,碱性磷酸嗨底物:对硝基酚磷酸盐溶液(p-NPP),4-甲基伞酮基-磷酸盐(4-MUP)3,8 -D-半乳糖吾嗨底物:邻硝基苯-8 -D-半乳糖毗喃吾(o-NPG),氯酚红-8 -D-半乳糖毗喃吾(CPRG)试卤灵 "-D-半乳糖毗喃吾(RG)4,葡萄糖氧化嗨底物:与辣根过氧化物嗨底物相同(三):嗨标记药物的制备嗨标药物的嗨活性和免疫活性决定了嗨免疫测定法的灵敏度,因此嗨标药物成为EIA的关键.选择制备方法应注意以下原那么:(1)对嗨和抗体的活性没有影响(2)生成的结合物是可溶的,稳定的(3)反响条件易限制(4)制备方法简单,能重现二,均相EIA均相嗨免疫分析(Homogeneous Enzyme Immunoassay)是指嗨标抗原(AgE)同抗体(Ab)结合后,所形成的嗨标抗原一抗体结合物(AgE—Ab)可使嗨的活性发生改变(增强或减弱),且不需将游离的嗨标药物(AgE)与结合的(AgE 一Ab)嗨标药物分开,就可直接通过测定嗨活性的变化,求出样品含量的方法.。

  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。

化学发光免疫分析法(CLIA)
A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法:
(竞争法:用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体,待检抗原与检测信号成反比)
一、原理:本实验采用竞争法,酶标抗原与标准品抗原竞争抗体,标准品抗原浓度越大,结合到抗体上的酶标抗原越少,RLU越小,B/B
值越小。

例:A为一种抗原
小分子,有免疫反应性。

实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析,使待测A、辣根过氧化物酶标记的A(A-HRP)在均相体系中与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗A 抗体(FITC-A抗体)发生竞争性免疫反应,再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒,反应生成物结合在磁微粒上,在磁场经分离、洗涤后加发光底物,用冷光分析仪检测发光强度(RLU),测定尿液中A的含量。

二、仪器:
1、Flash’n glow LB955 30 管全自动进样冷光分析仪(Berthold 公司);
2、高速离心机(Beckman 公司), 转速13000 r/min
3、磁性分离器(北京科美生物技术有限公司定制, 磁场强度2800 高斯)
4、XW80 旋涡混合器(上海精科实业有限公司)
5、试管12 × 60 mm(浙江拱东医用塑料厂)
6、磁性微粒子(磁性分离剂, Adaltis 公司)
三、试剂
1、A标准品
2、A单克隆抗体
3、A-BSA结合物
4、抗FITC抗体包被的磁性微粒子(5mg/mL)
5、FITC标记的A单克隆抗体
6、HRP标记的A
7、PBST 洗涤液(0、05mol/L PBS, 含0、05% Tween-20)
8、分析缓冲液(0、05 mol/L 的PBS 缓冲溶液, pH 7、4, 含2、0%BSA、0、5 %的水解明胶、0、1%的Proclin-300)
9、发光底物液(鲁米诺、过氧化氢与对碘苯酚溶液)
实验用水为二次蒸馏水
四、试剂处理
1、用分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释标准品;
2、取A-BSA-HRP溶液, 以分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000 的A-BSA-HRP 溶液,4 ℃保存、 FITC-A单克隆抗体溶液的配制: 取FITC-A单克隆抗体溶液, 以分析缓冲液为稀释液,梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12000 的FITC-A单克隆抗体溶液, 4 ℃保存。

(具体分析)
五、数据处理
通过测量标准品与样品溶液的发光强度(RLU),使用Fl ash’n glow LB955 发光分析仪自带软件中的数据处理程序对测得的数据进行处理、线性方程采用的就是logit(Y)-log(X)的线性回归数学模型, 以logitY 为纵坐标, logX 为横坐标, 其线性方程表达式为logit(Y) = a + blog(X), 线性方程中 X 为标准品(或待测样品)溶液的浓度, logit(Y) =ln(y/1-y),y=B/B0,式中, B 为标准品(或待测样品)溶液的发光强度, B0 为不加标准品(或待测样品)而加分析缓冲液的发光强度、根据标准品的浓度与发光强度值, 经线性回归得标准曲线, 代入样品
的发光强度值得样品的浓度。

B、板式磁性微粒子化学发光免疫分析法(双抗体夹心法):
一、原理:以磁性微粒子作为分离固相,96孔板为反应容器,辣根过氧化
物酶(HRP)催化H2O2-liminol化学发光体系作为检测体系。

采用双抗体
夹心法,在溶液中形成FITC-抗体—抗原-HRP复合物,引入偶联FITC抗
体的磁性微粒子,在反复施加磁场的作用下,通过洗涤将没有结合的游
离蛋白与免疫复合物分离,以辣根过氧化物酶(HRP)催化H2O2-liminol
化学发光体系作为检测体系,实现对待测抗原的检测。

二、仪器
1、BHP9504 微孔板化学发光分析仪(北京滨松光子技术有限公司,
北京);
2、管式发光分析仪(Berthold 技术有限公司, 德国);
3、DEM-III 型洗板机(北京拓普分析仪器有限公司, 北京); 电热
恒温水浴箱(北京长安科学仪器公司, 北京);
4、XW-80A旋涡式震荡混合仪(上海精科实业有限公司, 上海);
5、白色不透光96-孔微孔板(英科新创科技有限公司, 厦门);
6、磁分离器采用美国Promega 公司的Magnabot 96 磁分离装置、
三、试剂
1、A标准品以及配对的A单克隆抗体均购自Fitzgerald 公司(康科
德, 美国);
2、辣根过氧化物酶(HRP)、异硫氰酸荧光素(FITC)以及Tween 20 购
自Sigma-Aldrich 公司(圣路易斯, 美国);
3、化学发光底物(鲁米诺与H2O2)来自美国的DPC 公司;
4、牛血清蛋白(BSA)购自德国的Merck 公司; 抗FITC 抗体包被的
磁颗粒悬浊液(粒径: 2、8 μm, 浓度: 5 mg/mL)购自意大利的
Adaltis 公司、
5、96 孔微孔板先用300 μL 含1% (w/V)的BSA 的磷酸缓冲液(PBS)在
4 ℃封闭12 h; 整个实验过程中的冲洗液为浓度就是0、01 mol/L 的磷
酸盐缓冲液, 含0、05%吐温-20 (V/V)、
6、正常混合人血清来自北京科美东雅生物技术有限公司, 所需血样来
自于解放军301 医院(北京)门诊及住院病人、
7、样品标本无需特殊处理, 采用常规医用技术收集全血, 静置, 离心
沉淀后, 吸取血清, 分装, 密封,-20 ℃保存备用、检测前, 血清于室温平衡30 min 后,轻微摇晃使其混匀、
四、实验方法
具体操作步骤为: 先将25μL A标准品(梯度浓度稀释)或待测血清, 40μL HRP-A抗体结合物与40μL FITC-A 抗体结合物加入到96孔板的微孔内; 在37 ℃条件下温育70 min 后, 向体系中加入80 μL 抗FITC 抗体包被的磁颗粒悬液; 再经过15 min的孵育后, 用96孔板专用磁分离器进行分离, 洗涤液清洗3次; 最后加入90μL鲁米诺与H2O2化学发光底物, 在室温下放置10 min 后进行发光测量、
C、对比。

相关文档
最新文档