核心蛋白聚糖对HuH7细胞增殖的影响及机制

核心蛋白聚糖对HuH7细胞增殖的影响

及机制

（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）

作者：上官建营窦科峰李霄胡小军, 张福琴, 雍召生, 遆振宇

【摘要】目的: 探讨核心蛋白聚糖(decorin, DCN)对HuH7细胞系体外增殖的影响及机制。方法: 加入不同浓度(0、 25、 50、 75、 100、125、 150、 200 μg/L)的DCN培养HuH7细胞系不同时间(12、 24、48、 72 h和2周), 用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)法及克隆实验测定细胞增殖速度和活力, 流式细胞术测定细胞周期和凋亡情况。结果: DCN浓度增加及作用时间延长, 细胞增殖速度减慢、活力减低, G1期细胞增多, 凋亡增加。结论: DCN可能为一种负性调控蛋白, 可通过调节细胞周期, 抑制肝癌细胞的增殖, 促进其凋亡。

【关键词】核心蛋白聚糖; HuH7; 细胞周期; 凋亡

[Abstract] AIM: To investigate the effects and mechanism of decorin( DCN) on the proliferation of HuH7 hepatoma carcinoma cell line in vitro. METHODS: Hepatoma carcinoma cells was cultured with DCN in different concentration (0, 25, 50,

75, 100, 125, 150, 200 μg/L) for different time(12, 24, 48, 72 h and 2 weeks). Cell activities were studied by MTT and clone test. The changes of cell cycle and apoptosis were analyzed by Flow cytometry. RESULTS: The proliferation of HuH7 cells could be inhibited by DCN in vitro and the inhibition effect was the time and dose dependent relationship. DCN could block cell cycle at G1 phase. Apoptosis of hepatocarcinoma cells could be efficiently induced by DCN in a time/dose dependent manner. CONCLUSION: DCN may be a negative regulatory protein inhibiting hepatoma carcinoma cell proliferation through inhibiting cell cycle and inducing apoptosis of cell in vitro.

[Keywords]decorin; HuH7; cell cycle; apoptosis

核心蛋白聚糖(decorin, DCN)是富含亮氨酸的小分子的蛋白聚糖家族中的一员, 主要由结缔组织产生, 是一种多效性分子[1]。有许多资料表明DCN是一种抗增殖因子, 能够抑制多种细胞增殖, 极可能是一种肿瘤抑制物, 使转化的细胞和肿瘤静止[2], 这提示DCN有可能成为新的抗肿瘤药物。本实验旨在探讨DCN对人肝癌细胞生长的影响及其作用机制, 为肝癌的防治提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料人类肝癌细胞HuH7细胞由本实验室提供。RPMI 1640培养基购于Gibco公司, 按说明以双蒸水溶解, 滤膜过滤除菌, 分装, -20℃冻存备用。新生牛血清为杭州四季青生物工程材料公司产

品, 经56℃ 30 min水浴灭活后, -20℃冻存备用。96孔、 6孔细胞培养板为Corning Costar公司产品。Recombinant Human Decorin(Catalog Number: 43DE)购自美国RD公司, 用PBS稀释浓度为1 000 μg/L, -20℃冻存备用。HEPA class100 CO2孵箱为Thermo 公司产品, CKX41荧光倒置显微镜为日本Olympus公司产品, 流式细胞仪为Beckman Coulter公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养HuH7细胞培养于100 mL/L新生牛血清RPMI1640培养液中, 含 105 U/L青霉素, 100 mg/L链霉素, 培养条件为37℃、 50 mL/L CO2、饱和湿度。培养的细胞均为上皮样贴壁生长, 细胞密度(0.1～1)×109/L, 每3～4 d传代1次, 取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 细胞处理取对数生长期细胞调整密度至1×109/L, 接种于96孔板, 100 μL/孔。接种24 h后换液, 分别加入含0、 25、 50、75、 100、 150、 200 μg/L DCN的培养液, 分别以PBS为空白对照、不含DCN培养液为阴性对照, 每孔设4个复孔, 分别于12、 24、48、 72 h用MTT法检测吸光度(A490值), 并绘制曲线。取对数生长期细胞接种于6孔板, 200个细胞/孔。接种24 h后换液, 分别加入含0、 25、 50、 75、 100、 125、 150 μg/L DCN的培养液, 分别以PBS为空白对照、不含DCN培养液为阴性对照培养2周, 当培养皿中出现肉眼可见的克隆时, 终止培养, 甲醇固定, 吉姆萨染色后计克隆数, 计算克隆率, 并绘制曲线。

1.2.3 流式细胞术检测细胞周期和凋亡收集对数期生长的HUH7细胞, 配成单细胞悬液(1×109/L), 与浓度为0、 25、 50、 75、 100、150 μg/L的DCN共同孵育96 h, PBS清洗, 标本用胰蛋白酶消化成细胞悬液, 其中一份标本用PBS洗涤2次并将细胞密度调整为109/L。首先用微量移液枪移取20 μL细胞悬液, 然后细胞悬液中加入Annexin V并避光静置15 min后, 将PI染料加入并静置30 min, 上机检测。另一份标本加无水乙醇固定。PBS洗涤乙醇, 取细胞悬液2 mL, 以1 500 r/min离心5 min, 弃上清, 轻轻摇动, 加入PI去污染液(含10 mL/L TritonX100)2 mL, 避光染色10 min。流式细胞仪检测, 每份标本测定20 000个细胞, 测量速率为150～200个细胞/s。用MultiCycle for Windows软件分析被采集资料。

1.2.4 统计学分析数据用x±s表示, 应用SPSS15.0软件包进行统计分析, 不同时间及浓度DCN对细胞增殖情况、细胞周期及凋亡率影响的比较采用SNK q检验, 检验水准取α=0.05。

2 结果

2.1 DCN不同浓度及时间对HuH7细胞增殖的影响 HuH7细胞经DCN作用不同时间, 其吸光度在同一时间点随作用浓度增加而逐渐降低, 说明细胞增殖随DCN浓度增加而逐渐减弱; 同一浓度DCN作用, 随着作用时间的延长, 吸光度增加速度逐渐减慢, 说明较对照组细胞增殖活力减低(图1, P0.05

2.2 DCN作用浓度对HuH7细胞增殖的影响将不同浓度DCN作用HuH7细胞96 h后吸光度(A490值)结果做统计分析(表1)。显示不同