核心蛋白聚糖对HuH7细胞增殖的影响及机制

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肝细胞生长因子(HGF)诱导肝癌Huh7细胞发生上皮间质转化(EMT)后细胞膜表面糖蛋白糖谱的变化

肝细胞生长因子(HGF)诱导肝癌Huh7细胞发生上皮间质转化(EMT)后细胞膜表面糖蛋白糖谱的变化

肝细胞生长因子(HGF)诱导肝癌Huh7细胞发生上皮间质转化(EMT)后细胞膜表面糖蛋白糖谱的变化莫翠菊;秦雪;康晓楠;彭契六;江凯;卢宇;隋靖喆;翟励敏;刘银坤【摘要】目的应用凝集素芯片技术寻找肝癌细胞表面转移相关的特征性糖谱.方法应用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)诱导建立肝癌上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)细胞模型.通过凝集素芯片比较诱导前后细胞膜的糖谱改变,采用凝集素印迹和荧光细胞凝集素免疫组化方法验证芯片结果.结果诱导后细胞对凝集素ACL、BPL、JAC、MPL、PHA-E、SBA和SNA 的亲和作用减弱,而对凝集素AAL、ConA、DBA、GSLⅡ、ECL、HAL、LCA、LTL、NML、NPL、PHA-L、PTLⅡ和WFL的亲和作用增强.提示诱导后肝癌细胞表面出现了黏蛋白T/Tn抗原、平分型N-乙酰葡萄糖胺、α2,6唾液酸和末端a或β连接的N-乙酰半乳糖胺结构减少;而末端和核心岩藻糖、高甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺p 1,6分支和复杂型寡糖分支结构增多.结论肝癌细胞发生EMT过程中细胞膜表面糖链结构改变,提示糖链结构与肝癌的转移密切相关,为有效控制肝癌转移、改善预后提供了新思路.【期刊名称】《复旦学报(医学版)》【年(卷),期】2014(041)002【总页数】7页(P198-204)【关键词】凝集素芯片;糖谱;肝癌(HCC);上皮间质转化(EMT);肝细胞生长因子(HGF)【作者】莫翠菊;秦雪;康晓楠;彭契六;江凯;卢宇;隋靖喆;翟励敏;刘银坤【作者单位】广西医科大学第一附属医院检验科南宁530021;复旦大学附属中山医院肝癌研究所上海200032;广西医科大学第一附属医院检验科南宁530021;复旦大学生物医学研究院上海200032;广西医科大学第一附属医院检验科南宁530021;复旦大学附属中山医院肝癌研究所上海200032;复旦大学生物医学研究院上海200032;广西医科大学第一附属医院检验科南宁530021;广西医科大学第一附属医院检验科南宁530021;广西医科大学第一附属医院检验科南宁530021;复旦大学附属中山医院肝癌研究所上海200032;复旦大学生物医学研究院上海200032【正文语种】中文【中图分类】R392.12蛋白质糖基化是翻译时一种重要的共修饰方式,蛋白质糖基化修饰伴随多种肿瘤的发生和侵袭转移,并会随着病情而改变[1]。

GPC3过表达对肝癌Huh-7细胞生物学功能影响的研究的开题报告

GPC3过表达对肝癌Huh-7细胞生物学功能影响的研究的开题报告

GPC3过表达对肝癌Huh-7细胞生物学功能影响的
研究的开题报告
标题:GPC3过表达对肝癌Huh-7细胞生物学功能影响的研究
背景介绍:Glypican-3(GPC3)是一种Glypican家族的膜结合型糖蛋白,在人类肝癌组织及10个肝癌细胞株中高度表达,目前认为是一种肝癌特异性抗原。

GPC3在肝癌的发生和发展中发挥着重要的作用,包括在肝癌细胞增殖、侵袭和氧化应激中的调节作用。

因此,GPC3成为肝癌诊断和治疗的一个重要靶点。

本研究旨在探讨GPC3在肝癌Huh-7细胞中的生物学功能和作用机制。

研究方法:本研究将采用基因转染技术过表达GPC3基因,以正常Huh-7细胞为对照组,通过Western blot和RT-PCR检测GPC3的表达水平。

利用MTT法和Clone Formation实验检测GPC3对Huh-7细胞增殖和生长的影响。

采用Transwell实验探讨GPC3对Huh-7细胞侵袭和迁移的影响。

并利用流式细胞术检测GPC3对Huh-7细胞氧化应激的调节作用。

预期结果:经过GPC3过表达、实验后,预计可以显著提高Huh-7细胞的增殖和生长能力;增强Huh-7细胞的侵袭和迁移能力,并且能抑制氧化应激反应。

这些结果将有助于深入研究GPC3在肝癌细胞中的作用机制,为肝癌的治疗提供新的思路和靶点。

丹酚酸B抑制HuH-7细胞的Hippo

丹酚酸B抑制HuH-7细胞的Hippo

网络出版时间:2024-01-1010:52:58 网络出版地址:https://link.cnki.net/urlid/34.1086.R.20240108.1831.032丹酚酸B抑制HuH 7细胞的Hippo/YAP通路机制研究余新梅1,李利利1,张 傲2,邓 洁3,杨 雁1(安徽医科大学1.基础医学院、2.第一临床医学院、3.第二临床医学院,安徽合肥 230032)doi:10.12360/CPB202309059文献标志码:A文章编号:1001-1978(2024)01-0106-08中国图书分类号:R967、R392 5、R392 12摘要:目的 探讨丹酚酸B(salvianolicacidB,SalB)对人肝癌HuH 7细胞是否具有抑制作用,并探讨其是否通过Hip po/YAP信号通路发挥作用。

方法 采用TGF β1(9pmol·L-1)或MST1/2抑制剂XMU MP 1(5、10μmol·L-1)刺激HuH 7细胞,用SalB(50μmol·L-1)处理HuH 7细胞。

用CCK 8和EdU检测细胞增殖情况,用细胞划痕实验检测细胞迁移情况,用免疫荧光染色法检测YAP和TAZ的表达和分布,用Westernblot检测p MST1、MST1、p YAP、YAP、p TAZ、TAZ和CTGF的蛋白表达水平。

结果 SalB抑制了TGF β1或XMU MP 1刺激的HuH 7细胞的增殖。

同时,SalB抑制了TGF β1刺激的HuH 7细胞的迁移。

值得注意的是,与XMU MP 1对HepG2细胞迁移能力的促进作用不同,XMU MP 1在本实验中不能明显促进HuH 7细胞的迁移。

此外,SalB可上调p MST1、MST1、p YAP、p TAZ的蛋白表达,降低YAP、TAZ、CTGF的表达。

结论 SalB抑制HuH 7细胞的作用可能与激活Hippo/YAP信号通路有关。

靶向抑制mir-20b降低肝癌huh-7细胞增殖、迁移和侵袭能力

靶向抑制mir-20b降低肝癌huh-7细胞增殖、迁移和侵袭能力
王敬红1,崔永兴2,彭 鹏3,于锦萍4
摘要:目的 探讨 miR20b对肝癌 HuH7细胞增殖、迁移、侵袭的影响和机制。方法 在肝癌 HuH7细胞中转染 miR20bin hibitor,分别采用 RealtimePCR评估下调效果,MTT法评估细胞增殖变化,Transwell小室评估细胞侵袭能力,Westernblot法评 估细胞中 MMP2、Ecadherin、MMP9和 vimentin蛋白水平。应用生物信息学软件预测 TCF21可能是 miR20b的靶基因,以双 荧光素酶报告系统鉴定靶向关系。在肝癌 HuH7细胞中共转染 TCF21siRNA和 miR20binhibitor,评估细胞增殖、侵袭、迁移 与细胞中 MMP2、Ecadherin、MMP9、vimentin蛋白的表达水平。结果 转染 miR20binhibitor后 HuH7细胞中 miR20b表达 水平降低[(102±011)vs(043±005)];细 胞 增 殖 [(057±006)vs(034±002)]、迁 移 [(12564±1365)vs(9214± 694)]和侵袭[(8815±932)vs(6348±62)]能力下降;MMP2、vimentin、MMP9蛋白表达水平降低;Ecadherin蛋白表达 水平升 高。miR20b靶 向 负 调 控 TCF21表 达。共 转 染 TCF21siRNA和 miR20binhibitor可 以 显 著 提 高 HuH7细 胞 增 殖 [(040±005)vs(056±006)]、迁移[(8962±925)vs(11526±1084)]和侵袭[(6825±415)vs9521±651)]能力; 提高细胞中 MMP2、vimentin、MMP9蛋白表达水平,降低 Ecadherin蛋白水平;与共转染 siRNAcontrol和 miR20binhibitor的 细胞比较,差异有统计学意义(P<005)。结论 下调 miR20b表达,可通过靶向 TCF21抑制肝癌 HuH7细胞的增殖、迁移、 侵袭和上皮 -间质转化。 关键词:肝肿瘤;miR20b;TCF21;侵袭 中图分类号:R7357 文献标志码:A 文章编号:1001-7399(2019)10-1162-06 doi:10.13315/j.cnki.cjcep.2019.10.006

TMEM64在肝癌组织中高表达并促进肝癌细胞的增殖和侵袭

TMEM64在肝癌组织中高表达并促进肝癌细胞的增殖和侵袭

TMEM64is highly expressed in hepatocellular carcinoma and promotes tumor cell proliferation and invasionCAO Danping 1,CAI Juan 2,LI Yanna 1,DONG Runyu 1,WANG Zhixiong 1,ZUO Xueliang 11Department of Gastrointestinal Surgery,2Department of Oncology,First Affiliated Hospital of Wannan Medical College (Yijishan Hospital),Wuhu 241001,China摘要:目的分析TMEM64在肝癌中的表达情况及对肝癌患者预后评估价值,探讨TMEM64对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响。

方法采用癌症基因组图谱(TCGA )数据库和基因型组织表达项目(GTEx )分析TMEM64在肝癌中表达水平。

采用Wilcoxon 秩和检验方法比较分析TMEM64基因在肝癌和癌旁组织中的表达差异。

利用Kaplan-Meier 曲线和Cox 回归分析评估TMEM64的表达水平对肝癌患者总生存期的影响及预后预测价值。

通过单样本基因富集分析评估TMEM64的表达与免疫细胞浸润水平之间的相关性。

依据TMEM64表达水平及相关临床变量构建基于总体生存率的nomogram 图并进行验证。

细胞实验中,在HCCLM3细胞中敲低TMEM64,分为si-NC (对照组)、si-TMEM64#1(敲低组1)、si-TMEM64#2(敲低组2)3个组;在Huh7细胞中过表达TMEM64,并分为vector (对照组)和TMEM64(过表达组),采用CCK-8、EdU 和克隆形成实验检测TMEM64对肝癌细胞增殖的影响,使用Transwell 和细胞划痕实验验证TMEM64对肝癌细胞迁移和侵袭能力的改变。

小柴胡汤对人肝癌细胞Huh7细胞凋亡的影响

小柴胡汤对人肝癌细胞Huh7细胞凋亡的影响

小柴胡汤对人肝癌细胞Huh7细胞凋亡的影响赵锦燕;刘丽雅;张毓宸;洪振丰【期刊名称】《世界中西医结合杂志》【年(卷),期】2016(0)6【摘要】目的观察小柴胡汤对体外培养人肝癌细胞Huh7细胞凋亡的影响及相关机制。

方法不同浓度小柴胡汤(0,0.5,1.0,1.5 mg/ml)处理人肝癌Huh7细胞24 h、48 h和72 h后,利用倒置显微镜观察细胞形态变化,MTT法检测细胞活力,Hoechst 33258染色观察不同浓度小柴胡汤对凋亡的影响,RT-PCR和Western blot检测Bax和Bcl-2的表达。

结果不同浓度小柴胡汤作用Huh7细胞24 h能不同程度抑制细胞生长,MTT结果表明小柴胡汤干预Huh7细胞24 h、48 h和72 h,能显著抑制细胞活力,呈时间和剂量依赖性;小柴胡汤作用Huh7细胞24 h,细胞呈明显的凋亡特征;RT-PCR和Western blot结果表明,小柴胡汤促进Bax表达,抑制Bcl-2表达,与对照组比较差异有统计学意义。

结论小柴胡汤促进Bax表达,抑制Bcl-2表达可能是其促进Huh7细胞凋亡的机制之一。

【总页数】4页(P746-749)【关键词】肝癌;小柴胡汤;细胞凋亡【作者】赵锦燕;刘丽雅;张毓宸;洪振丰【作者单位】福建中医药大学中西医结合研究院福建省老年性疾病重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R285【相关文献】1.QHF复方对人肝癌Huh7细胞生长、侵袭及肿瘤干细胞表面标志物表达的影响[J], 刘丹;焦良波;张文;王心怡;陈涛;胡卫2.QHF复方对人肝癌Huh7细胞生长凋亡、侵袭能力的作用及其对肿瘤干细胞表面标志物的影响 [J], 王萍;姬生威;朱晓东;罗红兰;付强3.灵芝多糖肽对肝癌细胞Huh7活性、迁移和细胞凋亡的影响 [J], 黄在兴; 刘凌云; 陈华; 翁伯琦; 林占熺; 刘朋虎4.去甲斑蝥素诱导人肝癌Huh7细胞凋亡和周期阻滞的机制研究 [J], 董秀;包红5.HBX基因对人肝癌细胞系Huh7细胞增殖和迁移的影响 [J], 卫波;成扬因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

核心蛋白聚糖对肝细胞和肝星形细胞体外增殖的影响

核心蛋白聚糖对肝细胞和肝星形细胞体外增殖的影响

核心蛋白聚糖对肝细胞和肝星形细胞体外增殖的影响王桂琴;郭彩虹;孔宪涛;仲人前;李莉;张玲珍;刘涛;王红蓓【期刊名称】《第二军医大学学报》【年(卷),期】2000(21)8【摘要】目的 :探讨核心蛋白聚糖 (decorin)在肝纤维化形成机制中的作用。

方法 :在正常人肝细胞株 L - 0 2及大鼠肝星形细胞株 HSC- T6体外培养体系中 ,分别加入不同质量浓度(0 .0 1,5 ,10μg/ m l) decorin共培养不同时间后 ,进行细胞计数以及 3H- Td R和 3H- L eu掺入量测定。

结果 :实验组经0 .0 1μg/ m l decorin 作用 4d或 6 d后 ,HSC- T6和 L- 0 2细胞增殖数量以及 3H- Td R和 3H- L eu 掺入量均显著高于对照组 (P<0 .0 1,P<0 .0 5 )。

而5 ,10μg/ m l decorin作用4d或 6 d后 ,HSC- T6和 L -0 2细胞增殖数量以及 3H- Td R掺入量均显著低于对照组 (P<0 .0 1,P<0 .0 5 )。

结论 :decorin对细胞体外增殖有双重调节作用 ;【总页数】3页(P721-723)【关键词】肝纤维化;肝细胞;肝星形细胞;细胞增殖;核心蛋白聚糖【作者】王桂琴;郭彩虹;孔宪涛;仲人前;李莉;张玲珍;刘涛;王红蓓【作者单位】第二军医大学长征医院临床实验科;太原市第二人民医院;长海医院药学部【正文语种】中文【中图分类】R575.2【相关文献】1.复方鳖甲软肝方药物血清对大鼠肝星形细胞增殖细胞核抗原表达的影响 [J], 张玮;郭顺根;谢艳爽;赵海军;贾文亭;庞亦辉;戚红丹2.重组人源白细胞介素-24联合重组人源核心蛋白聚糖对人类肝细胞癌HepG2细胞增殖抑制和凋亡诱导协同效应的研究 [J], 于培霞;杨云;王桂琴3.促肝细胞生长素对体外培养成人肝细胞增殖和细胞周期的影响 [J], 王华利;赵伟;杨永峰4.肝切除患者血清对体外培养肝细胞增殖能力的影响 [J], 邢谦哲;高英堂;骆莹;王毅军;杜智5.清肝活血方对乙醇性肝纤维化大鼠肝星形细胞和肝细胞凋亡的影响 [J], 王磊;柳涛;郑培永;邢练军;季光因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

丙型肝炎病毒核心蛋白稳定表达肝癌细胞株的构建及生物学研究

丙型肝炎病毒核心蛋白稳定表达肝癌细胞株的构建及生物学研究

·研究报告·生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2012年第1期收稿日期: 2011-06-21基金项目:国家自然科学基金资助项目(30972586),重庆市自然科学基金重点项目(CSTC,2009BA5036)作者简介:单晓亮,男,硕士,研究方向:病毒性肝炎的发病机制; E -mail:shanxiaoliang2@ 通讯作者:唐霓,女,博士,研究方向:病毒性肝炎的发病机制; E -mail:nitang809@丙型肝炎病毒核心蛋白稳定表达肝癌细胞株的构建及生物学研究单晓亮 刘娇 陈庆美 周帆 陈林林 权会琴 唐霓(重庆医科大学附属第二医院病毒性肝炎研究所 感染性疾病分子生物学教育部重点实验室,重庆 400016)摘 要: 旨在构建稳定表达HCV 核心蛋白的稳定细胞系Huh7-Core 并进行初步的生物学功能研究。

利用PCR 技术扩增HCV 核心蛋白基因,通过酶切连接反应将目的基因克隆至载体pSEB -3Flag 中,将重组质粒pSEB -3F -Core 和辅助质粒pAmpho 共转染Huh7细胞,经过Blasticidine 抗性筛选,建立稳定表达HCV 核心蛋白的肝癌细胞系Huh7-Core 。

采用RT -PCR 、Western blot 鉴定Huh7-Core 细胞株中核心蛋白的稳定表达并采用MTS 、结晶紫试验观察Huh7-Core 稳定细胞株的增殖情况。

结果显示,成功构建了表达HCV 核心蛋白的稳定细胞株Huh7-Core 。

结晶紫、MTS 试验证实Huh7-Core 细胞较Huh7-3Flag 细胞增殖速度增快,表达HCV 核心蛋白的Huh7-Core 稳定细胞株构建成功,Core 稳定表达后可促进Huh7细胞生长速度。

关键词: 丙型肝炎病毒 核心蛋白 生物学功能 稳定细胞株 细胞增殖Development of a Hepatoma Stable Cell Line ExpressingHCV Core ProteinShan Xiaoliang Liu Jiao Chen Qingmei Zhou Fan Chen Linlin Quan Huiqin Tang Ni(The Second Affiliated Hospital and the Key Laboratory of Molecular Biology of Infectious Diseases Designated by the Chinese Ministry ofEducation ,Chongqing Medical University ,Chongqing 400016)Abstract: It was to develop a hepatoma stable cell line expressing HCV core protein and to investigate the biological function of HCV core protein. HCV core genes was amplified by PCR methods, and then cloned into plasmid pSEB -3Flag by restriction enzyme digestion. Hepatoma cell line Huh7 were cotransfected with the recombinant plasmid pSEB -3Flag -Core and pAmpho. Stable cells Huh7-Core were screened with antibiotics blasticidine. HCV core gene expression was detected with RT -PCR and Western blot assay. The cell growth of stable cell line Huh7-Core was determined by MTS assay, crystal violet staining method. Results showed that Hepatoma cell lines Huh7-Core successfully express core genes, and core protein expression was verified by Western blot analysis. Cell proliferation rate of Huh7-Core was significantly accelerated, compared with Huh7 parental cells. A hepatoma stable cell line expressing HCV core protein has been successfully established. Stable overexpression of core protein sharply promoted hepatoma cells proliferation.Key words: HCV Core protein Biological function Stable cell line Cell proliferation丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)感染是较严重的全球公共问题之一,是导致肝硬化甚至肝癌的重要病因。

Akt抑制剂MK-2206对肝癌细胞huh7生物学行为的影响及机制

Akt抑制剂MK-2206对肝癌细胞huh7生物学行为的影响及机制

Akt抑制剂MK-2206对肝癌细胞huh7生物学行为的影响及机制熊琳;何晓琴;范黎;徐细明【摘要】目的探讨MK-2206作用于肝癌细胞huh7后对其生物学行为的影响及作用机制.方法体外培养人肝癌细胞系huh7,采用不同浓度(0、2.5、5、10、20、40μmol/L) MK-2206干预huh7细胞.采用CCK-8检测细胞增殖变化;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;蛋白免疫印迹法检测相关蛋白的表达.结果与对照组(0μmol/L)比较,MK-2206对肝癌细胞huh7的增殖活性有明显抑制作用,且呈剂量依赖性和时间依赖性(P<0.05);MK-2206诱导huh7细胞凋亡(P<0.05),显著抑制Akt的蛋白表达(P<0.05).结论 Akt抑制剂MK-2206可通过调控PI3K/Akt信号通路来调控肝癌细胞huh7的生物学行为.【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2019(016)001【总页数】5页(P8-11,15)【关键词】肝癌;PI3K/Akt信号通路;MK-2206;增殖;迁移;凋亡【作者】熊琳;何晓琴;范黎;徐细明【作者单位】武汉大学人民医院肿瘤中心,湖北武汉430060;武汉大学人民医院肿瘤中心,湖北武汉430060;武汉大学人民医院肿瘤中心,湖北武汉430060;武汉大学人民医院肿瘤中心,湖北武汉430060【正文语种】中文【中图分类】R735.7肝癌是世界第六大常见癌症,也是发生癌症相关死亡的第三大原因,近年来其发病率及死亡率仍呈上升趋势[1]。

我国肝癌患者人数占全世界肝癌患者的55%[2]。

手术切除是肝癌的首选治疗方法,但肝癌发病隐匿,恶性程度高,进展速度快,根治性手术仅可用于不足30%的患者[3]。

因此,系统性治疗在中晚期肝癌患者的治疗中扮演着重要角色。

传统的化疗方法副作用大,疗效不佳,易耐药[4]。

分子靶向药物索拉非尼可改善中晚期肝癌患者生存期,但其仅可延长总体生存期数月[5-6]。

总结肝癌细胞huh7细胞培养方法

总结肝癌细胞huh7细胞培养方法

肝癌是一种常见的恶性肿瘤,对人类健康造成了严重威胁。

在肝癌的研究中,huh7细胞是被广泛应用的细胞系,因其具有类似肝细胞的特性而成为了科研领域中的热门对象。

而huh7细胞的培养方法也是非常重要的,能够影响到细胞的生长、稳定性以及实验结果的准确性。

1. 选材与准备在进行huh7细胞培养之前,首先需要准备好所需的培养基、细胞培养器具以及待培养的细胞。

培养基的选择是非常重要的,常见的培养基包括DMEM、RPMI-1640等,可以根据实验的需要来选择合适的培养基。

在培养之前需要将细胞冻存液缓慢解冻,并用预热的培养基进行稀释和洗涤。

2. 细胞培养条件huh7细胞的培养条件也是非常重要的,包括培养温度、CO2浓度、培养时间等因素。

一般来说,huh7细胞的培养温度为37摄氏度,CO2浓度为5,培养时间则根据实验的需要而定,通常为24-72小时。

3. 细胞的传代细胞的传代是维持细胞品质和数量的重要步骤。

当huh7细胞达到80-90的密度时,即可进行细胞的传代。

传代的具体步骤包括用PBS洗涤细胞,加入胰酶进行消化,离心沉淀细胞,弃去上清液,用新的培养基重新悬浮细胞。

4. 细胞的检测与鉴定在细胞培养过程中,需要对细胞的纯度、活性等指标进行检测与鉴定。

常见的方法包括细胞形态学观察、酶活性检测、核型分析等,通过这些方法可以对细胞的稳定性和纯度进行评估。

5. 细胞的应用huh7细胞在肝癌研究中有着广泛的应用,包括细胞的增殖、凋亡、侵袭、耐药性等方面。

通过对huh7细胞的培养和实验,可以更深入地了解肝癌的发生机制和治疗策略,为临床治疗提供重要的科学依据。

huh7细胞的培养方法对于肝癌的研究具有非常重要的意义。

只有掌握了正确的培养方法,才能够保证细胞的稳定性和实验结果的准确性,为科研工作的顺利进行提供保障。

希望通过本篇文章的介绍,能够对huh7细胞的培养方法有更加全面的了解,为肝癌研究的开展提供帮助。

在继续探讨huh7细胞的培养方法时,我们可以深入了解细胞培养的关键步骤以及一些技巧和注意事项,以确保细胞的生长和稳定性。

氢分子对肝癌细胞Huh7 的影响

氢分子对肝癌细胞Huh7 的影响

生物技术进展2020年㊀第10卷㊀第4期㊀400~408CurrentBiotechnology㊀ISSN2095 ̄2341研究论文Articles㊀收稿日期:2020 ̄03 ̄05ꎻ接受日期:2020 ̄04 ̄15㊀基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(31500828)ꎮ㊀联系方式:商蕾E ̄mail:shanglei@emails.bjut.edu.cnꎻ∗通信作者马雪梅E ̄mail:xmma@bjut.edu.cn氢分子对肝癌细胞Huh7的影响商蕾ꎬ㊀李佳腊ꎬ㊀苏泽华ꎬ㊀谢飞ꎬ㊀马雪梅∗北京工业大学生命科学与生物工程学院ꎬ北京100124摘㊀要:氢分子对癌症等疾病具有良好的治疗或改善效果ꎬ并且获得简单㊁使用简便且无副作用ꎮ为了明确氢分子对肝癌细胞Huh7的影响ꎬ从细胞活性㊁细胞周期和凋亡㊁细胞成瘤能力㊁细胞迁移侵袭等方面研究了氢分子对肝癌细胞Huh7的作用效果ꎮ细胞活性检测(CCK ̄8法)结果表明ꎬ氢分子对Huh7细胞活性具有明显的抑制效果ꎮ细胞成瘤能力实验中ꎬ克隆球实验显示ꎬ含氢培养基组(H)细胞成球数目有所减少ꎬ同时克隆球直径大小显著降低(P<0.0001)ꎻ平板克隆实验显示ꎬH组细胞克隆的数量也显著减少(P<0.001)ꎬ说明氢分子可以抑制Huh7细胞的干性ꎮ氢分子对Huh7细胞周期的影响也较为明显ꎬ且具有促凋亡的作用和抑制细胞迁移与浸润的效果ꎮ同时ꎬ氢分子对细胞内中间丝波形蛋白的表达也具有抑制作用ꎮ研究表明ꎬ氢分子降低了Huh7细胞的活性和增殖能力ꎬ减弱了Huh7细胞的干性ꎬ同时抑制了细胞侵袭及迁移的能力ꎬ降低了细胞波形蛋白的表达ꎬ为氢分子用于肝癌防治提供了一定的实验基础ꎮ关键词:氢分子ꎻ肝癌ꎻ肿瘤防治DOI:10.19586/j.2095 ̄2341.2020.0024EffectsofMolecularHydrogenonLiverCancerCellsHuh7SHANGLeiꎬLIJialaꎬSUZehuaꎬXIEFeiꎬMAXuemei∗CollegeofLifeScienceandBioengineeringꎬBeijingUniversityofTechnologyꎬBeijing100124ꎬChinaAbstract:Theeffectsofmolecularhydrogenonvariousdiseasessuchascancerarepredictable.Itissimpletoobtainꎬeasytouseandfreeofsideeffects.InordertoclarifytheeffectofmolecularhydrogenonhepatomacellHuh7ꎬtheeffectofmolecularhydrogenonHuh7cellswasstudiedfromtheaspectsofcellviabilityꎬcellcycleandapoptosisꎬcellneoplasmformationꎬcellmigrationandinvasion.Theresultsofcellviabilitytest(CCK ̄8method)showedthatmolecularhydrogenhadobviousinhibitoryeffectonHuh7cellactivity.Intheexperimentofcellneoplasmformationꎬthecloneballexperimentshowedthatthenumberofcellglobulesinthehydrogen ̄containingmediumgroup(H)decreasedꎬwhilethediameterofcloneballdecreasedsignificantly(P<0.0001).TheplatecloningexperimentshowedthatthenumberofcellclonesingroupHalsodecreasedsignificantly(P<0 001)ꎬindicatingthatmolecularhydrogencaninhibitthedrynessofHuh7cells.MolecularhydrogenalsohadobviouseffectsonHuh7cellcycleꎬandhadtheeffectsofpromotingapoptosisandinhibitingcellmigrationandinfiltration.Atthesametimeꎬhydrogenmoleculescouldalsoinhibittheexpressionofvimentinincells.StudiesshowedthathydrogenmoleculesreducedtheactivityandproliferationabilityofHuh7cellsꎬweakenedthedrynessofHuh7cellsꎬinhibitedthecellinvasionandmigrationabilityꎬandreducedtheexpressionofcellularvimentinꎬwhichprovidedacertainexperimentalbasisfortheapplicationofhydrogenmoleculesinthepreventionandtreatmentoflivercancer.Keywords:molecularhydrogenꎻlivercancerꎻcancerpreventionandtreatment㊀㊀肝癌是最常见的恶性肿瘤之一ꎬ据2018年的世界卫生组织发布的世界癌症报告称ꎬ目前肝癌的患病人数在全球男性中排名第五ꎬ女性中排名第九ꎬ死亡人数全球排名分别为第二和第六[1]ꎮ常见的致病因素有:乙型肝炎病毒㊁丙型肝炎病毒㊁肝硬化㊁酒精性肝炎㊁非酒精性脂肪肝炎㊁肝炎病毒感染㊁黄曲霉素污染的食物等[2 ̄8]ꎬ其中大约75%的肝癌病例是由乙型肝炎病毒与丙型肝炎病毒导致的肝硬化引发的[9]ꎮ在肝㊁肺㊁结肠和胃等4种恶性肿瘤中[10]ꎬ我国每年约有13万患者. All Rights Reserved.死于肝癌ꎬ占全世界肝癌病死总人数的45%ꎬ且每年新发46万人ꎬ占全世界的55%ꎬ属于肝癌多发和高发国家[11]ꎮ这跟我国是肝炎高发病率的国家密切相关[9]ꎮ国际肝癌疾病研究协会数据显示ꎬ肝癌的病死高发人群逐渐向青壮年偏移[12 ̄13]ꎮ且因肝癌具有多复发㊁转移性强和耐药等特点ꎬ使得临床治疗中多种治疗方式对于肝癌的治疗效果均不理想ꎬ且肝癌患者的预后及恢复效果也极差[14]ꎮ因此ꎬ减少肝癌的转移和复发是目前的研究重点ꎮ作为自然界最简单的分子ꎬ氢分子长期以来被人们认为是一种生理惰性气体ꎬ而近十几年来ꎬ氢分子医学领域发展十分迅速ꎬ并在各种疾病中展现出多种生物学效应ꎬ包括缓解创伤炎症㊁控制代谢疾病㊁缓解有机磷农药引起的神经毒性以及抑制肿瘤生成等[15]ꎮ氢分子发挥生物学作用的机理尚无定论ꎬ其可能通过选择性清除毒性自由基来抑制氧化应激反应ꎬ也可能通过作用于生物酶或调节细胞内信号分子来发挥作用[16 ̄20]ꎮLi等[21]研究肾细胞癌时发现ꎬ氢分子可防治次氮基三乙酸铁诱导的肾脏毒性和致癌性ꎮ研究显示ꎬ饮用富氢水可以显著降低组织中丙二醛(malond ̄ialdehydeꎬMDA)和过氧化亚硝酸盐的含量ꎬ从而降低氧化应激水平㊁缓解炎症反应ꎬ进而减弱次氮基三乙酸铁诱导的大鼠肾毒性ꎬ减轻大鼠的肾脏损伤并抑制其肿瘤早期发展ꎬ证明富氢水能够通过抗氧化和抗炎症作用达到对次氮基三乙酸铁诱导的肾毒性和致癌性的防治效果[21]ꎮ此外ꎬ氢分子还能减轻恶性肿瘤治疗所引发的副作用ꎮ如Kang等[22]的研究表明ꎬ通过让放疗期间的肝癌患者饮用6周富氢水ꎬ可以显著降低肝癌患者血液中活性氧代谢产物并维持了血液中的氧化电势ꎬ提高患者的生活质量ꎬ提示氢分子能通过减少辐射诱导的氧化应激反应ꎬ来减少放射治疗的副作用ꎮ目前ꎬ氢气的介入方法主要集中在以下方面:呼吸氢气㊁富氢水饮用㊁富氢生理盐水注射㊁氢气浴㊁氢气滴眼液以及肠道氢气介入等等ꎬ分别应用于不同疾病的治疗或动物/细胞模型的研究[23]ꎮ本研究采用含氢培养基对人肝癌细胞Huh7进行处理ꎬ使用CCK ̄8法检测细胞增殖活性ꎬ流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况ꎬ悬浮培养克隆球和平板克隆实验检测细胞成球能力和细胞干性ꎬ细胞划痕实验和Transwell小室实验分别检测细胞迁移和侵袭的能力ꎬ细胞免疫荧光实验检测波形蛋白的表达情况ꎬ从而研究氢分子对肝癌细胞Huh7的影响ꎬ以期增加肝癌病人的生存率㊁提高患者的生活质量ꎬ并为氢分子对肝癌疾病的预防和治疗提供实验依据和理论基础ꎮ1㊀材料与方法1㊀实验材料人肝癌细胞Huh7细胞株由北京大学第三医院惠赠ꎮCCK ̄8购于东仁化学科技(上海)有限公司ꎻ富氢水发生器购于上海潓美医疗科技有限公司ꎻRPMI ̄1640培养基㊁DMEM/F12培养基㊁青链霉素(100ˑ)㊁胎牛血清(fetalbovineserumꎬFBS)㊁B27无血清添加剂㊁碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactorꎬbFGF)㊁表皮生长因子(epidermalgrowthfactorꎬEGF)㊁0.25%Trypsin ̄EDTA购于美国Gibco公司ꎻ细胞周期检测试剂盒和凋亡检测试剂盒购于美国Millipore公司ꎻMatrigel基质胶购于美国BD公司ꎮ1.2㊀实验方法1.2.1㊀含氢培养基的制备㊀将氢气发生器接出的硅胶管放入含培养基的50mL离心管中ꎬ在离心管的盖子上剪出1个比硅胶管稍大一些的小孔ꎬ保证能让小管插入至底部ꎬ并且在硅胶管中间接入1个0.22μm的过滤器使气体进入培养基时过滤掉细菌等ꎻ打开制氢机开始产生氢气ꎬ会看到培养基里的硅胶管有气泡冒出ꎬ持续通入氢气约1hꎬ保持氢气达到饱和后进行下一步使用ꎮ1.2.2㊀细胞培养㊀细胞培养的过程一般有细胞复苏㊁培养㊁传代和冻存4个部分ꎬ具体实验方法参照商蕾等[24]的研究ꎮ实验分为2组:含氢培养基组(H)和对照组(Cꎬ即不通氢气的培养基)ꎮ1.2.3㊀细胞计数方法㊀采用常用的台盼蓝染料浸染细胞方法进行细胞计数ꎬ通过活细胞的细胞膜具有选择通透性这一特点来区分ꎮ具体实验方法参照商蕾等[24]的研究ꎮ1.2.4㊀细胞活性测定(CCK ̄8法)㊀CCK ̄8法是较为常用的用于测定细胞增殖或细胞毒性试验中活细胞数目的一种方法ꎬ具有高灵敏度ꎬ无放射性的特点ꎮ本研究利用该方法检测在450nm处的吸收峰来判断细胞活性情况ꎬ以确定氢分子对104商蕾ꎬ等:氢分子对肝癌细胞Huh7的影响. All Rights Reserved.Huh7细胞活性的影响ꎮ具体实验方法参照商蕾等[24]的研究ꎮ1.2.5㊀细胞周期检测㊀收集对数生长期的细胞并计数ꎬ调至细胞浓度1ˑ105cells mL-1ꎬ在六孔板中每孔接种20万细胞ꎮ置于培养箱中培养24hꎬ然后根据实验分组用移液器吸去孔板中的培养基ꎬ每孔替换普通培养基或含氢培养基ꎬ继续培养24hꎮ取出六孔板ꎬ收集细胞用70%冰乙醇固定ꎬ4ħ静置过夜ꎮ第2天取出固定后的细胞ꎬ用PBS洗去固定液ꎬ加入200μL细胞周期检测试剂ꎬ室温避光孵育20min后ꎬ上机进行流式检测ꎮ1.2.6㊀细胞凋亡检测㊀收集对数生长期的细胞并计数ꎬ调至细胞浓度1ˑ105cells mL-1ꎬ在六孔板中每孔接种20万细胞ꎮ置于培养箱中培养24hꎬ然后根据实验分组用移液器吸去孔板中的培养基ꎬ每孔替换普通培养基或含氢培养基ꎬ继续培养24hꎮ取出六孔板ꎬ收集细胞ꎬ用1%FBS的PBS清洗2遍ꎬ离心后用1%FBS的PBS重悬ꎬ然后加入100μL细胞凋亡检测试剂ꎬ室温避光孵育20min后ꎬ上机进行流式检测ꎮ1.2.7㊀细胞克隆球形成实验㊀采用Huh7细胞进行细胞克隆球形成实验ꎬ具体实验方法参照商蕾等[24]的研究ꎮ通过克隆球的形成效率ꎬ来研究氢分子对Huh7细胞克隆球形成的影响ꎮ1.2.8㊀细胞平板克隆实验㊀采用Huh7细胞进行细胞平板克隆实验ꎬ具体实验方法参照商蕾等[24]的研究ꎮ通过观察细胞形成克隆的能力ꎬ来研究氢分子对Huh7细胞的成瘤率的影响ꎮ1.2.9㊀细胞划痕实验㊀采用Huh7细胞进行细胞划痕实验ꎬ具体实验方法参照商蕾等[24]的研究ꎮ通过观察细胞迁移的情况ꎬ来研究氢分子对Huh7细胞迁移能力的影响ꎮ1.2.10㊀细胞侵袭实验㊀采用Huh7细胞进行细胞侵袭实验ꎬ具体实验方法参照商蕾等[24]的研究ꎮ通过观察细胞侵袭的情况ꎬ来研究氢分子对Huh7细胞侵袭能力的影响ꎮ1.2.11㊀细胞免疫荧光㊀采用Huh7细胞进行细胞免疫荧光实验ꎬ具体实验方法参照商蕾等[24]的研究ꎮ通过观察波形蛋白的表达情况ꎬ来研究氢分子对Huh7细胞中波形蛋白表达的影响ꎮ1.3㊀统计学分析本研究采用统计软件GraphPadPrism6.01版本分析所有数据资料ꎮ在符合正态性和方差齐性的前提下ꎬ以均数ʃ标准差(MʃS)进行统计学描述ꎻ统计推断则采用t检验(t ̄test)ꎮ2㊀结果与分析2.1㊀富氢培养基的制备为了研究氢分子在体外对肝癌细胞系的作用ꎬ首先需要制备含有一定氢气浓度的细胞培养基ꎮ利用氢气发生器ꎬ将其产生的氢气通过硅胶管接入RPMI ̄1640培养基中ꎬ1h后使用氢电极对培养基中的氢浓度进行检测ꎬ检测过程中培养基保持稳定不晃动ꎬ这可以使氢气不会因人为原因快速逸出ꎮ如图1所示ꎬ含氢培养基组(H)的氢浓度与对照组(C)相比ꎬC组的氢气浓度是远远低于H组的ꎮ在0min左右时检测到含氢培养基的氢浓度最高为1.6mg L-1ꎬ由于氢气在水中的溶解度极低ꎬ因此C组中培养基的氢浓度保持不变ꎬ只有0.02mg L-1ꎮ同时图中显示ꎬ0~60min内培养基中的氢浓度变化不大ꎬ表明氢浓度已经达到饱和ꎬ并且在相对较长的时间内保持较高的浓度ꎮ该结果表明使用氢气发生器可以制备含氢培养基ꎬ并在一定的时间内保持有效浓度ꎮ图1㊀细胞培养基中氢浓度变化Fig.1㊀Hydrogenconcentrationincellculturemedium2.2㊀氢分子对肝癌细胞活性的影响按分组采用不同培养基处理Huh7细胞不同时间ꎬ用CCK ̄8法检测氢分子对Huh7细胞的活性的影响ꎬ通过在450nm吸收峰处定时检测ꎬ可反映出Huh7细胞在不同处理条件下的增殖水平204生物技术进展CurrentBiotechnology. All Rights Reserved.和生长状态ꎮ本研究监测了Huh7细胞在120h内的生长情况ꎬ结果如下图2所示ꎮ与C组相比ꎬ氢分子处理Huh7细胞后ꎬ细胞在前24h内的生长没有明显变化ꎬ24h后H组细胞增殖速率明显低于C组ꎬ在72h和120h具有显著性差异(P<0.05)ꎻ在120h内ꎬ细胞的总体增长速率小于C组ꎬ且细胞活性始终低于C组ꎮ结果表明ꎬ氢分子能够在一定程度上抑制Huh7细胞的生长ꎬ降低细胞的活性ꎬ且氢分子在抑制细胞活性的同时对细胞本身没有明显的毒性作用ꎮ注:∗ H组与C组间的差异在P<0.05水平上具有统计学意义ꎮ图2㊀氢分子对Huh7细胞系细胞活性的影响Fig.2㊀GrowthratechangeofHuh7cellsafterH2treated2.3㊀氢分子对肝癌细胞系细胞周期的影响细胞周期反映了细胞从上一次分裂结束至下一次分裂开始的过程ꎬ细胞周期异常是肿瘤细胞的重要特性之一ꎮ在正常细胞中ꎬ细胞周期受多种信号通路调控ꎬ细胞有序的生长㊁进行DNA复制及分裂等活动[25]ꎮ这一过程涉及的机制可确保细胞的正常生长ꎬ若机制出现错误ꎬ细胞的凋亡通路便会被激活ꎬ并调控细胞程序性死亡ꎮ在肿瘤中ꎬ由于基因突变等原因ꎬ细胞周期调控出现异常ꎬ最终导致肿瘤细胞增殖失控ꎬ细胞DNA大量复制ꎬ细胞不断分裂ꎬ增殖速度加快ꎮ已知CCK ̄8法检测结果表明氢分子能够抑制肝癌细胞的活性ꎬ因此ꎬ为了进一步探讨氢分子对肝癌细胞增殖水平的影响ꎬ本实验按分组采用不同培养基处理Huh7细胞24hꎬ通过流式细胞术来检测细胞周期情况ꎬ探讨氢分子对肿瘤细胞周期的影响ꎮ如图3所示ꎬ细胞周期G0/G1期为DNA合成前期ꎬ在此期间主要合成DNA复制所需的RNA和核糖体ꎻS期为DNA合成期ꎬ在此期间DNA大量复制ꎻG2/M期为DNA合成后期ꎬ是有丝分裂的准备期ꎬ此时DNA终止合成ꎬ为细胞有丝分裂做好准备ꎮ氢分子处理后ꎬHuh7细胞的G0/G1期细胞数显著减少(P<0.01)ꎻS期细胞数增加ꎬ虽无显著性差异ꎬ但是柱状图呈现了上升的A:流式细胞仪周期结果图ꎻB:氢分子对Huh7细胞周期的影响ꎻ∗∗ H组与C组间的差异在P<0.01水平上具有统计学意义ꎮ图3㊀氢分子对Huh7细胞周期的影响Fig.3㊀CellcyclechangeofHuh7cellsafterH2treatedfor24h304商蕾ꎬ等:氢分子对肝癌细胞Huh7的影响. All Rights Reserved.趋势ꎻG2/M期细胞数显著增加(P<0.01)ꎮ说明氢分子处理Huh7细胞后ꎬ引起了细胞G2/M期阻滞ꎬ导致进入G0/G1期的细胞减少ꎬ进而影响了细胞的增殖ꎮ结合CCK ̄8法检测结果来看ꎬ流式细胞术检测得到的细胞周期结果与其相对应ꎬ说明氢分子可能是通过影响细胞周期从而抑制肿瘤细胞的增殖ꎮ2.4㊀氢分子对肝癌细胞系细胞凋亡的影响细胞凋亡即细胞程序性死亡ꎬ是细胞自主进行的死亡过程ꎬ肿瘤细胞由于基因突变等原因ꎬ通常具有一定的抗凋亡机制ꎮ为了进一步验证氢分子对肝癌细胞凋亡水平的影响ꎬ本实验按分组采用普通培养基和含氢培养基处理Huh7细胞24hꎬ通过流式细胞术检测Huh7细胞不同凋亡时期的变化ꎬ来探讨氢分子对Huh7细胞凋亡的影响ꎮ图4表示氢分子对Huh7细胞凋亡的影响ꎮ与C组相比ꎬ氢分子处理后ꎬHuh7正常细胞数显著增加(P<0.0001)ꎬ早期凋亡细胞数基本没有变化ꎬ晚期凋亡细胞数显著增加(P<0.05)ꎬ坏死细胞数显著减少(P<0.0001)ꎬ说明氢分子处理对Huh7细胞的主要作用可能是促进其晚期凋亡ꎮ凋亡实验结果表明ꎬ氢分子处理后ꎬ能够在晚期凋亡阶段促进肝癌细胞的凋亡水平ꎬ从而抑制肿瘤细胞的增殖ꎮA:流式细胞仪凋亡结果图ꎻB:氢分子对Huh7细胞凋亡的影响ꎻ∗和∗∗∗∗分别表示H组与C组间的差异在P<0.05和P<0.0001水平上具有统计学意义ꎮ图4㊀氢分子对Huh7细胞凋亡的影响Fig.4㊀CellapoptosischangeofHuh7cellsafterH2treatedfor24h2.5㊀氢分子对细胞悬浮克隆球形成的影响通过统计克隆球形成数目即可对肝癌细胞样本及不同处理对其自我更新能力的影响进行分析ꎮ克隆球的形成率间接反映细胞系中干细胞的比例ꎮ按分组采用不含血清的普通培养基和含氢培养基培养悬浮克隆球ꎬ来研究氢分子对Huh7细胞克隆球形成的影响ꎮ图5表示氢分子对Huh7细胞克隆球形成的影响ꎮHuh7细胞虽然能形成克隆球ꎬ但克隆球数量较少ꎬ与C组相比ꎬH组的克隆球数量虽然有所减少ꎬ但没有显著性差异ꎻ与C组相比ꎬH组的克隆球直径显著变小(P<0.0001)ꎮ表明氢分子可以抑制Huh7细胞形成克隆球的数量和大小ꎬ进而说明氢分子对肝癌细胞的干性有一定的抑制作用ꎮ404生物技术进展CurrentBiotechnology. All Rights Reserved.A:克隆球显微镜拍照(40ˑ)ꎻB:克隆球形成数目及平均直径ꎻ∗∗∗∗ H组与C组间的差异在P<0.0001水平上具有统计学意义ꎮ图5㊀氢分子对Huh7细胞悬浮克隆球形成的影响Fig.5㊀SuspensioncloningballchangeofHuh7cellsafterH2treated2.6㊀氢分子对肝癌细胞系单克隆形成的影响按分组采用不同培养基培养细胞ꎬ观察Huh7细胞形成克隆能力ꎬ以检验氢分子对Huh7细胞形成克隆的影响ꎬ探讨氢分子对肝癌细胞成瘤率的影响ꎮ结果如图6所示ꎬ加入氢分子后ꎬHuh7细胞的克隆形成数显著减少(P<0.001)ꎮ实验结A:细胞平板克隆染色图ꎬ染色深浅与细胞形成的克隆数量成正比ꎻB:细胞形成克隆的计数图ꎻ∗∗∗表示H组与C组间的差异在P<0.001水平上具有统计学意义ꎮ图6㊀氢分子对Huh7细胞克隆形成的影响Fig.6㊀CloneformationchangesafterH2treated果表明氢分子能够显著抑制Huh7细胞在体外形成细胞克隆群ꎬ并且抑制肿瘤细胞的活性及无限增殖的能力ꎬ对癌症的进展具有一定的抑制作用ꎮ2.7㊀氢分子对肝癌细胞系迁移的影响肝癌难以治愈的重要原因就是其复发和易转移的特性ꎬ而肝癌的转移与肿瘤细胞的迁移能力密切关联ꎮ因此ꎬ采用划痕实验ꎬ按分组加入普通培养基和含氢培养基处理Huh7细胞ꎬ观察细胞迁移的情况ꎬ从而探讨氢分子对Huh7细胞迁移能力的影响ꎮ图7表示氢分子对Huh7细胞迁移能力的影响ꎮ经过24h的继续培养ꎬ细胞开始向中间移动ꎬHuh7细胞C组移动较快ꎬ加入含氢培养基后ꎬ细胞迁移能力显著降低(P<0.01)ꎮ结果表明氢分子处理后ꎬHuh7细胞的迁移能力受到明显抑制ꎬ表明氢分子对肝癌的转移具有一定的抑制作用ꎮ2.8㊀氢分子对肝癌细胞系浸润的影响通过迁移实验可以得知ꎬ氢分子能够抑制肝癌细胞形变移动ꎮTranswell实验中ꎬ细胞若要模拟肿瘤细胞的侵袭作用既需要将胞外基质Matrigel通过自身分解酶类降解ꎬ又需要形变穿过小于自身体积的膜孔ꎮ因此ꎬ通过Transwell小室模拟肿瘤细胞在体内侵袭转移的过程ꎬ进一步验证加入氢分子对Huh7细胞的侵袭能力的影响ꎬ同时观察细胞侵袭的情况ꎮ504商蕾ꎬ等:氢分子对肝癌细胞Huh7的影响. All Rights Reserved.图8表示氢分子对Huh7细胞的侵袭结果ꎬ图A中染色越深说明细胞穿过基底膜的数量越多ꎮ染色结果显示ꎬ在普通培养基中的肝癌细胞A:细胞划痕显微拍照ꎻB:细胞迁移率ꎻ∗∗表示H组与C组间的差异在P<0.01水平上具有统计学意义ꎮ图7㊀氢分子对Huh7细胞迁移的影响Fig.7㊀CellmigrationchangesofHuh7cellsafterH2treatedA:细胞显微拍照ꎻB:细胞穿过小室计数图ꎻ∗∗∗∗表示H组与C组间的差异在P<0.0001水平上具有统计学意义ꎮ图8㊀氢分子对Huh7细胞侵袭的影响Fig.8㊀CellinvasionchangesofHuh7afterH2treated侵袭能力较强ꎬ而含氢培养基中的细胞侵袭能力明显降低ꎮ细胞计数结果表明ꎬH组的Huh7细胞穿孔细胞数较C组显著减少(P<0.0001)ꎬ侵袭抑制效果非常明显ꎮ该实验结果表明ꎬ氢分子可能抑制Huh7细胞的侵袭能力ꎬ对肝癌的转移具有一定的抑制效果ꎮ该实验结果与细胞划痕实验相一致ꎬ说明氢分子能够抑制肝癌细胞的运动能力ꎬ从而抑制肿瘤的转移ꎮ2.9㊀氢分子对肝癌细胞系中波形蛋白表达的影响波形蛋白(vimentin)作为细胞中间丝的一种ꎬ其动态性质对细胞的灵活性非常重要ꎬ波形蛋白分布情况为从细胞核到细胞膜放射状分布ꎬ在维持和调节细胞功能中有着重要作用ꎬ负责维持细胞骨架的完整性[26]ꎮ波形蛋白参与肿瘤细胞的分化㊁侵袭㊁转移和细胞凋亡等过程ꎬ多数研究表明波形蛋白表达与肿瘤的迁移和侵袭能力成正相关[27]ꎮ因此ꎬ通过细胞免疫荧光实验来研究氢分子对Huh7细胞波形蛋白表达变化的影响ꎮ如图9所示ꎬ经氢分子处理后ꎬHuh7细胞明显皱缩ꎬ部分细胞坏死并呈现梭形ꎬ波形蛋白的表达量较C组明显下降ꎮ该实验表明ꎬ氢分子可能通过降低细胞中间丝波形蛋白的表达ꎬ继而影响Huh7细胞的粘附和形态ꎮ图9㊀氢分子对Huh7细胞波形蛋白的影响Fig.9㊀VimentinexpressionchangesofHuh7cellsafterH2treated3㊀讨论目前ꎬ肝癌多采用药物治疗的方法ꎬ但仅能延长患者近5年的生存期ꎬ给患者的生活与家庭造成极大的痛苦和经济负担ꎮ因此ꎬ从社会公共卫生角度考虑ꎬ寻找有疗效㊁价格低的药物对癌症的预防和治疗至关重要ꎮ氢分子作为新型抗氧化604生物技术进展CurrentBiotechnology. All Rights Reserved.剂ꎬ在多种疾病类型中取得良好的效果ꎬ并且较易获得ꎬ价格低廉[28]ꎮ现有研究证明ꎬ氢分子对一些肿瘤具有一定的治疗效果ꎬ如卵巢癌㊁大肠癌等[29 ̄30]ꎬ因此ꎬ本研究应用肝癌细胞模型ꎬ在细胞水平探究氢分子对肝癌的治疗作用ꎮ本研究选择了人肝癌Huh7细胞作为体外研究目标ꎬ该细胞被广泛用于肝癌的生长㊁恶性表型㊁抗肝癌药物的药理药代和药物机理等研究ꎮ本研究结果显示ꎬ氢分子可以改变Huh7细胞的细胞形态ꎬ抑制细胞在体外的增殖水平及肿瘤干细胞自我更新能力㊁无限增殖能力ꎬ降低细胞迁移和高度侵袭能力ꎬ并影响细胞周期ꎬ促进细胞凋亡ꎬ这些结果说明氢分子能够抑制肿瘤的生长和肝癌细胞的转移ꎬ并对肝癌的发生发展具有一定的防治作用ꎮ与常规的临床治疗手段相比ꎬ氢分子结构简单ꎬ制备安全经济ꎬ并且其安全无毒副作用的特点给未来研究带来很多便利[28]ꎬ也为患者提供了更好的生活质量ꎮ然而ꎬ本次研究只采用了体外细胞的实验结果ꎬ氢分子对肝癌的防治作用在体内的影响仍有待研究ꎬ下一步准备建立动物模型实验ꎬ进一步探究在肝癌的动物模型中ꎬ氢分子对肿瘤的影响ꎬ是否与体外结果相一致ꎬ可以达到抑制肿瘤生长和转移的效果ꎮ目前ꎬ除了含氢培养基处理细胞ꎬ动物供给呼吸也是一种方式ꎬ还有注射富氢生理盐水㊁氢气浴㊁氢气滴眼液以及肠道氢气介入等方式ꎬ目前都有相关研究[23]ꎬ氢分子给药的多样化为实验研究和患者生活都带来了效率ꎮ综上所述ꎬ氢气已经成为多种疾病治疗中非常有希望的选择ꎬ氢气的经济性与安全性也成为肿瘤治疗良好的辅助性手段ꎮ参㊀考㊀文㊀献[1]㊀CHENWQꎬHEJꎬSUNKXꎬetal..CancerincidenceandmortalityinChinaꎬ2014[J].Chin.J.CancerRes.ꎬ2018ꎬ30(1):1-12.[2]㊀PASQUINELLIAEꎬREINHARTBJꎬSLACKFꎬetal..Con ̄servationofthesequenceandtemporalexpressionoflet ̄7het ̄erochronicregulatoryRNA[J].Natureꎬ2000ꎬ408(6808):86-89.[3]㊀LEWISBPꎬBURGECBꎬBARTELDP.Conservedseedpai ̄ringꎬoftenflankedbyadenosinesꎬindicatesthatthousandsofhumangenesaremicroRNAtargets[J].Cellꎬ2005ꎬ120(1):15-20.[4]㊀RODRIGUEZA.IdentificationofmammalianmicroRNAhostgenesandtranscriptionunits[J].GenomeRes.ꎬ2004ꎬ14(10a):1902-1910.[5]㊀CHENJLꎬLINXꎬZHOUQꎬetal..AssociationofHBVDNAreplicationwithantiviraltreatmentoutcomesinthepatientswithearly ̄stageHBV ̄relatedhepatocellularcarcinomaundergoingcurativeresection[J].Chin.J.Cancerꎬ2016ꎬ35(5):236-249.[6]㊀EL ̄SERAGHBꎬKANWALFꎬRICHARDSONPꎬetal..RiskofhepatocellularcarcinomaaftersustainedvirologicresponseinveteranswithHCV ̄infection[J].Hepatologyꎬ2016ꎬ64(1):130-137.[7]㊀BRUIXJꎬSHERMANM.Managementofhepatocellularcarci ̄noma:anupdate[J].Hepatologyꎬ2011ꎬ53(3):1020-1022. 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葫芦素B诱导细胞铁死亡抑制肝癌Huh-7细胞增殖的机制

葫芦素B诱导细胞铁死亡抑制肝癌Huh-7细胞增殖的机制

网络出版时间:2023-03-2016:33:27 网络出版地址:https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20230319.2351.016.html葫芦素B诱导细胞铁死亡抑制肝癌Huh 7细胞增殖的机制洪 婷,王依蕾,曾海荣,袁 易(上海中医药大学附属普陀医院,上海 200062)收稿日期:2022-09-21,修回日期:2023-01-09基金项目:国家自然科学基金资助项目(No81703880);上海市普陀区卫生系统科技创新项目(Noptkwws202204);上海市药学会(No2021 YY 09)作者简介:洪 婷(1991-),女,硕士生,研究方向:肿瘤药理学,Email:13818895942@163.com;袁 易(1972-),女,硕士,主任药师,副教授,硕士生导师,研究方向:药理学,通信作者,E mail:yuanyi0625@163.comdoi:10.12360/CPB202103070文献标志码:A文章编号:1001-1978(2023)04-0638-08中国图书分类号:R284 1;R329 28;R591 1;R735 702 2摘要:目的 研究葫芦素B(cucurbitacinB,CuB)对肝癌Huh 7细胞增殖的影响及其作用机制。

方法 CCK 8法检测不同浓度CuB对Huh 7细胞的存活率;葫芦素B(0 5、1、2μmol·L-1)作用于Huh 7细胞24h,EdU染色检测细胞增殖;DCFH DA,C11 BODIPY和FeRhonox 1荧光探针分别检测细胞内活性氧水平,细胞内脂质过氧化水平和细胞内Fe2+浓度;谷胱甘肽(GSH)试剂盒和丙二醛(MDA)试剂盒分别检测细胞内GSH和MDA水平;Real timePCR和West ernblot分别检测SLC7A11、GPX4、SLC40A1、Transferrin、Nrf2、HO 1的mRNA水平和蛋白表达情况;免疫共沉淀法检测GPX4蛋白的泛素化。

HMG20A对肝癌细胞体外增殖与迁移的影响及其机制

HMG20A对肝癌细胞体外增殖与迁移的影响及其机制

HMG20A对肝癌细胞体外增殖与迁移的影响及其机制白一禾;秦兆宇;贺福初;丁琛【摘要】目的研究HMG20A在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生发展和转移中的功能与机制.方法在不同转移能力和遗传背景的肝癌细胞Huh7和HCCLM3中分别构建HMG20A过表达和敲低稳定株,通过实时定量PCR (real time quantitative PCR,qPCR)验证过表达和敲低该基因的效果.用CCK8试剂盒检测HMG20A对肝癌细胞增殖能力的影响,利用Transwell小室分析HMG20A调控肝癌细胞转移的能力.借助Western blot和qPCR分析HMG20A调控肝癌增殖和转移的机制.结果体外实验表明,HMG20A能够促进肝癌细胞的体外增殖和迁移,显著上调促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-aetivated protein kinase,MAPK)通路中p38 (p38 MAPK)、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)的活性和表达水平,同时上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的标志物Vimentin、抗平滑肌抗体(anti-smooth muscleantibody,alpha-SMA)、N-cadherin受到显著的正调控,E-cadherin受到显著负调控.结论 HMG20A可能通过促进EMT进程和MAPK通路促进肝癌细胞的体外增殖与迁移.【期刊名称】《复旦学报(医学版)》【年(卷),期】2016(043)004【总页数】8页(P385-392)【关键词】肝癌;HMG20A;转移;促分裂源活化蛋白激酶;上皮间充质转化【作者】白一禾;秦兆宇;贺福初;丁琛【作者单位】复旦大学生物医学研究院医学系统生物学研究中心上海200032;复旦大学生物医学研究院医学系统生物学研究中心上海200032;复旦大学生物医学研究院医学系统生物学研究中心上海200032;北京国家蛋白质科学中心北京102206;蛋白质组学国家重点实验室,北京蛋白质组研究中心,北京放射医学研究所北京102206;复旦大学生物医学研究院医学系统生物学研究中心上海200032;复旦大学生命科学学院上海200438【正文语种】中文【中图分类】Q291;R735原发性肝细胞癌 (以下简称肝癌)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,在肿瘤致死原因中位居第三,仅次于肺癌和胃癌[1],我国是全球肝癌发病率最高和死亡最多的国家[2]。

基因编辑Huh-7细胞系——助力冠状病毒、药物代谢、癌症研究

基因编辑Huh-7细胞系——助力冠状病毒、药物代谢、癌症研究

基因编辑Huh-7细胞系——助力冠状病毒、药物代谢、癌症研究肝脏作为人体五脏之一,与机体正常的代谢、解毒、凝血等过程息息相关,并且参与机体免疫,是维持机体生命不可缺少的重要器官。

在进行肝脏疾病的研究中,合适的细胞模型是重要的工具之一,但由于常规肝细胞获取困难、培养难度高、培养成本高昂,在一定程度上制约了肝脏疾病研究的发展。

因此,在肝脏研究中选择培养简单、遗传背景稳定的肝细胞系则成为了一种替代选择,其中Huh-7是最为常用肝癌细胞系之一。

Huh-7肝细胞系的应用Huh-7细胞系由Nakabayshi、H.和Sato,J建立于1982年,是从一名57岁的日本男性的肝脏肿瘤中提取的高分化肝细胞来源的癌细胞系,呈上皮样形态。

大多数Huh-7细胞的染色体数目在55 - 63之间,具有高度异质性。

肝炎病毒研究Huh-7对丙肝病毒(HCV)高度敏感,到目前为止,Huh-7及其衍生细胞株是唯一能够有效复制丙型肝炎病毒(HCV)的细胞系,因此Huh-7常被用作研究HCV的模型。

可用于筛选抗丙型肝炎病毒的候选药物,和开发抗丙型肝炎的新药。

异种移植模型可用于建立细胞系来源的异种移植(Cell Line Derived Xenograft, CDX)小鼠模型,即Huh-7 CDX模型。

此模型可用于临床前肿瘤生长抑制的研究,包括激酶抑制剂(例如.BZG-4000)、FGFR4、抗EGFRvIII抗体等新型抗肿瘤生长疗法(例如sorafenib和silibinin)。

药物研究可用于研究肝癌药物药效、代谢,并探讨药物的分子机制。

利用CRISPR/Cas9敲除Huh-7的病毒复制关键宿主因子,探索冠状病毒复制的关键基因CypA(环孢素A结合蛋白)是许多RNA病毒复制的重要宿主因子。

此外,有些报道称,一些病毒的复制在不同程度上依赖于CypA。

这些研究由于使用了不同的病毒、细胞系和实验设计,因此很难进行比较。

科学家研究了三种可以在Huh-7细胞中复制的单链正义RNA 病毒的CypA依赖性,分别是马动脉炎病毒(EAV)、人类冠状病毒(HCoV-229E)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)。

慢病毒介导稳定高表达Cx32的Huh7细胞系建立及其对细胞增殖的影响

慢病毒介导稳定高表达Cx32的Huh7细胞系建立及其对细胞增殖的影响

慢病毒介导稳定高表达Cx32的Huh7细胞系建立及其对细胞增殖的影响纪玉婷;杨燕;郑荣生;张吴琼;刘静【摘要】Aim To construct a lentiviral vector for stable delivery of the connexin32 (Cx32) gene in human hepatocellular carcinoma cell lineHuh7,and also to detect its effect on cell proliferation.Methods Human Cx32 gene sequence was obtained by whole gene synthesis and amplified by PCR,and was then inserted into LV5-GFP lentiviral vector to construct the recombinant plasmid LV5-GFP-hCx32.Following identified by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing,this plasmid together with lentiviral package plasmid was transfected into 293T cells to produce the lentiviral particles,and the viral titer was assessed under fluorescent microscope.Targeted Huh7 cells were infected with the lentivirus (LV5-hCx32 and LV5-NC),and the infected cells after selection with puromycin were amplified and cultured.The expression and localization of Cx32 were detected by real-time RT-PCR,Western blot and immunofluorescence assay,respectively.The gap junction (GJ) function between adjacent cells was measured by dye transfer assay.The Huh7 cell proliferation capacity was determined by MTT and colony formation assays.Results The results of double enzyme digestion and DNA sequencing proved that the recombinant lentiviral vector LV5-GFP-hCx32 was successfully constructed.After packing in 293T cells,the recombinant lentivirus LV5-GFP-hCx32 with virus drops to 3 × 1011 TU · L-1 wasobtained.Huh7 cells transiently infected with the lentivirus LV5-GFP-hCx32 remarkably over-expressed Cx32 at both mRNA and proteinlevels.Moreover,Cx32 expression was also significantly up-regulated in stably transfected Huh7 cells,and the presence of enhanced functional GJ in intact cells could be detected due to an increased amount of Cx32 protein along the plasma membrane at cell-cell pared toLV5-NC group,the proliferation ability in Huh7 cells with recombinant Cx32 declined (P < 0.05).Conclusions The lentiviral vector over-expressing Cx32 gene is successfully constructed,and can stably transfect Huh7 cells to yield sustained over-expression of exogenous Cx32 gene,thus eventually inhibits cell proliferation.%目的构建LV5-hCx32慢病毒表达载体,获得稳定高表达人缝隙连接蛋白32(connexin32,Cx32)的Huh7人肝癌细胞系,并研究Cx32对Huh7细胞增殖的影响.方法采用全基因合成法并经PCR扩增得到Cx32基因序列,将所得目的片段克隆到LV5-GFP载体上,获得重组慢病毒质粒LV5-GFP-hCx32,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,与慢病毒包装质粒系统共转染293T细胞中,包装成重组慢病毒颗粒,经荧光显微镜测定重组慢病毒滴度.将慢病毒载体LV5-hCx32和LV5-NC感染Huh7细胞,嘌呤霉素筛选出细胞阳性克隆并扩大培养.qRT-PCR、Western blot和免疫荧光法分析Cx32的表达及定位;细胞接种荧光示踪法检测细胞缝隙连接(gap junction,GJ)功能;MTT法及克隆形成实验观察细胞增殖能力的变化.结果双酶切及测序结果表明LV5-GFP-hCx32慢病毒载体构建成功,经293T细胞包装后,成功获得病毒滴度为3×1011TU·L-1的重组慢病毒LV5-GFP-hCx32,慢病毒瞬时感染后的Huh7细胞中Cx32 mRNA和蛋白表达水平明显增多,筛选后建立的稳定转染细胞系中Cx32也稳定高表达,并且部分表达于细胞膜,形成有功能性的GJ.过表达Cx32的Huh7细胞增殖能力减弱(P<0.05).结论成功构建Cx32基因过表达慢病毒载体,该载体能够稳定感染Huh7细胞,使外源基因Cx32过表达并抑制细胞的增殖能力.【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2018(034)002【总页数】6页(P284-289)【关键词】肝细胞癌;缝隙连接蛋白32;慢病毒;载体构建;稳定转染;治疗靶点【作者】纪玉婷;杨燕;郑荣生;张吴琼;刘静【作者单位】蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科,安徽蚌埠233004;蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科,安徽蚌埠233004;蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科,安徽蚌埠233004;蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科,安徽蚌埠233004;蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科,安徽蚌埠233004【正文语种】中文【中图分类】R329.24;R373.9;R735.7;R735.702.2;R977.6消化道肿瘤是人类面临的重大难题,原发性肝癌是消化系统肿瘤的重要构成,其中约90%为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。

WWP2干扰对Huh7肝癌细胞的增殖、凋亡及细胞周期的影响研究

WWP2干扰对Huh7肝癌细胞的增殖、凋亡及细胞周期的影响研究

WWP2干扰对Huh7肝癌细胞的增殖、凋亡及细胞周期的影响研究徐胜前;秦勇;王超君;叶冠雄;吴成军;王世;潘德标;王俊【摘要】目的探讨WWP2对Huh7肝癌细胞系的增殖、凋亡及细胞周期的影响研究.方法通过实时定量PCR(qPCR)、RNA干扰、流式细胞仪分析细胞周期及凋亡,了解WWP2在Huh7肝癌细胞周期的中作用.结果在肝癌组织中,WWP2 mRNA水平显著性表达;敲除细胞中的WWP2会抑制细胞增殖、使细胞停滞在G1期,并诱导细胞凋亡.结论 WWP2有可能通过调控细胞凋亡而促进肝癌细胞生长.%Objective To explore this effects of WWP2 interference on proliferation,apoptosis and cell cycle of hepatocellular carcinoma cell Huh7.Methods We used the experimental techniques of real-time quantitative PCR (qPCR),RNA interference and flow cytometry to investigate the role of WWP2 in the cell cycle of hepatocellular carcinoma (Huh7).Results WWP2 mRNA levels expressed significantly in hepatocellular carcinoma (HCC).Knock except cells of WWP2 will inhibited cell proliferation,the cell arrest in the G1 phase,and induce cell apptosis.Conclusion WWP2 may promote the growth of hepatocellular carcinoma cells through the regulation of apoptosis in vitro.【期刊名称】《医学研究杂志》【年(卷),期】2017(046)011【总页数】4页(P84-87)【关键词】WWP2干扰;Huh7肝癌细胞系;增殖;凋亡【作者】徐胜前;秦勇;王超君;叶冠雄;吴成军;王世;潘德标;王俊【作者单位】323000 温州医科大学附属第六医院、丽水市人民医院肝胆胰外科;323000 温州医科大学附属第六医院、丽水市人民医院肝胆胰外科;323000 温州医科大学附属第六医院、丽水市人民医院肝胆胰外科;323000 温州医科大学附属第六医院、丽水市人民医院肝胆胰外科;323000 温州医科大学附属第六医院、丽水市人民医院肝胆胰外科;323000 温州医科大学附属第六医院、丽水市人民医院肝胆胰外科;323000 温州医科大学附属第六医院、丽水市人民医院肝胆胰外科;323000 温州医科大学附属第六医院、丽水市人民医院肝胆胰外科【正文语种】中文【中图分类】R3原发性肝癌主要包括肝细胞癌、胆管癌、肝血管肉瘤。

维生素 K2抑制肝癌细胞增殖的机制研究

维生素 K2抑制肝癌细胞增殖的机制研究

维生素 K2抑制肝癌细胞增殖的机制研究王光丽;周小辉【期刊名称】《实用癌症杂志》【年(卷),期】2016(000)001【摘要】目的:探讨维生素K2抑制肝癌细胞( HCC)增殖的可能机制。

方法人肝癌细胞株( HuH7)传代培养,以不同浓度的(0、10、30μM)维生素K2处理HuH-7细胞96 h,以实时定量PCR测定和Western印迹分析分别测定血小板衍生因子α受体( PDGFR-α) mRNA 和蛋白的表达;用 pluc-a2(PDGFRα启动子荧光素酶载体)转染人肝癌细胞株(HepG2),用维生素K2处理24 h后采用荧光素酶测定其荧光活性。

结果维生素K2抑制HuH7细胞的增殖;维生素K2以剂量依赖的方式抑制PDGFR-αmRNA和蛋白的表达;PDGFR-α启动子的活性被维生素K2抑制并呈剂量依赖关系。

结论维生素K2可能通过下调PDGFR-α的转录抑制肝癌细胞的增殖。

%Objective To investigate the mechanism of inhibition proliferation of hepatocellular carcinoma ( HCC) cell lines in vitro.Methods Human hepatoma cells ( HuH7) were treated with various concentrations of vitamin K2 for 96 h,then the expression of PDGFR-αmRNA and protein was investigated by real time PCR and western blot analysis respectively.human hepatoma cells (HepG2) were transfected with pluc-a2 (PDGFR-αpromoter-luciferase vector),and the luciferase activity after 24 h treatment with Vitamin K2 was assessed.Results Vitamin K2 suppressed the expression of PDGFR-αmRNA and protein in a dose dependent manner.The PDGFR-αpromoter activity was suppressed byVitamin K2 administration in a dose dependent manner.Conclusion Vitamin K2 suppresses the proliferation of hepatocellular carcinoma cells via down-regulating the transcrip-tion of PDGFR-α.【总页数】4页(P14-17)【作者】王光丽;周小辉【作者单位】515041 汕头大学医学院第一附属医院;515041 汕头大学医学院第一附属医院【正文语种】中文【中图分类】R735.7【相关文献】1.乙醇激活细胞色素P450 2E1增强维生素K2抑制肝癌细胞活力 [J], 李璐;董斌;宋睿;王璐;韩伟2.维生素K2调控Wnt/β-catenin信号对肝癌细胞侵袭、凋亡的影响及机制研究[J], 张锋;苗江永3.维生素K2对肝癌HepG-2细胞增殖的抑制作用 [J], 李璐;毕富勇;吕俊;吴明彩4.维生素K2 通过降低D-双功能蛋白活性抑制肝癌的实验研究 [J], 孔令玉; 路欣; 姜玲玲5.维生素K2通过降低D-双功能蛋白活性抑制肝癌的实验分析 [J], 王佳;赵卿因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

核心蛋白聚糖对HuH7细胞增殖的影响及机制

核心蛋白聚糖对HuH7细胞增殖的影响及机制

核心蛋白聚糖对HuH7细胞增殖的影响及机制(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)作者:上官建营窦科峰李霄胡小军, 张福琴, 雍召生, 遆振宇【摘要】目的: 探讨核心蛋白聚糖(decorin, DCN)对HuH7细胞系体外增殖的影响及机制。

方法: 加入不同浓度(0、 25、 50、 75、 100、125、 150、 200 μg/L)的DCN培养HuH7细胞系不同时间(12、 24、48、 72 h和2周), 用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)法及克隆实验测定细胞增殖速度和活力, 流式细胞术测定细胞周期和凋亡情况。

结果: DCN浓度增加及作用时间延长, 细胞增殖速度减慢、活力减低, G1期细胞增多, 凋亡增加。

结论: DCN可能为一种负性调控蛋白, 可通过调节细胞周期, 抑制肝癌细胞的增殖, 促进其凋亡。

【关键词】核心蛋白聚糖; HuH7; 细胞周期; 凋亡[Abstract] AIM: To investigate the effects and mechanism of decorin( DCN) on the proliferation of HuH7 hepatoma carcinoma cell line in vitro. METHODS: Hepatoma carcinoma cells was cultured with DCN in different concentration (0, 25, 50,75, 100, 125, 150, 200 μg/L) for different time(12, 24, 48, 72 h and 2 weeks). Cell activities were studied by MTT and clone test. The changes of cell cycle and apoptosis were analyzed by Flow cytometry. RESULTS: The proliferation of HuH7 cells could be inhibited by DCN in vitro and the inhibition effect was the time and dose dependent relationship. DCN could block cell cycle at G1 phase. Apoptosis of hepatocarcinoma cells could be efficiently induced by DCN in a time/dose dependent manner. CONCLUSION: DCN may be a negative regulatory protein inhibiting hepatoma carcinoma cell proliferation through inhibiting cell cycle and inducing apoptosis of cell in vitro.[Keywords]decorin; HuH7; cell cycle; apoptosis核心蛋白聚糖(decorin, DCN)是富含亮氨酸的小分子的蛋白聚糖家族中的一员, 主要由结缔组织产生, 是一种多效性分子[1]。

核心蛋白聚糖生物学的研究进展

核心蛋白聚糖生物学的研究进展

核心蛋白聚糖生物学的研究进展袁媛;周静【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2011(17)9【摘要】核心蛋白聚糖(DCN)属富含亮氨酸小分子蛋白多糖家族成员之一.转化生长因子β(TGF-β)与其受体结合后导致细胞外基质过度沉积,DCN通过与TGF-β结合并将其中和以产生抗纤维化和抑制瘢痕形成的作用.同时DCN亦通过激活表皮生长因子受体(EGFR)/促分裂原活化蛋白激酶/p21信号通路和抑制EGF- EGFR介导的促细胞增殖信号通路等机制来抑制肿瘤细胞增殖与转移.基于DCN 以上两方面的生物活性,加之源于人体自身产生,所以重组产品免疫原性较低,提示DCN对于慢性纤维化和肿瘤等疾病的防治具有潜在的药用开发价值.%Decorin ( DCN ) is one of the leucine - rich proteoglycan familly of small molecules.Substantial evidence shows that DCN can interrupt transforming growth factor-β ( TGF-β ) binding to it s receptor and reduce the excessive deposition of extracellular matrix.DCN plays an anti-fibrotic role and inhibits the formation of scar by binding or neutralizating TGF-β.DCN can also inhibit tumor cell proliferation and metastasis by activating epidermal growth factor receptor ( EGFR )/MAPK/p21 signaling pathway and inhibiting the signaling pathway that promotes cell proliferation by EGF-EGFR.Due to the above two biological activities and its human origin, recombinant DCN has a low immunogenicity, suggesting that DCN has a pharmacological potential in the treatment of chronic fibrosis and cancers.【总页数】4页(P1303-1306)【作者】袁媛;周静【作者单位】重庆医科大学附属第一医院消化内科,重庆,400016;重庆医科大学附属第一医院消化内科,重庆,400016【正文语种】中文【中图分类】R575.2【相关文献】1.核心蛋白聚糖基因在肿瘤学中的研究进展 [J], 王丽2.核心蛋白聚糖生物学功能研究进展 [J], 吴凡;王千秋3.核心蛋白聚糖在组织器官纤维化中作用的研究进展 [J], 韩耀东;陈鸿杰4.核心蛋白聚糖与血管成形术后再狭窄的关系的研究进展 [J], 尹榕;洪波;石向群;刘建民5.核心蛋白聚糖和调节T细胞在口腔鳞癌中作用研究进展 [J], Fu Zhi-hua; Gao Ya-jun; Wang Xiao; Wu Zhao; Li Qian-peng; Chen Ying-xin因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。

细胞之间的区别精选版

细胞之间的区别精选版

细胞之间的区别Document serial number【KKGB-LBS98YT-BS8CB-BSUT-BST108】S W480细胞是中度分化细胞,而L O V O是高分化细胞.其Z 人肝癌细胞系分类1.1取材于原发肝癌组织,建系过程中没有改变其生物学特性早期所建的细胞系大都属于此类[4~7],它们有一些共同点,如AFP均为阳性,能分泌一些血浆蛋白,但也存在一些明显的差别,PLC/PRF/5和HepG2在裸鼠中成瘤性都较差,而QGY-7703和SMMC-7721异种移植成功率为100%,PLC/PRF/5能检测到HBsAg,HepG2则不含HBV。

郭秀婵等[8]建立的3株人肝癌细胞,显示了HBV可以协同AFB1导致肝癌的发生。

丙型肝炎病毒是肝癌的一个重要致病因素,Aoki等[9]建立了一株能成功翻译由重组腺病毒产生的HCVRNAs的人肝癌细胞系。

1.2具有特征性的人肝癌细胞系MHCC97是利用裸鼠人肝癌高转移模型在体外建立的[10],该细胞系HBsAg、HBxAg、AFP均阳性,经皮下和肝内接种均可使棵鼠致瘤,并发生肺部转移,肝内接种者,肺转移达100%(12/12),肺转移灶癌细胞AFP阳性。

从该细胞系克隆出的两株细胞[11]的生物学特性有明显差别,高转移株肺转移率为100%,而低转移株仅为40%。

吴小鹏等[12]一株外生型肝癌细胞系EGHC-9901,该细胞系能持续高分泌AFP,能形成完整毛细胆管且有明显微绒毛,说明细胞变异较小。

一些人肝癌细胞系其宿主患有其他肿瘤或疾病。

KMCH-1是第一株肝癌和胆管癌混合的细胞系[13],该细胞系在无胸腺鼠中能成瘤,但形成瘤体的分化程度却不同,皮下移植瘤呈低分化,而腹腔内肿瘤分化良好。

RBHF-1[14]遗传性血色素沉积病的肝癌患者,HBV和HCV均阴性,该细胞系的建立有助于铁沉积过多的研究。

Mz-Hep-1[15]是第一株致癌物相关的肝癌来源的细胞系,该细胞系的宿主长期暴露在高浓度的二氧化钍环境中,没有肝炎病毒感染。

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核心蛋白聚糖对HuH7细胞增殖的影响及机制(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)作者:上官建营窦科峰李霄胡小军, 张福琴, 雍召生, 遆振宇【摘要】目的: 探讨核心蛋白聚糖(decorin, DCN)对HuH7细胞系体外增殖的影响及机制。

方法: 加入不同浓度(0、 25、 50、 75、 100、125、 150、 200 μg/L)的DCN培养HuH7细胞系不同时间(12、 24、48、 72 h和2周), 用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)法及克隆实验测定细胞增殖速度和活力, 流式细胞术测定细胞周期和凋亡情况。

结果: DCN浓度增加及作用时间延长, 细胞增殖速度减慢、活力减低, G1期细胞增多, 凋亡增加。

结论: DCN可能为一种负性调控蛋白, 可通过调节细胞周期, 抑制肝癌细胞的增殖, 促进其凋亡。

【关键词】核心蛋白聚糖; HuH7; 细胞周期; 凋亡[Abstract] AIM: To investigate the effects and mechanism of decorin( DCN) on the proliferation of HuH7 hepatoma carcinoma cell line in vitro. METHODS: Hepatoma carcinoma cells was cultured with DCN in different concentration (0, 25, 50,75, 100, 125, 150, 200 μg/L) for different time(12, 24, 48, 72 h and 2 weeks). Cell activities were studied by MTT and clone test. The changes of cell cycle and apoptosis were analyzed by Flow cytometry. RESULTS: The proliferation of HuH7 cells could be inhibited by DCN in vitro and the inhibition effect was the time and dose dependent relationship. DCN could block cell cycle at G1 phase. Apoptosis of hepatocarcinoma cells could be efficiently induced by DCN in a time/dose dependent manner. CONCLUSION: DCN may be a negative regulatory protein inhibiting hepatoma carcinoma cell proliferation through inhibiting cell cycle and inducing apoptosis of cell in vitro.[Keywords]decorin; HuH7; cell cycle; apoptosis核心蛋白聚糖(decorin, DCN)是富含亮氨酸的小分子的蛋白聚糖家族中的一员, 主要由结缔组织产生, 是一种多效性分子[1]。

有许多资料表明DCN是一种抗增殖因子, 能够抑制多种细胞增殖, 极可能是一种肿瘤抑制物, 使转化的细胞和肿瘤静止[2], 这提示DCN有可能成为新的抗肿瘤药物。

本实验旨在探讨DCN对人肝癌细胞生长的影响及其作用机制, 为肝癌的防治提供新的思路。

1 材料和方法1.1 材料人类肝癌细胞HuH7细胞由本实验室提供。

RPMI 1640培养基购于Gibco公司, 按说明以双蒸水溶解, 滤膜过滤除菌, 分装, -20℃冻存备用。

新生牛血清为杭州四季青生物工程材料公司产品, 经56℃ 30 min水浴灭活后, -20℃冻存备用。

96孔、 6孔细胞培养板为Corning Costar公司产品。

Recombinant Human Decorin(Catalog Number: 43DE)购自美国RD公司, 用PBS稀释浓度为1 000 μg/L, -20℃冻存备用。

HEPA class100 CO2孵箱为Thermo 公司产品, CKX41荧光倒置显微镜为日本Olympus公司产品, 流式细胞仪为Beckman Coulter公司产品。

1.2 方法1.2.1 细胞培养HuH7细胞培养于100 mL/L新生牛血清RPMI1640培养液中, 含 105 U/L青霉素, 100 mg/L链霉素, 培养条件为37℃、 50 mL/L CO2、饱和湿度。

培养的细胞均为上皮样贴壁生长, 细胞密度(0.1~1)×109/L, 每3~4 d传代1次, 取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 细胞处理取对数生长期细胞调整密度至1×109/L, 接种于96孔板, 100 μL/孔。

接种24 h后换液, 分别加入含0、 25、 50、75、 100、 150、 200 μg/L DCN的培养液, 分别以PBS为空白对照、不含DCN培养液为阴性对照, 每孔设4个复孔, 分别于12、 24、48、 72 h用MTT法检测吸光度(A490值), 并绘制曲线。

取对数生长期细胞接种于6孔板, 200个细胞/孔。

接种24 h后换液, 分别加入含0、 25、 50、 75、 100、 125、 150 μg/L DCN的培养液, 分别以PBS为空白对照、不含DCN培养液为阴性对照培养2周, 当培养皿中出现肉眼可见的克隆时, 终止培养, 甲醇固定, 吉姆萨染色后计克隆数, 计算克隆率, 并绘制曲线。

1.2.3 流式细胞术检测细胞周期和凋亡收集对数期生长的HUH7细胞, 配成单细胞悬液(1×109/L), 与浓度为0、 25、 50、 75、 100、150 μg/L的DCN共同孵育96 h, PBS清洗, 标本用胰蛋白酶消化成细胞悬液, 其中一份标本用PBS洗涤2次并将细胞密度调整为109/L。

首先用微量移液枪移取20 μL细胞悬液, 然后细胞悬液中加入Annexin V并避光静置15 min后, 将PI染料加入并静置30 min, 上机检测。

另一份标本加无水乙醇固定。

PBS洗涤乙醇, 取细胞悬液2 mL, 以1 500 r/min离心5 min, 弃上清, 轻轻摇动, 加入PI去污染液(含10 mL/L TritonX100)2 mL, 避光染色10 min。

流式细胞仪检测, 每份标本测定20 000个细胞, 测量速率为150~200个细胞/s。

用MultiCycle for Windows软件分析被采集资料。

1.2.4 统计学分析数据用x±s表示, 应用SPSS15.0软件包进行统计分析, 不同时间及浓度DCN对细胞增殖情况、细胞周期及凋亡率影响的比较采用SNK q检验, 检验水准取α=0.05。

2 结果2.1 DCN不同浓度及时间对HuH7细胞增殖的影响 HuH7细胞经DCN作用不同时间, 其吸光度在同一时间点随作用浓度增加而逐渐降低, 说明细胞增殖随DCN浓度增加而逐渐减弱; 同一浓度DCN作用, 随着作用时间的延长, 吸光度增加速度逐渐减慢, 说明较对照组细胞增殖活力减低(图1, P0.052.2 DCN作用浓度对HuH7细胞增殖的影响将不同浓度DCN作用HuH7细胞96 h后吸光度(A490值)结果做统计分析(表1)。

显示不同浓度DCN A值与阴性对照组比较差异有统计学意义(P0.05或P0.01), 表明不同浓度DCN对细胞增殖的影响不同, 且随浓度增加, 抑制效果逐渐增强。

2.3 克隆实验结果 HuH7细胞以不同浓度DCN培养2周, 出现肉眼可见克隆, 处理后计数并计算克隆率(Clone Rate), 结果显示, 随着DCN浓度增加, 细胞克隆率呈下降趋势, 这表明DCN对HuH7增殖有一定抑制作用(图2)。

表1 不同浓度DCN作用HuH7细胞96 h A值2.4 DCN对HuH7细胞周期和凋亡率的影响随着DCN浓度的增加, HuH7的G1期细胞数明显增多, S期细胞数明显减少, G2期细胞数则无明显变化规律, 同时凋亡细胞率逐渐升高 (图3、 4)。

3 讨论DCN是在细胞外基质中存在的小分子蛋白聚糖, 与肿瘤的发生、发展密切相关。

Santra等[3]将DCN cDNA稳定转染人乳腺癌MDA453细胞, 这些被成功转染的细胞克隆表现明显的生长抑制, 细胞克隆在软琼脂上不形成集落, 在scid小鼠中不形成肿瘤, 并且G1期细胞增加。

此外, Nash等[4]研究发现直接加入人DCN能够抑制卵巢癌细胞系SKOV3和2774细胞的增长, 并且与抗肿瘤药物卡铂有协同作用。

Koninger等[5]研究发现直接加入人DCN能够抑制胰腺癌细胞系的增殖, Tralh o等[6]进一步报道腺病毒介导的DCN cDNA的表达能够使肿瘤细胞在小鼠体内凋亡并且可以抑制对侧肿瘤细胞的生长, 而且这种抑制还是特异性的, 正常组织细胞却不发生凋亡和生长抑制。

本研究显示DCN可抑制体外培养HuH7细胞增殖, 流式细胞术检测G0期细胞显著增多, G1期细胞周期阻滞, G0/G1期的肿瘤细胞比率越高, 表明DCN可以延缓肿瘤细胞由G1期向S期的过渡, 使S期和G2期细胞明显降低, 提示DCN可能影响细胞周期细胞, 使HuH7细胞多数停滞于DNA合成前期, DNA合成障碍, 使肿瘤细胞的倍增时间延长[7]。

同时本实验中经DCN作用后的HuH7细胞凋亡率显著地增高, 提示诱导凋亡亦可能是DCN抑制肝癌细胞的机制之一。

国内外有关DCN文献报道其有效工作浓度基本上都是在mg/L水平, 本实验将重组人DCN用PBS稀释成1 000 μg/L, -20℃冻存备用。

在预实验及实验时均得出理想的结果, 而且随剂量增大及时间的延长抑制效果明显增加。

在肝癌细胞体外培养小剂量DCN未见到刺激细胞增殖作用, 这可能早期国内报道DCN对正常肝细胞及肝星形细胞有双重调节作用不同, 即0.01 mg/L DCN可刺激正常肝细胞及肝星形细胞的增殖;5、 10 mg/L DCN则具有抑制细胞生长的作用, 这可能提示DCN在肝癌中的作用不同于正常肝细胞, 小剂量DCN对肝癌细胞系HuH7即有明显抑制效果可能也与其本身生长特性也有一定关系。

国外报道DCN 最高浓度用到500 mg/L, 且发现增加到一定剂量后, 细胞抑制效果不再增加[4]。

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