人外周血淋巴细胞培养及染色体观察-SJTU
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案清晨的阳光透过实验室的窗户，洒在桌子上，我拿起笔，准备写下这个实验方案。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察，这是一个既熟悉又充满挑战的课题。
就让我以意识流的方式，带你走进这个神秘的实验世界。
一、实验目的1.了解人体外周血淋巴细胞染色体的基本结构。
2.学习并掌握染色体制备与观察的方法。
3.分析染色体形态，探讨其在遗传研究中的应用。
二、实验原理1.人体外周血淋巴细胞具有分裂能力，可进行有丝分裂。
2.通过特定染色方法，使染色体着色，便于观察。
3.利用显微镜技术，观察染色体形态和结构。
三、实验材料1.人体外周血：新鲜、无污染。
2.染色剂：吉姆萨染液、醋酸洋红染液。
3.试剂：肝素钠、氯化钠、磷酸缓冲液。
4.实验器材：显微镜、载玻片、盖玻片、离心机、移液器、吸管、计时器等。
四、实验步骤1.采集外周血：抽取2ml静脉血，加入含有肝素钠的抗凝管中，轻轻摇匀。
2.制备淋巴细胞悬液：将抗凝血置于离心管中，加入适量氯化钠溶液，1500r/min离心10分钟，弃上清，重复洗涤2次。
加入适量磷酸缓冲液，重悬细胞。
3.染色：取适量淋巴细胞悬液，滴加吉姆萨染液或醋酸洋红染液，染色5-10分钟。
4.制片：将染色后的细胞悬液滴在载玻片上，用盖玻片覆盖，轻轻压实。
5.观察染色体：将制片置于显微镜下，调节光线和倍数，观察染色体形态和结构。
6.记录结果：记录观察到的染色体形态、数量、排列等信息。
五、实验结果分析1.染色体形态：观察到的染色体呈棒状或X形，颜色鲜艳。
2.染色体数量：正常人体外周血淋巴细胞染色体数为46条。
3.染色体排列：有规律地排列成2个染色体组。
4.遗传研究应用：通过染色体分析，可研究遗传病、肿瘤等疾病的发生机制。
六、实验注意事项1.采集外周血时，要确保无污染。
2.制备淋巴细胞悬液时，要充分洗涤，去除红细胞和血浆。
3.染色过程中，要控制好染色时间，避免过染或欠染。
4.观察染色体时，要调节好显微镜光线和倍数，确保清晰。
人体外周血淋巴细胞培养及染色体制片实验原理
实验原理人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。
在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。
这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。
人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。
血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。
在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。
这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。
这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。
1912年，Warfter 最先研究人类染色体。
1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。
细胞遗传学、组织培养技术为人类染色体的研究提供了条件。
技术突破主要在于：（1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。
如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。
（2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。
（3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。
1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。
1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。
1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。
实验试剂RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。
磷酸缓冲液的配制0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6):A:Na2HPO4•12H2O 28.8克B:Na2HPO4•7H2O 2.164克KH2PO4 2.67克NaH2PO4•2H2O 0.3克溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中实验设备2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案
实验方案实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析一、实验目的1、了解动物细胞培养的方法。
掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。
2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。
3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。
初步掌握人类染色体G带的特征及其识别。
二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。
人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。
染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。
通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。
在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。
G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。
正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。
染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。
人外周血淋巴细胞培养及染色体观察
实验意义—物种的鉴别
物种亲缘关系的确定 ——进化树
蛙(22)
牛( 60, XY)
猪(38, XX)
2N = 38, XX
XX
猫(38, XY)
大猩猩(46,XY)
非洲小人猿(46, XX)
四、实验内容—实验操作流程
抽血
37℃培养3天
对着色很深的小球，处于短臂的末断，随体与短臂之间的区域 很少着色； • E(16～18)包括一对中着丝粒染色体，亚中着丝粒染色体和一对 近端着丝粒染色体； • F(19～20)为两对的中着丝粒； • G(21～22+Y)为最小的一组端着丝粒染色体，可见随体； • Y常呈现固缩状态着色更深。
实验意义
一部分患者（约1/4）有智力低下，一些患者还有精神异常 及患精神分裂症倾向。
性染色体畸变—
Jacobs综合征
XYY男性的表型正常， 患者身材高大，常超过 180cm。
XYY个体易于兴奋，易 感到欲望不满足，厌学 ，自我克制力差，易产 生攻击性行为。
XYY核型是父亲精子形 成过程中第二次减数分 裂时发生Y染色体不分 离的结果。
加入固定液2ml，细胞立即变黑
立即冲打均匀
室温下固定15min
离心后倒去上清液
离心后管底细胞为白色
白细胞
8、再固定：加入固定液1ml（2只离 心管共需2ml） ，用吸管轻轻打散， 室温下继续固定15min以上（过夜也 可以）。
9、再离心：倒去上清液，留下白细 胞制片。
第二次固定，加入固定液1ml
冲打均匀
室温下固定15min以上
离心后倒去上清
10、制片：滴入固定液0.2ml，用滴管小心冲打 成悬液，从冰箱中取出冰盒将载玻片（每人一 片）平置于冰盒上，自高处（1m以上）滴加 悬液，每片1‾2滴，将滴好的玻片放在玻璃架 上，在酒精灯火焰上烤干。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案 (1)
人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案2012级师范2班第3组组员：吴婵胡颖月央珍杨基伟杨青松宋海燕田金梅（组长）一、实验目的掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。
二、实验原理人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。
所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。
核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。
通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。
在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。
组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。
将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype analysis）。
这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。
根据染色体着丝粒位置可将染色体分为中部着丝粒染色体（m）,亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝力粒染色体（st)，端部着丝力粒染色体（t）。
对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%（2）臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数）（3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。
人体外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备的几点体会
表 4 关联系数表
ξ1 (k) 1 013657 014099 017400 013978 013993 013333 017198
ξ2 (k) 1 016674 017472 016985 017439 016446 015066 014891
ξ3 (k) 1 019643 016928 018139 017930 017347 015890 018469
计算关联度 :
γ1 =
1 8
(1 + 013657 + 014099 + 017400 + 013978 + 013993 +
预固定 :加入 1ml 固定液 (甲醇 :冰醋酸为 3 :1) 混匀预固
定 5min 。以 1000r/ min 离心 10min ,弃去上清液 。 固定 :加入固定液 5ml ,立即用吸管吹打细胞团块使之混
匀 ,室温下固定 20min ,离心 ,去上清液 。依上法重复固定 2 ～3 次 。
滴片 :将固定后的沉淀物加新鲜固定液 013～015ml (视 细胞多少而定) ,用吸管吹打混匀 ,制成细胞悬液 。吸取细胞 悬液 2～3 滴 ,以约 20cm 或更高的距离滴于清洁冰湿的载玻 片上 ,并轻轻吹一口气 ,以助细胞 、染色体分散 。室温晾干 。
收获细胞 : 将培养物移至离心管中 ,以 1000r/ min 离心 10min ,弃去上清液 ,沉淀物约留 015～1ml 。
低渗 :加入 6ml 已预温 37 ℃的 01075M KCI 低渗液至离 心管中 ,用吸管轻轻吹打均匀制成细胞悬液 ,置 37 ℃温箱内 , 以使红细胞破坏 ,淋巴细胞膨胀 ,染色体分散 。
外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备
乙液：一水磷酸二氢钠,1/15M溶液含9.2g/L 甲液：二水磷酸氢二钠,1/15M溶液含 11.864g/L 根据要求的PH值,取X毫升甲液与Y毫升乙液, 混合均匀即得.
实验步骤
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1培养液的分装:在无菌室或接种罩内,用移液管将培养液和其它各 试剂剂分装入玻瓶,每瓶量为 :
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完全培养基3ml
PHA 20ul
外周血淋巴细胞培养和染色体 标本制备,染色体组型分析
实验目的
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1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与 染色体标本制备。 2、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。
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实验原理
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人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞 和血小板不能离体培养。每1ml 外周血中一般含有约1～3×106 个小淋巴细胞， 几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态 ，一般情 况下是不再分裂的。但当在培养液中加入植物凝血素（PHA）后， 淋巴细胞受刺激便转化为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行 有丝分裂。经过66～72小时(三个周期)的短期培养，秋水仙素的 处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂相细胞，从而进行 染色体标本制备和核型分析。
•
9制片:留固定液 0.5毫升, 用滴管小心冲打成悬液。 从冰箱的冰格中或冰水 中取 出载玻片,每片滴加悬液 1~3滴,吹散,在酒精灯火焰上过火。室温过夜。
11染色:用磷酸缓冲液（PH7.4）稀释后的姬姆萨染色液染色 20分钟,然后倒 去染液,用蒸馏水轻 轻冲洗 . 12镜检:待稍干后,在显微镜下观察,先用低倍镜寻找良好的分裂相,然后再用高 倍油 镜观察。
人染色体组型及其特征
实验材料
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1.1试验材料:人外周血淋巴细胞 1.2试验用具:离心管、吸管，量筒、 载玻片，常规清洗烘干，培 养瓶、、1ml/5ml移液枪,灭菌处理， 天平、离心机、恒温培养 箱、显微镜、普通冰箱，酒精灯。 1.3试剂药品 完全培养基 凝血素(PHA ) 5mg/ml
中山大学制备人体外周血淋巴细胞染色体标本观察染色体分带和分析姐妹染色单体色差报告
制备人体外周血淋巴细胞染色体标本观察染色体分带和分析姐妹染色单体色差张皓予 15335203（中山大学生命科学学院2015级生物技术班广州510275）摘要：人体1毫升外周血内含有许多小淋巴细胞,通过离体培养以及秋水仙素处理等操作，可以获得大量有丝分裂的细胞标本。
本实验制备了人体外周淋巴细胞染色体标本，以此进行了人染色体G带分带实验和姐妹染色体色差分析实验。
经过观察与比较发现：使用胰蛋白酶酶解染色体来使染色体G带分带，60秒的酶解时间较为适宜，分带较为明显。
BrdU-Giemsa 法染色的平均SCE/个细胞为3.3，略低于正常自然情况，为制片操作导致。
关键词：人体外周血淋巴细胞；染色体；G带；SCE引言：染色体是细胞分裂过程中出现的一种可见结构，是基因的载体。
在人类染色体研究中，外周血是制备染色体标本的重要材料之一。
如果染色体发生数目异常或结构畸变，都将导致多种基因的增加或缺失，产生临床效应。
只有获得染色体标本才能进行核型分析。
人体1毫升外周血内含有许多小淋巴细胞，通常都在G1期或G0期，一般情况下是不分裂的。
当在离体培养条件下，加入植物凝血素（PHA），小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。
经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。
供作染色体标本制备和分析用。
人的外周血淋巴细胞培养以为临场医学，病毒学，药理学，遗传毒理学等方面广泛应用。
培养外周血细胞的培养基成分对于细胞的分裂繁殖有重要的影响，当在培养基中加入体积分数10%~40%的血清时能够维持细胞的正常代谢活动，同时也能有效控制培养基的pH。
实验表明：当人体外周血的培养温度36℃~37℃时，有丝分裂的高峰发生在60~72h；若培养温度控制在38℃时，有丝分裂的高峰可以提前到48h；若培养温度高于39℃，导致细胞死亡。
秋水仙素是有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度，抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使处在分裂的细胞停留在中期。
实验1人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备
实验一人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备【实验目的】(1)了解人类外周血淋巴细胞培养技术。
(2)初步掌握人类外周血淋巴细胞染色体标本的制备技术。
【实验原理】在健康成年人外周血淋巴细胞中，以小淋巴细胞为主。
在通常情况下，它们都处在间期的G1期或G0期，一般情况下不进行分裂。
但在体外适宜培养条件下，它们经有丝分裂原如植物血球凝集素（Phytohemagglutinin，简称PHA）的作用可发生转化而重新进行有丝分裂活动。
因此，当该类细胞在人体外经PHA 刺激短期培养后，经秋水仙素（colchicine）处理使正在分裂的细胞停止在中期，再经低渗和固定等处理，即可得到较多可供分析的中期染色体标本。
【材料】人外周血【器材与试剂】1、主要器材超净工作台，光学显微镜、恒温培养箱、水平式离心机、高压蒸汽消毒锅、水浴箱、冰箱、离心管、滴管、试管架、酒精灯、载玻片等。
2.主要试剂RPMI-1640培养基、小牛血清、PHA(浓度5mg/ml)、秋水仙素(浓度4ug/ ml), 肝素(配制浓度:0. 4%)、固定液(甲醇与冰醋酸按3: 1配制) 、低渗液(0.075 mol/L 氯化钾) Giemsa染液(浓度5%)。
【实验步骤】1.取材与细胞培养在无菌条件下抽取静脉血0.5 ml，立即接种于盛有5 ml RPMI-1640培养液的培养瓶中，加入5mg/ml PHA 20-40ul,轻轻将其摇匀后放在37℃恒温培养箱中。
2、培养至68 -70h。
然后加人秋水仙素0.05 ml，继续培养2-4h，即可获得细胞。
3.染色体标本制备(1)将培养物吸入离心管内，以1500-2 000 r/min离心5-10 min，用吸管小心吸弃上清液。
(2)将预温至37℃的低渗液7-8 ml加入离心管中，用吸管混匀后放人37℃水浴箱中低渗处理10-20 min 。
中途混匀一次。
(3)取出离心管，加入1 ml固定液，缓慢混匀，立即离心5-10 min（15 00-2 000 r/min）。
人类外周血培养及染色体核型分析
人类外周血培养及染色体核型分析一、实验目的：1.学习外周血淋巴细胞悬浮培养的原理和方法；2.利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色体标本；3.利用人类染色体核型分析软件进行核型分析。
二、实验原理：1、植物血凝素的作用外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0或G1期，一般情况下是不分裂的。
当在培养基中加入植物血凝素(PHA)时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，进而开始进行有丝分裂。
2、秋水仙素的作用：秋水仙素(colchicines)可以抑制细胞纺锤体的形成，使处在分裂的细胞停留在中期。
因此利用秋水仙素处理可以获得许多同步的中期分裂细胞。
使用秋水仙素处理会引起染色体在一定程度上的收缩，因此在处理时间和浓度上要合适。
3、低渗的原理：徐道觉(T.C.Hsu)等于1952年发现在固定细胞之前使用低渗液进行处理，可以使细胞的核膜吸水膨胀，滴片后细胞破裂，染色体分散开来，在显微镜下易于观察和统计，染色效果也明显提高。
这种技术被广泛采用后，使人类染色体分析技术得到了发展。
4、核型和带型：核型(karyotype)：是指染色体组在有丝分裂中期的表型, 是染色体数目、大小、形态特征的总和。
在对染色体进行测量计算的基础上, 进行分组、排队、配对, 并进行形态分析的过程叫核型分析。
将一个染色体组的全部染色体逐条按其特征画下来，再按长短、形态等特征排列起来的图称为核型模式图，它代表一个物种的核型模式。
带型（banding pattern）即染色体带型。
借助细胞学的特殊处理程序，使染色体显现出深浅不同的染色带。
染色带的数目、部位、宽窄和着色深浅均具有相对稳定性，所以每一条染色体都有固定的分带模式，即称带型。
常用的显带技术所显示的带有Q带、G带、C带、R带、T带等。
就每一种分带技术而言，每一染色体的带型是高度专一和恒定的。
三、实验用具及试剂：1.实验仪器及用具：恒温培养箱、离心机、恒温水浴箱、冰箱、显微镜、显微数码摄像系统、染色体分析仪；培养瓶、注射器、微量移液器、枪头、吸管、离心管(10ml)、载玻片、烧杯、量筒。
人类外周血淋巴细胞的培养及染色体标本制备
细胞与遗传学教研室
一、实验目的 1.掌握人类染色体标本的制作方法 2.了解人类染色体形态结构特征
24hrs 时加 入 BrdU
68 hrs 时加 入秋水仙素
人类外周血
植物血球凝集素 ( PHA） 肝素、培养基、小牛血清
体外培养
72 hrs 后 收集细胞
制作玻片标本
固定
预固定 紫外线照射
四、实验方法
1.外周血细胞培养
（1）采血：无菌，肝素抗凝。 用无菌注射器抽取肝素0.2ml,润湿针筒,推出多 余肝素.消毒后,抽取受试者静脉血2ml。） （2）接种培养：每培养瓶加入0.3～0.5ml（10滴）, 接种于装有5ml培养基的培养瓶中，摇匀， 37℃培 养箱中培养68小时。 （20滴） • • （3）秋水仙素处理：0.05～0.4μ g∕ml培养基，轻 摇混匀后，继续培养至72小时 。
人类外周血体外培养收集细胞制作玻片标本固定预固定低渗处理植物血球凝集素pha肝素培养基小牛血清72hrs68hrs入秋水仙素24hrs入brdu紫外线照射giesma染色处理荧光染料染色染色体带的制作方法giesma染色外周血外周血中的淋巴细胞几乎都是处在中的淋巴细胞几乎都是处在gg00期或gg11期期一般情况下是一般情况下是不分裂不分裂的
外周血淋巴细胞
PHA 37℃ 68h
G0期或G1期
秋水仙素 至72 h
三、实验用品
• 1.材料：人体外周血 • 2.器材：培养箱、培养瓶、离心机、刻度离心管、吸 管、恒温水浴锅等 • 3.试剂：培养基、秋水仙素（12.5μ g∕ml）、植物凝 集素（PHA）、肝素、0.075Mkcl低渗液、甲醇、冰乙 酸、PH6.8磷酸缓冲液、Giemsa原液。
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制作技术
54生物学通报2011年第46卷第3期人体外周血淋巴细胞培养和染色体标本的制备是遗传学和细胞生物学实验教学中的重要实验项目。
染色体是遗传物质的载体，携带着丰富的遗传信息。
只有获得较好的染色体标本才能进行核型分析，进一步深入地研究染色体的形态、变异和畸变及其与表型或症状之间的关系。
人外周血液中的小淋巴细胞几乎都处在G0期或G1期，一般情况下是不分裂的。
在人工离体培养的条件下，在培养液中加入植物血细胞凝素（PHA），则能刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂。
这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞，经空气干燥法制片，便可获得质量较好的染色体标本。
由于本实验操作过程较繁琐，且实验过程中许多步骤对于实验结果都非常重要，比如PHA效价、外周血接种量、培养温度及酸碱度、秋水仙素加入时间及浓度、低渗时间、固定次数及时间等，所以学生在实验过程中很难全面掌握每个环节，因此，对于学生实验来说实验的成功率也较低。
作者在本实验室现有的条件下，经过长期摸索，总结出了完整且成熟的人外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备的实验方法，现将具体方法介绍如下：1材料和方法1.1材料RPMI1640培养基［1］人静脉血：由阜阳师范学院生命科学学院生物科学专业07级学生提供。
1.2方法1）采血。
用一次性2mL注射器抽取肝素稀释液0.2mL，湿润针管，然后将多余的肝素排除。
以75%酒精清洗并消毒供血者肘部皮肤，用橡皮管结扎静脉回流的上端，用注射器抽取静脉血0.5～2mL，然后转动针管，使血液和肝素混合。
2）接种和培养。
先用酒精消毒培养瓶的翻口瓶塞，然后插入针头，将抽得的抗凝血迅速接种到5mL含适量PHA（约0.2mL）及小牛血清的培养瓶中，每瓶接种全血0.4mL左右（6号针头15～20滴），接种过后再次用酒精消毒瓶塞，并在外面用Parafilm封口膜密封好，轻轻摇匀，置37℃培养箱中培养66～72h。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案复习过程
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案实验方案实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析一、实验目的1、了解动物细胞培养的方法。
掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。
2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。
3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。
初步掌握人类染色体G带的特征及其识别。
二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。
人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA （植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。
染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。
通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。
在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。
G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。
正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。
5blood实验5 人外周血淋巴细胞培养及染色体核型分析
实验5 人外周血淋巴细胞培养及染色体核型分析5.1 相关基础知识人外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期（G0期），一般情况下是不再分裂的。
在培养液中加入植物凝血素（PAH）时，小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。
这样经过短期培养、秋水仙素的处理、低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。
目前本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等领域广泛采用。
人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY；女子是46，XX。
根据各组染色体的特征予以分组：A组：（N01～03）是最大的一组染色体，它们的着丝粒在中部或几乎在中部；B组（N04～05）为两对大的亚中着丝粒染色体，它们有显的长臂和短臂；C组（N06～12+X）为中等大小的亚中着丝粒染色体，它们大小相差不多，X染色体大小介于期间，一般难以区分；D组（N013～15）为中等大小的端着丝粒染色体，它们的一个重要形态特征是随体，随体是一对着色很深的小球，处于短臂的末断，随体与短臂之间的区域很少着色；E组（N016～18）包括一对中着丝粒染色体，亚中着丝粒染色体和一对近端着丝粒染色体；F组（N019～20）为两对小的中着丝粒；G组（N021～22+Y）为最小的一组端着丝粒染色体，在N021～22的短臂上可见随体，Y常呈现异固缩状态，着色更深，可以识别。
5.2 实验目的和要求(1)掌握人体微量血液体外培养技术和制备染色体标本的方法；(2)观察人类染色体的形态，并计数、配对、分类和绘图。
5.3 实验材料和仪器5.3.1 实验材料和试剂(1)人的外周血淋巴细胞；(2)Giemsa母液：量取33ml甘油，先在研钵内加入少量甘油与0.5g Giemsa粉混合，研磨至无颗粒为止，再将剩余甘油倒入，搅拌后于56o C水浴保温2小时，再加入33ml甲醇，搅拌均匀后储存于棕色瓶中；(3)Giemsa染色液：将Giemsa母液用0.1M pH7.4磷酸缓冲液稀释至10倍。
人的外周血淋巴细胞培养
人的外周血淋巴细胞培养摘要淋巴细胞是免疫系统中最重要的细胞，在免疫中起关键作用，维持内环境的稳定。
对人的外周血淋巴细胞进行染色体核型分析对人类遗传研究及临床应用有重大意义。
每一物种都有一定数目及一定形态结构的染色体，可在显微镜下观察到。
本次实验的目的就是掌握人体微量血液体外培养制备染色体标本的方法并学习对人的外周血淋巴细胞进行核型分析。
每1ml 外周血中一般含有约1～3×106个小淋巴细胞，几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态，一般情况下是不再分裂的。
但当在培养液中加入植物凝血素（PHA）后，淋巴细胞受刺激便转化为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。
经过66～72小时(三个周期)的短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂相细胞，从而进行染色体标本制备和核型分析。
这种微量全血培养技术已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面得到了广泛应用。
本实验采取了人类的外周血进行实验，经各种技术处理后最后得到较为清晰的人体染色体照片。
通过实验发现：人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男性是46，XY；女性是46，XX。
根据染色体的形态、大小、及着丝粒的位置，将人的外周淋巴细胞的46条染色体分为A、B、C、D、E、F、G7组共23种类型。
关键词人的外周血淋巴细胞染色体低渗溶液核型分析秋水仙素动物细胞体外培养Human Peripheral Blood Lymphocyte CultureAbstract: Lymphocytes are among the most important immune system cells in the immune plays a key role in together, in order to maintain a stable environment. To analyze chromosome of lymphocytes is very important. Various biological chromosome number and shape are constant,can be seen under a microscope. The purpose of this experiment is human body trace blood samples were cultured in vitro chromosome preparation methods and studying on the peripheral blood lymphocyte karyotype analysis on.In human body's 1ml circumference blood includes approximately 1~3×106 the small lymphocyte generally, usually they are between time G0 and the G1 time, generally is not divided. But when adding plant in medium coagulopathy (PHA), lymphocyte transformation and stimulated for lymphatic mother cell proliferation capacity, make its recovery, then entering mitosis. After 66~72 hours(three cycles) short-term training, autumn grain processing, daffodil, low permeability and fixed can be gained lots of mitotic cells, for makes the chromosome specimen preparation and analysis. This kind of micro wholeblood culture technique in aspects and so on clinical medicine, virology, Pharmacology, heredity toxicology obtained widespread application.The experimental taken to conduct experiments on human peripheral blood, the various technical ultimately be treated more clear picture of human chromosomes. Through the experiments have found that each human somatic chromosome, 22 to 46 euchromosome sex chromosomes, and a pair of 46 XY; male is, Women are 46, XX. This method has been clinical medicine and virology, pharmacology, genetic toxicology etc widely. According to the chromosomes of the shape, size, and the centromere position, the peripheral lymphocytes 46 chromosomes into A, B, C, D, E, F, the G7 group of 23 types.Key words: Human blood lymphocytes Chromosome Low permeability solutionKaryotype analysis Autumn daffodils element zooblast in vitro raise offcenter前言细胞培养技术是目前生命科学研究领域的一项常用而重要的技术，它涉及的技术有：无菌操作技术、细胞分离技术、细胞培养技术、显微摄影技术、图像分析技术等。
人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析
西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析学院：生命科学学院专业：生物科学年级班级：2010级5班校区编码：北区姓名：陈建坤二零一二年十二月四日人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。
本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。
该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。
经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。
最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。
【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养一．引言:染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。
人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。
这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。
染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。
1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。
1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。
之后，有科学家建立了人体外周血培养法，使得染色体取材变得更加容易，大大推动了人类对染色体的研究。
二．人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析1.实验依据：.细胞培养是在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。
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性染色体畸变—
Jacobs综合征
XYY男性的表型正常， 患者身材高大，常超过 180cm。
XYY个体易于兴奋，易 感到欲望不满足，厌学 ，自我克制力差，易产 生攻击性行为。
XYY核型是父亲精子形 成过程中第二次减数分 裂时发生Y染色体不分 离的结果。
6、离心：以1000转/min，离心5min，弃去上清 液，收集白细胞。
37 ℃低渗处理20min后，发到同学手中
低速离心机使用图解
离心机顶盖
转速旋钮
电源指示灯 电源开关
转速显示 时间旋钮
对称放置离心管后方可启动离心机！！！
离心后倒去上清
7、固定：固定液成分为甲醇:冰醋酸=3:1 。每只离心管中，加入固定液2ml（2只 离心管共需4ml），立即用滴管轻轻冲打 成细胞悬液，在室温中固定15min后，离 心，倒去上清液，留下白细胞。
对着色很深的小球，处于短臂的末断，随体与短臂之间的区 很少着色； • E(16～18)包括一对中着丝粒染色体，亚中着丝粒染色体和一对 近端着丝粒染色体； • F(19～20)为两对的中着丝粒； • G(21～22+Y)为最小的一组端着丝粒染色体，可见随体； • Y常呈现固缩状态着色更深。
实验意义
一般来说，X染色体愈多，智力损害和发育 畸形愈严重。
实验意义—物种的鉴别
物种亲缘关系的确定 ——进化树
蛙(22)
牛( 60, XY)
猪(38, XX)
2N = 38, XX
XX
猫(38, XY)
大猩猩(46,XY)
非洲小人猿(46, XX)
四、实验内容—实验操作流程
抽血
37℃培养3天
46,XY
46,XX
人类男性、女性正常的染色体组成
先天愚型Down Syndrome (唐氏综合征)
又称为伸舌样痴呆， 21三体综合征。患者 通常精神发育迟滞或 智力低下（mental retardation, MR）， 智商通常在25‾50之 间。行为、动作倾向 于定型化，抽象思维 能力受损最大。
性染色体畸变—Turner综合征
又称为45，X或 45，XO综合征、 女性先天性性腺 发育不全或先天 性卵巢发育不全 综合征。
患者表型为女 性，身材矮小， 智力一般正常， 但常低于其同胞 。
性染色体畸变—47，XXX综合征
X女性综合征，又称为超雌(superfemale)； 多数具有三条X染色体的女性无论外形、性功能 与生育力都是正常的，只有少数患者有月经减 少、继发闭经或过早绝经等现象。大约有2／3 病人 智力稍低，并有患精神病倾向；
人类染色体畸变的检查 物种的鉴别
染色体畸变
染色体畸变可分为常染色体畸变和性染 色体畸变两种。一般而言，常染色体畸变的 智力缺陷较性染色体畸变严重。染色体畸变 包括数目和结构改变。数目改变如多倍体、 非整倍体。结构改变如染色体断裂、缺失、 重复、倒位和易位，从而影响到染色体上相 应基因遗传信息的传递，引起机体遗传性状 的改变，可产生疾病。
时，这种小淋巴细胞受刺激转化为淋
巴母细胞，随后进入有丝分裂
染色体各部位名称
人染色体
人类正常体细胞有46条 (23对)染色体，其中22对 为常染色体，另外还有1 对性染色体，正常男子 是46，XY；正常女子是
46，XX。
人类染色体分组
• A(1～3)：最大的中部着丝粒的一组染色体； • B(4～5)：两对大的亚中着丝粒染色体，有明显的长臂和短臂； • C(6～12)：中等大小的亚中着丝粒染色体，X大小介于其间； • D(13～15)：中等大小的端着丝粒染色体，具有随体，随体是一
自静脉采血
血液接种
细胞培养瓶
37℃培养
培养68‾72h，加入秋水仙素
5、低渗处理：小心的从水浴箱取出培养瓶，倒 去上清液，培养物沉积在瓶底，然后加入温育 的低渗液(0.075mol/L的KCl溶液) 5毫升，用滴 管轻轻冲打成细胞悬液，装入离心管中，置 37℃水浴箱内处理20min，使红细胞破碎，白 细胞膨胀。
KCl低渗处理20min 秋水仙素同步化处理2h
离心收集白细胞
固定液处理2次
镜检
染色、制片
实验步骤
1、培养液的准备：在接种罩内，用移液器将培养液分装入 10ml培养瓶中，每瓶量为： – 1640培养液4ml – 小牛血清1ml – PHA 0.2ml – 肝素 0.05ml – 双抗(青霉素和链霉素)：终浓度为100U/ml – pH：7.2‾7.4用3.5%碳酸氢钠调节
Patau综合征
又称13三体综合征
患者通常颅面和手 的畸形 ，智力发育 障碍见于所有的患 者，而且程度严重 ，存活较久的患儿 还有癫痫样发作， 肌张功能低下等。
Edward综合征
18三体综合征
18三体导致严重畸形， 在出生后不久死亡。95％ 的病例有先天性心脏病， 如室间隔缺损、动脉导管 未闭等，这是死亡的重要 原因。肾畸形，肾盂积水 也很常见。患儿智力有明 显缺陷，但因存活时间很 短，多数难以测定。
人外周血淋巴细胞培养 及染色体观察
一、实验目的
掌握人体微量血液体外培养制 备染色体标本的方法
观察人类染色体的形态，并计 数、配对、分类和绘图
二、实验材料与器材
三、实验原理
淋巴细胞
人外周血液中的小淋巴细胞，几乎
都处在G1期（G0期），一般情况下是 不再分裂的
在培养液中加入植物凝血素(PHA)
实验用药品
细菌过滤器
细菌过滤器拆分图
细 菌 过 滤 器 的 使 用
2、采血：
3、培养：将新鲜血液接种于盛有培养基的培养瓶中 ，直立置37ºC±0.5ºC恒温水浴箱内培养，培养 66‾72h。
4、秋水仙素处理：培养终止前在培养物中加入浓度 为40μg/ml的秋水仙素0.05‾0.1ml,最终浓度为 0.4‾0.8μg/ml，置温箱中处理2‾4h。
猫叫综合征
也称5p-综合征。患婴的哭叫声非常似小猫的 咪咪声，故得名。患儿面部表情似乎很机灵 ，但实则智力低下（智商常低于20），发育 迟滞也很明显。患者的死亡率低，许多能活 到成年。
性
染
色
体
畸
变
47,XXY 47,XYY
45,X0 47,XXX
性染色体畸变—Clientele综合征
患者性染色体为XXY，比正常男性多了一条X染色体，因 之亦常称为XXY综合征。患者男性第二性征发育差，有女 性化表现。患者身材高，四肢长。