人外周血淋巴细胞培养及染色体观察-SJTU
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人外周血淋巴细胞培养 及染色体观察
一、实验目的
掌握人体微量血液体外培养制 备染色体标本的方法
观察人类染色体的形态，并计 数、配对、分类和绘图
二、实验材料与器材
三、实验原理
淋巴细胞
人外周血液中的小淋巴细胞，几乎
都处在G1期（G0期），一般情况下是 不再分裂的
在培养液中加入植物凝血素(PHA)
猫叫综合征
也称5p-综合征。患婴的哭叫声非常似小猫的 咪咪声，故得名。患儿面部表情似乎很机灵 ，但实则智力低下（智商常低于20），发育 迟滞也很明显。患者的死亡率低，许多能活 到成年。
性
染
色
体
畸
变
47,XXY 47,XYY
45,X0 47,源自文库XX
性染色体畸变—Clientele综合征
患者性染色体为XXY，比正常男性多了一条X染色体，因 之亦常称为XXY综合征。患者男性第二性征发育差，有女 性化表现。患者身材高，四肢长。
实验用药品
细菌过滤器
细菌过滤器拆分图
细 菌 过 滤 器 的 使 用
2、采血：
3、培养：将新鲜血液接种于盛有培养基的培养瓶中 ，直立置37ºC±0.5ºC恒温水浴箱内培养，培养 66‾72h。
4、秋水仙素处理：培养终止前在培养物中加入浓度 为40μg/ml的秋水仙素0.05‾0.1ml,最终浓度为 0.4‾0.8μg/ml，置温箱中处理2‾4h。
人类染色体畸变的检查 物种的鉴别
染色体畸变
染色体畸变可分为常染色体畸变和性染 色体畸变两种。一般而言，常染色体畸变的 智力缺陷较性染色体畸变严重。染色体畸变 包括数目和结构改变。数目改变如多倍体、 非整倍体。结构改变如染色体断裂、缺失、 重复、倒位和易位，从而影响到染色体上相 应基因遗传信息的传递，引起机体遗传性状 的改变，可产生疾病。
性染色体畸变—Turner综合征
又称为45，X或 45，XO综合征、 女性先天性性腺 发育不全或先天 性卵巢发育不全 综合征。
患者表型为女 性，身材矮小， 智力一般正常， 但常低于其同胞 。
性染色体畸变—47，XXX综合征
X女性综合征，又称为超雌(superfemale)； 多数具有三条X染色体的女性无论外形、性功能 与生育力都是正常的，只有少数患者有月经减 少、继发闭经或过早绝经等现象。大约有2／3 病人 智力稍低，并有患精神病倾向；
Patau综合征
又称13三体综合征
患者通常颅面和手 的畸形 ，智力发育 障碍见于所有的患 者，而且程度严重 ，存活较久的患儿 还有癫痫样发作， 肌张功能低下等。
Edward综合征
18三体综合征
18三体导致严重畸形， 在出生后不久死亡。95％ 的病例有先天性心脏病， 如室间隔缺损、动脉导管 未闭等，这是死亡的重要 原因。肾畸形，肾盂积水 也很常见。患儿智力有明 显缺陷，但因存活时间很 短，多数难以测定。
一般来说，X染色体愈多，智力损害和发育 畸形愈严重。
实验意义—物种的鉴别
物种亲缘关系的确定 ——进化树
蛙(22)
牛( 60, XY)
猪(38, XX)
2N = 38, XX
XX
猫(38, XY)
大猩猩(46,XY)
非洲小人猿(46, XX)
四、实验内容—实验操作流程
抽血
37℃培养3天
自静脉采血
血液接种
细胞培养瓶
37℃培养
培养68‾72h，加入秋水仙素
5、低渗处理：小心的从水浴箱取出培养瓶，倒 去上清液，培养物沉积在瓶底，然后加入温育 的低渗液(0.075mol/L的KCl溶液) 5毫升，用滴 管轻轻冲打成细胞悬液，装入离心管中，置 37℃水浴箱内处理20min，使红细胞破碎，白 细胞膨胀。
KCl低渗处理20min 秋水仙素同步化处理2h
离心收集白细胞
固定液处理2次
镜检
染色、制片
实验步骤
1、培养液的准备：在接种罩内，用移液器将培养液分装入 10ml培养瓶中，每瓶量为： – 1640培养液4ml – 小牛血清1ml – PHA 0.2ml – 肝素 0.05ml – 双抗(青霉素和链霉素)：终浓度为100U/ml – pH：7.2‾7.4用3.5%碳酸氢钠调节
时，这种小淋巴细胞受刺激转化为淋
巴母细胞，随后进入有丝分裂
染色体各部位名称
人染色体
人类正常体细胞有46条 (23对)染色体，其中22对 为常染色体，另外还有1 对性染色体，正常男子 是46，XY；正常女子是
46，XX。
人类染色体分组
• A(1～3)：最大的中部着丝粒的一组染色体； • B(4～5)：两对大的亚中着丝粒染色体，有明显的长臂和短臂； • C(6～12)：中等大小的亚中着丝粒染色体，X大小介于其间； • D(13～15)：中等大小的端着丝粒染色体，具有随体，随体是一
对着色很深的小球，处于短臂的末断，随体与短臂之间的区域 很少着色； • E(16～18)包括一对中着丝粒染色体，亚中着丝粒染色体和一对 近端着丝粒染色体； • F(19～20)为两对的中着丝粒； • G(21～22+Y)为最小的一组端着丝粒染色体，可见随体； • Y常呈现固缩状态着色更深。
实验意义
6、离心：以1000转/min，离心5min，弃去上清 液，收集白细胞。
37 ℃低渗处理20min后，发到同学手中
低速离心机使用图解
离心机顶盖
转速旋钮
电源指示灯 电源开关
转速显示 时间旋钮
对称放置离心管后方可启动离心机！！！
离心后倒去上清
7、固定：固定液成分为甲醇:冰醋酸=3:1 。每只离心管中，加入固定液2ml（2只 离心管共需4ml），立即用滴管轻轻冲打 成细胞悬液，在室温中固定15min后，离 心，倒去上清液，留下白细胞。
46,XY
46,XX
人类男性、女性正常的染色体组成
先天愚型Down Syndrome (唐氏综合征)
又称为伸舌样痴呆， 21三体综合征。患者 通常精神发育迟滞或 智力低下（mental retardation, MR）， 智商通常在25‾50之 间。行为、动作倾向 于定型化，抽象思维 能力受损最大。
一部分患者（约1/4）有智力低下，一些患者还有精神异常 及患精神分裂症倾向。
性染色体畸变—
Jacobs综合征
XYY男性的表型正常， 患者身材高大，常超过 180cm。
XYY个体易于兴奋，易 感到欲望不满足，厌学 ，自我克制力差，易产 生攻击性行为。
XYY核型是父亲精子形 成过程中第二次减数分 裂时发生Y染色体不分 离的结果。
一、实验目的
掌握人体微量血液体外培养制 备染色体标本的方法
观察人类染色体的形态，并计 数、配对、分类和绘图
二、实验材料与器材
三、实验原理
淋巴细胞
人外周血液中的小淋巴细胞，几乎
都处在G1期（G0期），一般情况下是 不再分裂的
在培养液中加入植物凝血素(PHA)
猫叫综合征
也称5p-综合征。患婴的哭叫声非常似小猫的 咪咪声，故得名。患儿面部表情似乎很机灵 ，但实则智力低下（智商常低于20），发育 迟滞也很明显。患者的死亡率低，许多能活 到成年。
性
染
色
体
畸
变
47,XXY 47,XYY
45,X0 47,源自文库XX
性染色体畸变—Clientele综合征
患者性染色体为XXY，比正常男性多了一条X染色体，因 之亦常称为XXY综合征。患者男性第二性征发育差，有女 性化表现。患者身材高，四肢长。
实验用药品
细菌过滤器
细菌过滤器拆分图
细 菌 过 滤 器 的 使 用
2、采血：
3、培养：将新鲜血液接种于盛有培养基的培养瓶中 ，直立置37ºC±0.5ºC恒温水浴箱内培养，培养 66‾72h。
4、秋水仙素处理：培养终止前在培养物中加入浓度 为40μg/ml的秋水仙素0.05‾0.1ml,最终浓度为 0.4‾0.8μg/ml，置温箱中处理2‾4h。
人类染色体畸变的检查 物种的鉴别
染色体畸变
染色体畸变可分为常染色体畸变和性染 色体畸变两种。一般而言，常染色体畸变的 智力缺陷较性染色体畸变严重。染色体畸变 包括数目和结构改变。数目改变如多倍体、 非整倍体。结构改变如染色体断裂、缺失、 重复、倒位和易位，从而影响到染色体上相 应基因遗传信息的传递，引起机体遗传性状 的改变，可产生疾病。
性染色体畸变—Turner综合征
又称为45，X或 45，XO综合征、 女性先天性性腺 发育不全或先天 性卵巢发育不全 综合征。
患者表型为女 性，身材矮小， 智力一般正常， 但常低于其同胞 。
性染色体畸变—47，XXX综合征
X女性综合征，又称为超雌(superfemale)； 多数具有三条X染色体的女性无论外形、性功能 与生育力都是正常的，只有少数患者有月经减 少、继发闭经或过早绝经等现象。大约有2／3 病人 智力稍低，并有患精神病倾向；
Patau综合征
又称13三体综合征
患者通常颅面和手 的畸形 ，智力发育 障碍见于所有的患 者，而且程度严重 ，存活较久的患儿 还有癫痫样发作， 肌张功能低下等。
Edward综合征
18三体综合征
18三体导致严重畸形， 在出生后不久死亡。95％ 的病例有先天性心脏病， 如室间隔缺损、动脉导管 未闭等，这是死亡的重要 原因。肾畸形，肾盂积水 也很常见。患儿智力有明 显缺陷，但因存活时间很 短，多数难以测定。
一般来说，X染色体愈多，智力损害和发育 畸形愈严重。
实验意义—物种的鉴别
物种亲缘关系的确定 ——进化树
蛙(22)
牛( 60, XY)
猪(38, XX)
2N = 38, XX
XX
猫(38, XY)
大猩猩(46,XY)
非洲小人猿(46, XX)
四、实验内容—实验操作流程
抽血
37℃培养3天
自静脉采血
血液接种
细胞培养瓶
37℃培养
培养68‾72h，加入秋水仙素
5、低渗处理：小心的从水浴箱取出培养瓶，倒 去上清液，培养物沉积在瓶底，然后加入温育 的低渗液(0.075mol/L的KCl溶液) 5毫升，用滴 管轻轻冲打成细胞悬液，装入离心管中，置 37℃水浴箱内处理20min，使红细胞破碎，白 细胞膨胀。
KCl低渗处理20min 秋水仙素同步化处理2h
离心收集白细胞
固定液处理2次
镜检
染色、制片
实验步骤
1、培养液的准备：在接种罩内，用移液器将培养液分装入 10ml培养瓶中，每瓶量为： – 1640培养液4ml – 小牛血清1ml – PHA 0.2ml – 肝素 0.05ml – 双抗(青霉素和链霉素)：终浓度为100U/ml – pH：7.2‾7.4用3.5%碳酸氢钠调节
时，这种小淋巴细胞受刺激转化为淋
巴母细胞，随后进入有丝分裂
染色体各部位名称
人染色体
人类正常体细胞有46条 (23对)染色体，其中22对 为常染色体，另外还有1 对性染色体，正常男子 是46，XY；正常女子是
46，XX。
人类染色体分组
• A(1～3)：最大的中部着丝粒的一组染色体； • B(4～5)：两对大的亚中着丝粒染色体，有明显的长臂和短臂； • C(6～12)：中等大小的亚中着丝粒染色体，X大小介于其间； • D(13～15)：中等大小的端着丝粒染色体，具有随体，随体是一
对着色很深的小球，处于短臂的末断，随体与短臂之间的区域 很少着色； • E(16～18)包括一对中着丝粒染色体，亚中着丝粒染色体和一对 近端着丝粒染色体； • F(19～20)为两对的中着丝粒； • G(21～22+Y)为最小的一组端着丝粒染色体，可见随体； • Y常呈现固缩状态着色更深。
实验意义
6、离心：以1000转/min，离心5min，弃去上清 液，收集白细胞。
37 ℃低渗处理20min后，发到同学手中
低速离心机使用图解
离心机顶盖
转速旋钮
电源指示灯 电源开关
转速显示 时间旋钮
对称放置离心管后方可启动离心机！！！
离心后倒去上清
7、固定：固定液成分为甲醇:冰醋酸=3:1 。每只离心管中，加入固定液2ml（2只 离心管共需4ml），立即用滴管轻轻冲打 成细胞悬液，在室温中固定15min后，离 心，倒去上清液，留下白细胞。
46,XY
46,XX
人类男性、女性正常的染色体组成
先天愚型Down Syndrome (唐氏综合征)
又称为伸舌样痴呆， 21三体综合征。患者 通常精神发育迟滞或 智力低下（mental retardation, MR）， 智商通常在25‾50之 间。行为、动作倾向 于定型化，抽象思维 能力受损最大。
一部分患者（约1/4）有智力低下，一些患者还有精神异常 及患精神分裂症倾向。
性染色体畸变—
Jacobs综合征
XYY男性的表型正常， 患者身材高大，常超过 180cm。
XYY个体易于兴奋，易 感到欲望不满足，厌学 ，自我克制力差，易产 生攻击性行为。
XYY核型是父亲精子形 成过程中第二次减数分 裂时发生Y染色体不分 离的结果。