人的外周血淋巴细胞培养

三、实验材料：
药品
(1) RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末10.5克，用1000ml 的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或 CO2 气 体 处 理 ， 如 pH 值 降 至 6.0 时 ， 则 可 溶 解 而 透 明 。 每 1000ml 溶液加 NaHCO ， 1.0 － 1.2g ，以干冰或 CO2 气体校正 pH 至7.0－7.2。立即以5号或6号细菌漏斗过滤灭菌，分装待用。 (2) 肝 素 ： 作 为 抗 凝 剂 使 用 。 称 取 该 粉 末 160mg( 每 mg 含 126U) ，用 40ml 的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每 ml 500U 。高压消毒8磅15min。 (3) 秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的 粘度；抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。 称取秋水仙素4mg，用100ml生理盐水溶解，用6号细菌漏斗过 滤，然后放入冰箱 4℃保存。使用时用 1ml 注射器吸取该溶液 0.05 － 0.1ml 加入 5ml 的培养物中，其最终浓度为 0.4—0.8ug ／ ml。
三、实验材料：
(5)抗菌素 青霉素( 以每瓶40万U为例 ): 以4ML生理盐水 (或培养基) 稀释，则每 ML 含 10 万 U 。取 1ml 加入 100ml 培养基中，则 最终浓度为100U／ml。 链霉素 ( 以每瓶 50 万 U 为例 ) ：以 2ml 生理盐水 ( 或培养基 ) 稀释，则每 ml 含 25 万 U 。取 0.4ml( 含 10U) 加入 1000ml 培养 基 中 ， 则 每 ml 含 100U( 即 100μg) 。 (100 万 U=lg ， lg=1×106μg)。
(6)姬姆萨染液：0.5g姬姆萨粉末，加33ml纯甘油，在研 钵中研细，放在56℃恒温水浴锅中保温90min，再加入 33ml甲醇，充分搅拌，用滤纸过滤，收集在棕色细口瓶中 保存，作为原液。用时以磷酸缓冲液(pH7.4)1：10稀释。
三、实验材料：
(7)0.1mol／L磷酸缓冲液： pH7.4—7.6
三、实验材料：
(4) 植物凝血素(PHA)：是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。提 取PHA的方法有两种。一种比较简单，直接用四季豆的浸 出液；另一种较复杂，最后制品为粉末。如用之得当，二 种方法均可获得良好的效果。 盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑 色、黑色.黄色，白色的四季豆亦可。取豆子20g，用水洗 净可能粘附在种子外面的化学药物。先在水中浸过夜(4℃) ，次日倒去水分，将豆子放入组织搅碎器内，加30ml生理 盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加70ml生 理盐水，混合均匀。置冰箱24h。然后以3000转／min离心 15min，取上清液，用生理盐水稀释10倍，5号除菌滤斗过 滤，分装小瓶，冰冻保存。
A. Na2HPO4· 12H20 28.8g KH2PO4(无水) 2.67g 溶解于1000ml双蒸水中。
B. Na2HPO4· 7H20 2.164g NaH2PO4· 2H20 0.3g 溶解于1000ml双蒸水中。
四、操作步骤：
1．培养液的分装：在无菌室或接种罩内，用移液管将培养
液和其它各试剂分装入培养瓶，每瓶量为： 培养液(RPMIl640或M199) 4ml 小牛血清 lml PHA 0.2ml 肝素 0.05ml 双抗(青霉素加链霉素)培养液中最终浓度各为: 100U／ml 用 3.5 ％ NaHCO3 调 pH 到 7.2—7.4 ，分装到 20ml 的玻瓶中，用 橡皮塞塞紧，待用或置于0℃条件下保藏。用前从冰箱内取出 ，放入37℃恒温锅中温育10min。
三、实验材料：
人的外周血。 用具: 2毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒， 培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒， 天平，离心机，恒温培养箱，显微镜。 器皿的清洗和消毒 玻璃器皿在使用前，均应用肥皂水洗刷，清水冲净，烘 干后浸泡在洗液中至少2h，再用流水冲洗，烘干待消毒。 将已洗净、烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装，放入 干燥消毒箱内；150℃1h。 隔离衣、口罩。橡皮塞，注射用针筒等则用高温高压消 毒(15磅15min)。
Fra Baidu bibliotek
三、实验材料：
酒精乙醚提取法：四季豆 50g，先用生理盐水洗净。将 豆浸入60ml盐水中，保存于4℃冰箱内，24h后用组织搅碎 器将其磨成匀浆，再加 140ml 盐水，置 4℃冰箱中 24h ，取 出后以 6000 转／ min 离心 20min ，吸 取上清 液 ，调 pH 至 5.6(用0.1mol／L HCl调)之后，每100ml上清液加40ml无水 酒精，加以搅拌，以3000转／min离心15min，取上清液， 弃去沉淀。在每100ml上清液中加170ml10％乙醚无水酒精 (10ml乙醚十90ml无水酒精)以3000转／min离心15min，取 沉淀放入培养皿中，在含有硅胶的抽气干燥器中抽气 2— 4d，沉淀物逐渐变得干硬。将沉淀物研磨成粉末，以0.85 ％NaCl液配成1％的溶液，此PHA 溶液经细菌滤器过滤后 分装在小瓶中，冰冻保存。使用时每5ml培养物加0.1ml即 可。如果在得到沉淀物后的干燥及研磨等过程中充分保持 灭菌操作，那么配成的PHA溶液便无需用细菌滤器过滤。
2．采血：用2ml灭菌注射器吸取肝素(500U／ml)0.05ml湿润
人的外周血淋巴细胞培养
一、实验目的：
二、实验原理：
三、实验材料： 四、操作步骤： 五、结果分析：
六、参考文献：
一、实验目的：
掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。
二、实验原理：
外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在 G1 期 ( 或 Go 期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝 血素 (PAH) 时，这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母 细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙 素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。 本方法已为临床医学、病毒学，药理学、遗传毒理学等 方面广泛应用。