微囊藻毒素研究进展

微囊藻毒素研究进展王雪艳1，聂晶晶21大连海事大学环境科学与工程学院（116026）2云南农业大学资环学院（650201）E-mail：wangxyan@摘要：微囊藻毒素(Microcystins，MCYSTs，MCs)为富营养化淡水水体中最常见的藻类毒素，从毒理学、环境科学、生物学及化学等方面对MCs巳的研究已有较多报道。

本文综述了MCs的具体的概念、对生物的影响，并对关于MCs在产生机理、分离检测方法和水处理过程中的去除方法等方面的研究进展，并对目前研究的不足提出了几点意见。

关键词：微囊藻毒素，水华，毒素，藻类植物1.前言日趋严重的水体富营氧化使水华(Water bloom)发生已成为全球性的环境问题。

我国多数淡水湖泊中形成水花的优势藻种，主要为有毒的蓝藻，这些毒藻可产生具有明显肝毒性的肽类物质，称为微囊藻毒素(Microcystins，MCYST)。

近年来，由于饮用藻毒素污染的水体，而导致家禽、野生动物中毒，甚至死亡的事件频繁发生，藻类毒素对人体健康的危害已引起了人们的关注。

我国的一些饮用水水源也已受到了有毒藻类的严重污染。

本文就微囊藻毒素对生物危害、采集、检测及去除微囊藻的方法作了简单的介绍，着重在于微囊藻毒素的产生与环境的关系的介绍。

2.微囊藻毒素（MCYST）2.1 微囊藻毒素淡水藻类中，毒性最强、污染最广、最严重的是蓝藻门。

目前已肯定的有毒藻类有铜锈微囊藻、水华鱼腥藻、水华束丝藻、阿氏颤藻、泡沫节球藻及念珠藻等。

这些藻类不只产生一种毒素，如环境发生变化，一种藻类可产生几种毒素。

它是一种肝毒素，这种毒素是肝癌的强烈致癌剂[1]。

虽然在1878年Francis就最早报道了泡沫节球藻会对动物产生毒害作用，但人们对藻类分子结构的认识还不满40年。

1959年Bishop首次分离出藻毒素后，不断有相关报道发表。

美国、日本、澳大利亚、印度、加拿大、芬兰等lO多个国家都曾报道了其湖泊、水库中有毒水华的形成，并分离出有毒藻株[2]。

我国的东湖、巢湖、太湖、滇池、淀山湖、黄浦江等饮用水水源及各种湖泊在夏秋季节藻类水华严重，每年长达7—8个月，而天然水体蓝藻水华80％是产毒的[3]。

从加拿大、日本、芬兰、美国、中国等地对湖水、河水、水库水、井水及自来水等水样的检测结果看，有的水体中微囊藻毒素检出率高达60％一87％，源水中微囊藻毒素浓度从130ng／ml一2ug／ml不等，经加氯处理后的浓度也有0．09—0．6ug ／L不等[4]。

由此可见淡水水源受到微囊藻毒素污染的严重状况。

2.2 微囊藻毒素对生物的影响MCYSTs主要以肝脏为靶器官[5-6]。

动物经灌喂或腹腔注射后，破坏细胞内的蛋白磷酸化平衡，改变多种酶活性，引起肝脏病变，造成一系列的生理紊乱。

中毒症状主要表现为虚- 1 -弱、呼吸沉重、皮肤变白、呕吐、腹泻、毛立和嗜睡等。

Mcelhiney等[7]发现MC—LR的存在可对茄属植物(Solanum)的生长和豆类植物(Phaseolus vulgaris)根的发育产生不良影响。

Singh 等[8]研究了MC对藻类、微生物和真菌生长的效应，发现在初始50 mg／L的MC可完全抑制灰色念珠藻和鱼腥藻的生长并使藻细胞溶解，观察到了MC对二氧化碳的吸收和光合作用的不良影响，同时推断出铜绿微囊藻通过MC的杀藻作用是保持其在自然条件下保持为优势藻种的重要原因。

2.3 微囊藻毒素的结构Louw认为，微囊藻毒素是一种具有强烈慢性肝脏中毒特征的生物碱。

Hughes等（1958）发现并分离得到铜绿微囊藻NRC-1有毒品系。

Bishop等（1959）对铜绿微囊藻NRC-1品系的毒性作全面研究，发现这种微囊藻毒素是由7种氨基酸组成的小分子环状多肽，为单环结构：D-丙氨酸-L-X-赤-β-甲基-D-异谷氨酸-Mdha。

其中Mdha是一种特殊氨基酸；Adda为3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯-4，6-二烯酸；X和Y为两种可变L氨基酸（图1）[9]。

目前已鉴定约有65个微囊藻毒素变式，其中多数毒性较高，如MCYST-LR、MCYST-RR和MCYST-YR3.微囊藻毒素的产生微囊藻毒素是细胞内毒素，它在细胞内合成，细胞破裂后释放出来并表现出毒性。

由于它有很小的体积(分子量1000左右)、环状结构及其氨基酸的特殊结构，一般认为它不在核糖体内合成，而是由肽合成酶复合体合成的生物活性小肽，类似于在一些杆菌和真菌中小肽的合成。

这些小肽大多是抗生素、免疫抑制物和一些对动物和植物有毒的物质。

关于微囊藻毒- 2 -素产生的机理有很多假设，但目前为止尚无令人满意的结果。

有两种考虑的可能性：一是环境因子影响，另一是遗传差异。

微囊藻毒素受光照、温度、营养盐等多种环境因素的影响，其中光照可能起着非常重要的作用。

目前比较一致的研究结果显示，光强对微囊藻毒素有显著影响，而适于藻细胞生长的温度并不适于毒素的形成。

宋立荣等[8]对滇池水华铜锈微囊藻和绿色微囊藻的实验室研究中发现，两种微囊藻在低细胞浓度时，对光强的耐受力差，在低光强下(15Em-2S-1叫)毒素产量较高；研究还表明，光强对毒素的影响效果受到培养温度的调节，而在同一光强下，温度的变化对毒素含量影响甚微。

Utkilen等[11-12]的研究也表明光能是毒素产生的一个重要制约因子，温度在高光强下对毒素的产生几乎没有影响，只有低光强下温度才影响毒素的产生低温条件（8～200C）[10]微囊藻毒性强，但这并不是微囊藻适宜生长的温度。

有研究表明[13]，微囊藻细胞的腺苷酸能荷控制毒素的产生，因此，任何影响腺苷酸能荷的因素都会调节毒素的产生，其中光照、营养盐的作用最大。

在营养盐中，以磷的作用较明显，碳、氮的影响不大；微量元素中铁、锌的影响极明显,在BG11培养基中降低铁和锌的浓度，产量显著提高，而Al、Cd、Cr、Cu、Mn、Ni和Sn等对其产量无明显影响。

生物遗传主要受DNA控制。

持毒素遗传决定论者认为，微囊藻有毒株(toxic strains)和无毒株(nontoxic strains)的毒性是由遗传决定的[14]。

对微囊藻的遗传结构的研究表明，微囊藻毒素的合成是由毒素肽合成酶基因多基因控制，并由肽合成酶复合体合成(非核糖体合成的多肽)。

Otsuka[15]等研究了有毒和无毒微囊藻(Microcys—tis)之间的关系。

他们检测了Microcystis的47个藻株的16S到23S核糖体DNA内转录间隔序列。

结果表明，Microcystis可被划分为三群：第一藻群包括有毒和无毒藻株；第二群只有有毒藻株；第三群只有无毒藻株。

三个藻群之间的差别与表现型或藻胆色素成分之间的差别并无必然联系，且同一种基因型可能有超过一种的表现型。

通过对M．AeruginosaPCC7806的DNA序列顺序分析研究发现，这种产毒的微囊藻含有具同源性的肽合成酶基因保守序列，其中至少含有两个多肽合成酶基因，而微囊藻无毒株不具有这些基因。

Ding研究了上海淀山湖水华爆发时蓝绿藻提取物的遗传毒性[14]；Meibner于1996年发现微囊藻有毒和无毒藻株多肽合成酶基因的同源DNA序列。

这些研究表明其毒素的产生受遗传因子影响。

综合因素，由于光照、温度为自然因素，人为不易控制，因而防止水体“水华”发生，只有从削减营养物负荷人手。

根据对限制因子的研究，磷的控制为主要手段；另外，由于氮多来源于面源径流，且水体有复氮效应，因此国外对湖泊富营养化的防止，不管磷是限制因素，还是氮为限制因素的湖泊，均以控制磷的输人为主来考虑。

蓝藻的生长和毒素合成不是仅受某一因素影响，而是多种物理、化学、生物因素共同作用的结果，而且各种产毒藻之间还存在一定的种群差异，今后值得进一步对多因素联合作用以及对其它产毒藻种进行研究。

4.微囊藻毒素的检测方法及去除方法4.1 目前藻毒素的检测方法主要有生物测试法、化学分析法、免疫检测法、生物化学分析法及酶学方法等。

- 3 -4.1.1 生物测试法毒理评价常用方法是采取对小鼠进行灌喂或腹腔注射来鉴定藻毒素的毒性，能较为粗略地判断提取物是否有毒性，具有操作简单，结果直观、快速等优点，但无法准确定量分析。

有研究采用无脊椎动物如虾、贝、水蚤及其卵进行毒性评价，也有采用细菌进行毒性试验和生物分析等 [16-18]。

Fladmark等 [19]利用藻毒素诱导沙门氏菌和大鼠的原发性肝细胞死亡的能力为参数检测MC—LR，表明悬浮培养液中的沙门氏菌肝细胞为检测较广范围的肝毒素提供了迅速灵敏的系统。

4.1.2 化学分析法包括高效液相色谱法（HPLC）、(HPLC)与二极管阵列检测器(DAD)或电化学检测器联用、HPLC-UV、HPLC-MS、PLC、CE-MS、毛细管电泳（CE）、薄层色谱法（TLC）及气相色谱法（GC）等，对藻毒素可进行精确的定性、定量检测。

4.1.3 生物化学分析法主要包括酶联分析法（ELISA）、蛋白磷酸酶抑制分析法（PPIA）、免疫检测法、比色法蛋白磷酸酶抑制分析等，此类方法工作原理简单易行、分析速度快、灵敏度较高，但不能对毒素起到良好的鉴别作用，有时会出现假阳性反应。

Chu等人于1989年制备了MC—LR的多克隆抗体。

1995年Satosh等制成6种MC—LR的单克隆抗体，日本MBC公司据此单克隆抗体制成试剂盒。

用ELISA方法可检测到0．05—1．0 ng／mL的MCs[20]。

徐立红等[21]以放射性(采用32P标记的底物)蛋白磷酸酶抑制法研究了自中国武汉的东湖和一个养鱼塘采集的水样中MCs总量的季节变异性。

此方法具有高度的可靠性和可重复性，检出限为20 ng／L，有可能是目前检测MCYSTs的最灵敏的分析方法。

Wong等[22]探索了利用比色法筛选水体中的MCs。

试验中，以p一硝基苯酚为底物，监测黄色产物p一硝基酚的生成速率以表示蛋白磷酸酶2A的活性。

结果表明，比色法蛋白磷酸酶抑制分析是一种简便，便宜的筛选水体中具有肿瘤促进特性的MCs的工具。

此法的检出限与放射性分析(32P标记蛋白磷酸酶抑制试验)的检出限相仿。

上述方法有利有弊，具体实践中要灵活运用、取长补短。

4.2 去除藻毒素的方法MCs通常存在于细胞内，只有细胞死亡并溶解后才释放到周围环境中。

因此，在水处理过程中去除完整的蓝藻细胞及其细胞内化合物，将有助于减少处理水中的有毒有味细胞代谢物的浓度。

目前去除MCs的方法包括絮凝、吸附、化学降解、光降解及生物降解等。

Chow等[23]研究了传统的凝结／絮凝一沉降一过滤的水处理方法对铜锈微囊藻(Microcystis aeruginosa)细胞的影响。

结果表明，以硫酸铝絮凝去除M．aeruginosa细胞，不对细胞膜的完整性造成破坏，也不影响细胞代谢物的释放，大部分细胞都能被完整地去除，处理后的水体中未发现MCs浓度增加。