愈伤组织诱导培养
愈伤组织的诱导和培养
班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223愈伤组织的诱导和培养一、实验目的及意义植物愈伤组织的诱导和培养在植物科学的基础研究和应用研究中都有重要的意义。
通过本次实验，可以初步掌握植物外植体材料消毒、接种的无菌操作技术，愈伤组织的诱导方法和愈伤组织继代培养的方法。
二、实验原理植物组织与细胞培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。
如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择适当的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得植物组织培养，成功的基本前提和重要保证。
由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织（callus）。
植物生长调节剂如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）等是诱导外植体形成遇上组织的重要因素。
三、实验仪器与药品超净工作台，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，75%乙醇，酒精消毒棉材料：烟草无菌苗，甘薯无菌苗四、实验步骤1.按下表分别配制培养基将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌后水平放置凝固2.接种前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20~30min，关闭紫外灯，开启通风开关。
洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。
进入超净工作台，用酒精棉擦拭台面（手勿伸出工作台），台面完全风干后点燃酒精灯。
3.接种开始时，将镊子及手术刀在酒精中浸泡，并在酒精灯外焰上烧炽片刻，充分冷却。
取幼嫩的烟草（甘薯）叶片，用手术刀切割成小片，再用镊子将其接种至相应的培养基上，每瓶接种3~5片，封口后取出超净工作台，标注姓名、日期、培养基和接种材料。
4.将上述培养材料常温暗培养，每隔7天观察一次，并记录培养情况五、实验结果组织长芽，而当生长素含量大于细胞分裂素含量时，二者共同作用在室温下可诱导外植体生成不定根，也可形成愈伤组织，细胞色素沉淀情况严重；NAA为植物生长素，6-BA为细胞分裂素，促进扦插生根，而当细胞分裂素含量大于生长素含量时，二者共同作用在室温下可诱导外植体生成不定芽，此次实验由于温度非形成愈伤组织的最适温度，所以未形成完整的愈伤组织细胞团。
植物生物技术 第三章 植物愈伤组织的诱导与分化培养
第一节愈伤组织的诱导和继代培养
2. 愈伤组织的形态和细胞学特征
• 根据组织学观察、外观特征及其再生能力、再生方式等，愈伤组织分成两大类 ：胚性愈伤组织（embryonic callus，EC）和非胚性愈伤组织（non-embryonic callus，NEC）。
• 愈伤组织在长期的培养中能够形成分生组织区、管胞和色素细胞，或者形成体 细胞胚，这种能够形成体细胞胚的愈伤组织叫做胚性愈伤组织(embryogenic callus)
愈伤组织 体细胞胚
再生植株
第二节 愈伤组织分化与植株再生
第二节 愈伤组织分化与植株再生
2. 植物体细胞胚的产生方式及结构特征
• 胚状体起源于外植体表面已分化的细胞 • 形成层细胞或薄壁细胞转变成迅速分裂的细胞，形成拟分生组织的细胞团和
小块愈伤组织，进而产生体细胞胚 • 在悬浮培养时,游离细胞产生细胞团,这些细胞团长大变成胚性细胞复合体,
Quiroz-Figueroa et al., 2007. Plant Cell Tiss Organ Cult
第二节 愈伤组织分化与植株再生
4. 体细胞胚的起源：
• 两种起源途径: 单细胞起源和多细胞起源
单细胞起源：可见单细胞发生的均 衡细胞分裂，胚与母体组织之间以一 个类似胚柄的结构相连 (Williams
一、器官发生与植株再生
• 器官发生：是指培养条件下的组织 或细胞团（愈伤组织）分化形成不 定根（adventitious roots）、 不定芽（adventitious shoots） 等器官的过程 。
第二节 愈伤组织分化与植株再生
1、器官分化过程：三个生长阶段
• 第一阶段是外植体经过诱导形成愈伤组织
and Maheswaran 1986).
水稻愈伤组织的诱导实验报告
水稻愈伤组织的诱导实验报告实验目的：本实验旨在探究水稻愈伤组织的诱导方法，为将来的水稻遗传改造研究提供参考。
实验材料和仪器：1. 材料：水稻种子、MS培养基、植物生长调节剂2,4-D、生长调节剂TDZ、无菌器具、琼脂、无菌操作室。
2. 仪器：无菌操作台、显微镜、实验室平衡器等。
实验步骤：1. 生物材料准备：选取幼苗期生长良好、品种鲜明的水稻种子作为材料。
将水稻种子进行表面消毒，处理方法为分别用70%的酒精和5%的次氯酸钠(1:1)混合消毒3-5分钟，然后充分清洗。
2. 建立组织培养体系：将消毒后的水稻种子在无菌操作台上进行分离培养。
将种子取出后，从胚乳中取出胚轴，用剪刀消毒后放入含有MS培养基的无菌培养瓶中，置于无菌操作室中进行培养。
在35-37°C下连续培养3-5天。
3. 筛选愈伤组织：将培养2-3天的胚轴等植物试管苗等组织放置在含有不同浓度的2,4-D和TDZ的培养基中，培养10-15天。
筛选出生长具有愈伤能力的组织，采用显微镜等方法进行观察，并进行相应的分离和培养。
4. 愈伤组织的维持和复壮：将筛选出的愈伤组织维持在含有2,4-D和TDZ的培养基中，定期进行转移或分离。
当愈伤组织增生至一定程度后，将其转移到不含激素的培养基中，进行复壮。
实验结果：在实验过程中，我们选择了4个不同浓度的2,4-D和TDZ进行培养，筛选出了愈伤组织，并进行了维持、修复工作。
经过5次转移和增殖培养，我们成功地建立了稳定的水稻愈伤组织体系。
结论：本实验采用的方法可行，成功地建立了稳定的水稻愈伤组织体系。
本研究为今后的水稻遗传改造和抗性育种提供了良好的基础。
胡萝卜愈伤组织的诱导培养
本科学生综合性实验报告
学号姓名
学院生命科学学院专业、班级09级生物科学B班实验课程名称植物组织培养实验
教师及职称龙维彪（讲师）
开课学期2011 至2012 学年下学期填报时间2012 年 6 月 1 日
一．实验设计方案
二．实验报告
⑴胡萝卜愈伤组织的诱导结果：
经过诱导，4瓶都出现污染状况，做继代培养用小组的实验材料。
⑵继代培养的结果：
如上图所示，继代培养得到的三瓶均无污染，三瓶中的愈伤组织增殖情况均良好，其中3瓶特别好，愈伤组织呈现结构疏松的特点。
污染情况：无污染。
长势情况：长势良好。
颜色情况：部分颜色有点暗淡，少部分为金黄色，颜色发亮。
植物愈伤组织诱导培养基的配制
植物愈伤组织诱导培养基的配制植物愈伤组织诱导培养基（简称愈伤培养基）是一种含有特定激素和营养物质的培养基，其主要作用是诱导植物体组织形成愈伤组织，从而实现植物组织培养、育种等研究。
本文将介绍植物愈伤组织诱导培养基的配制。
一、基础盐溶液的配制基础盐溶液是愈伤培养基的基础成分，其配方基本固定，主要成分包括无机盐和蔗糖等。
基础盐溶液的配入量不同，会影响培养基的pH等指标。
基本的基础盐溶液配方：碳酸钾（K2CO3）2.5g、硝酸铵(NH4NO3)1.0g、硫酸镁（MgSO4·7H2O）1.0g、氯化钙（CaCl2·2H2O）0.15g、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.25g、蔗糖20g、亚硫酸氢钠（NaHSO3）0.25g、维生素B5（nicotinic acid amide）0.1mg、维生素B1（thiamine·HCl）0.1mg，配入1L蒸馏水中。
注意：不同植物种类的愈伤培养基种类略有不同，需要根据实验需求和特性进行差异化调整。
二、植物生长素的添加植物生长素是愈伤组织诱导的必要因素之一，常用的生长素有IAA、IBA、NAA、2,4-D 等，其中2,4-D是最常用的生长素。
植物生长素的添加量需要视植物种类、处理目的和生长素种类而定。
一般情况下，2,4-D的添加量为1-2mg/L，但不同品种之间的生长素敏感性可能不一致，因此需要优化试验条件。
如果使用IBA或NAA等生长素，其配入量一般为0.1-0.5mg/L。
三、其他添加物除了基础盐溶液和植物生长素外，愈伤培养基还需要添加其他营养物质、激素等。
下面列举了一些常用的添加物及其配入量：1、硫酸甘露醇（mannitol）：2-3%。
用于储存或早期培养。
2、水杨酸（Salicylic acid）：10-500mg/L。
用于抑制愈伤组织的黑化和坏死。
3、多种维生素：如维生素B1、B5、C，一般用于添加到培养基中的含量为5-10mg/L。
植物愈伤组织诱导培养实验指导--李老师资料
植物愈伤组织诱导培养实验指导--李老师资料植物愈伤组织诱导培养实验实验目的：1.掌握植物愈伤组织的诱导和培养技术；2.了解植物生长素和植物生长调节因子的作用；3.实践动手能力，培养分析问题、解决实际问题的能力。
实验步骤：1.实验材料种子：芸苔、小麦、玉米等试剂：琼脂、SD综合培养基、激素溶液、酒精灯、移液管等2.种子的表面消毒取适量的芸苔种子，用70%的酒精灯烧消毒。
将种子放入无菌蒸馏水中浸泡20分钟，再用三次含酸性消毒液（NaClO）洗涤。
洗涤后，用无菌蒸馏水洗三次，并将水倒掉。
将种子放在干净、无菌的滤纸上晾干。
3.愈伤组织诱导3.1 试剂配制将SD综合培养基和激素溶液按体积比例配制成诱导培养基。
激素溶液的配方参考如下：IAA：千叶素：6-BA的比例为 10：1：1，浓度为0.108 mg/L；3.2 培养陈列室准备工作实验室必须具有无菌灯、搅拌器、制冷箱或培养箱等基本的实验设备。
实验前清洗设备，使用高压蒸汽或酒精灯等方式灭菌。
在无菌条件下制备琼脂、移液管、培养瓶等。
在实验操作台上，用70%的酒精清洗双手，并用无菌纸巾擦拭干净。
3.3 培养基的制作制好的培养基分装到15ml的培养瓶中。
琼脂用70%酒精擦拭干净，均匀铺在实验平台上，用于接种组织。
3.4 组织接种将种子放在培养基上，用无菌铁丝按一定距离排列成一排。
取出种子，切成0.5-1cm的暴露在外的子叶或幼芽，然后在接种组织区域按照一定距离进行均匀排列。
将培养瓶密封，并放在指定的温度下生长。
4．实验结果的处理和分析4.1 愈伤组织的诱导情况观察家哈的发育情况，如出现愈伤组织的形成，记录其在构型，大小等。
4.2 理化指标的测定在诱导完成后的期间，测定愈伤组织中的蛋白质含量，葡萄糖含量，游离氨基酸含量等指标。
注意事项：1.实验过程中要注意操作技巧，避免污染；2.在培养过程中，要注意温度和光照的控制；3.进行实验时，要做好实验记录和实验数据分析工作；4.实验后，要注意实验设备的清洁和归档。
实验1 愈伤组织的诱导
实验1 愈伤组织的诱导1、实验目的（1）学习植物材料表面灭菌的常规方法；（2）了解接种的无菌操作技术；（3）学习诱导植物器官形成愈伤组织的方法。
2、实验原理植物组织培养是应用无菌操作的方法，培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。
如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。
由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，可以通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织。
3、实验仪器和试剂仪器：超净工作台、光照培养箱、酒精灯、打火机、记号笔、脱脂棉、75%酒精及棉球。
无菌器材：无菌吸水纸（定性滤纸）、灭菌培养皿、无菌水、镊子、解剖刀。
植物材料：直根胡萝卜、烟草叶片。
试剂：95%乙醇、0.1%氯化汞。
培养基：MS+1mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+10g/L琼脂,pH5.84、实验步骤（1）接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种间紫外灯，照射约30 min，然后关闭紫外灯，通风20 min后，打开日光灯即可进行无菌操作。
（2）外植体预处理：将胡萝卜根用流动的自来水冲洗干净，用小刀削去其表皮1-2mm，切成大约15-20mm厚的块段。
（3）以75%乙醇棉将手擦试一遍。
以下操作全部在无菌条件下进行。
（4）外植体消毒：用0.1%的升汞消毒1min-3min（烟草叶片消毒10秒钟左右）,然后用无菌水中漂洗3次，每次2分钟。
（5）将胡萝卜片放入垫有无菌滤纸的培养皿中，一手用消毒好的镊子固定胡萝卜，一手用灭菌后的解剖刀切除胡萝卜块段截面的表面部分，余下部分切成包含形成层的长、宽约5mm，厚约5mm的小块。
在完成切割后，将解剖刀和镊子放入95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后，放回原处，待冷却后即可使用。
第三章-愈伤组织诱导
第三章愈伤组织的诱导与培养第一节愈伤组织的诱导与继代培养愈伤组织（callus）: 在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。
大部分外植体细胞须经脱分化形成愈伤，才能再分化成完整植株，只有茎尖等少数细胞只恢复为分生状态但不分裂，直接再分化。
愈伤组织的诱导与分化是植物组培的基本环节。
一、愈伤组织的诱导及其形态特征1、愈伤组织的诱导1）起动期/诱导期（initiation/induction stage, Induction of growth）外植体细胞在外源激素作用下，经脱分化而恢复分裂状态，开始形成愈伤。
细胞外观无明显变化，代谢旺盛，合成加强，为分裂做准备。
持续十几小时~几天。
2）分裂期（divition stage/phase）：外植体切口边缘膨大，外层细胞迅速分裂，体积变小，具分生细胞的特征，细胞数速增。
3）形成期（formation stage/Differentiation phase）：外植体表层细胞分裂减缓，内部细胞开始分裂，大量细胞形成瘤状/泡状或片状结构。
若不及时继代，将分化出拟分生组织瘤状物和维管组织，又称分化期。
2. 愈伤组织的形态特征质地：松脆易碎的颗粒状；紧密坚实的结块状；水渍或浆糊状。
颜色：白色或淡黄色；淡绿色或绿色；黄色至褐色。
一般，淡黄或淡绿/绿色松脆（近圆形）或致密的颗粒状愈伤再生能力较强，白色/灰白色或黄褐色、浆糊状或紧实（香蕉形）的愈伤再生能力差。
3. 影响愈伤诱导的关键因素愈伤的形成是外植体、培养基和培养条件诸因素互作的结果。
迄今，几乎从各种外植体诱导形成愈伤。
其关键主要不在于外植体，而是培养基，尤其是激素的种类和浓度。
生长素为愈伤诱导和增殖所必需，细胞分裂素视外植体来源而异。
二、愈伤组织的继代培养继代培养（subculture）：将原有培养物转移到新鲜培养基上继续培养的过程称为~。
愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养枯竭，水分散失，代谢物积累，致使其生长缓慢甚至停止，须进行继代培养。
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五、实验步骤
芦荟 1、将准备好的芦荟幼苗在无菌中冲洗数次。 2、取茎尖部分，再冲洗1-2次，淋干，紫外灭菌30分钟 3、在超净台上，用75%的乙醇将茎尖浸泡30-60s 4、再用升汞（0.01％）浸5-l0min，最后用无菌水冲洗数 次。无菌纱布吸干水份 5、用解剖刀取出茎尖生长点的组织切块，接种到愈伤组 织诱导培养基上。 MS+(1一6mg/ L)BA+(0.1一0.5mg/L)NAA 苄基嘌呤（BA）；萘乙酸(NAA) 6、培养条件：光照 10-12h，光照度为 1000一2000Lx， 温度(25士)2℃。
实验一植物愈伤组织诱导培养
一、实验名称
植物愈伤组织诱导培养
二、实验目的
1、掌握MS培养基的配制方法 2、初步掌握植物外植体无菌操作的基本步骤
三、实验材料
1、芦荟 2、月季
四、主要实验器材
1、剪刀 2、解剖刀 3、长角镊子 4、超净工作台 5、9cm培养皿 6、封口膜 7、烧杯 8、吸管 9、废液缸 10、橡皮筋
月季
1、枝条切去叶，再剥去附在茎上的叶柄及皮刺。 2、清水清洗、擦干 3、2～3厘米一段，每段至少一个侧芽。 4、装入消毒过的培养皿，紫外灯灭菌30分钟。 5、用饱和漂白粉上清液作表面灭菌25～30分钟 （也可使用乙醇；升汞） 6、无菌水涮洗数次，无菌纱布吸干水分 7、接种到培养基上： MS+(0.3一10mg/ L)BA 8、培养条件：光照 10-12h，光照度为 800一 1200Lx，温度21-25℃。