愈伤组织诱导培养
愈伤组织的诱导和培养
班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223愈伤组织的诱导和培养一、实验目的及意义植物愈伤组织的诱导和培养在植物科学的基础研究和应用研究中都有重要的意义。
通过本次实验，可以初步掌握植物外植体材料消毒、接种的无菌操作技术，愈伤组织的诱导方法和愈伤组织继代培养的方法。
二、实验原理植物组织与细胞培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。
如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择适当的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得植物组织培养，成功的基本前提和重要保证。
由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织（callus）。
植物生长调节剂如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）等是诱导外植体形成遇上组织的重要因素。
三、实验仪器与药品超净工作台，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，75%乙醇，酒精消毒棉材料：烟草无菌苗，甘薯无菌苗四、实验步骤1.按下表分别配制培养基将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌后水平放置凝固2.接种前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20~30min，关闭紫外灯，开启通风开关。
洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。
进入超净工作台，用酒精棉擦拭台面（手勿伸出工作台），台面完全风干后点燃酒精灯。
3.接种开始时，将镊子及手术刀在酒精中浸泡，并在酒精灯外焰上烧炽片刻，充分冷却。
取幼嫩的烟草（甘薯）叶片，用手术刀切割成小片，再用镊子将其接种至相应的培养基上，每瓶接种3~5片，封口后取出超净工作台，标注姓名、日期、培养基和接种材料。
4.将上述培养材料常温暗培养，每隔7天观察一次，并记录培养情况五、实验结果组织长芽，而当生长素含量大于细胞分裂素含量时，二者共同作用在室温下可诱导外植体生成不定根，也可形成愈伤组织，细胞色素沉淀情况严重；NAA为植物生长素，6-BA为细胞分裂素，促进扦插生根，而当细胞分裂素含量大于生长素含量时，二者共同作用在室温下可诱导外植体生成不定芽，此次实验由于温度非形成愈伤组织的最适温度，所以未形成完整的愈伤组织细胞团。
植物生物技术 第三章 植物愈伤组织的诱导与分化培养
第一节愈伤组织的诱导和继代培养
2. 愈伤组织的形态和细胞学特征
• 根据组织学观察、外观特征及其再生能力、再生方式等，愈伤组织分成两大类 ：胚性愈伤组织（embryonic callus，EC）和非胚性愈伤组织（non-embryonic callus，NEC）。
• 愈伤组织在长期的培养中能够形成分生组织区、管胞和色素细胞，或者形成体 细胞胚，这种能够形成体细胞胚的愈伤组织叫做胚性愈伤组织(embryogenic callus)
愈伤组织 体细胞胚
再生植株
第二节 愈伤组织分化与植株再生
第二节 愈伤组织分化与植株再生
2. 植物体细胞胚的产生方式及结构特征
• 胚状体起源于外植体表面已分化的细胞 • 形成层细胞或薄壁细胞转变成迅速分裂的细胞，形成拟分生组织的细胞团和
小块愈伤组织，进而产生体细胞胚 • 在悬浮培养时,游离细胞产生细胞团,这些细胞团长大变成胚性细胞复合体,
Quiroz-Figueroa et al., 2007. Plant Cell Tiss Organ Cult
第二节 愈伤组织分化与植株再生
4. 体细胞胚的起源：
• 两种起源途径: 单细胞起源和多细胞起源
单细胞起源：可见单细胞发生的均 衡细胞分裂，胚与母体组织之间以一 个类似胚柄的结构相连 (Williams
一、器官发生与植株再生
• 器官发生：是指培养条件下的组织 或细胞团（愈伤组织）分化形成不 定根（adventitious roots）、 不定芽（adventitious shoots） 等器官的过程 。
第二节 愈伤组织分化与植株再生
1、器官分化过程：三个生长阶段
• 第一阶段是外植体经过诱导形成愈伤组织
and Maheswaran 1986).
水稻愈伤组织的诱导实验报告
水稻愈伤组织的诱导实验报告实验目的：本实验旨在探究水稻愈伤组织的诱导方法，为将来的水稻遗传改造研究提供参考。
实验材料和仪器：1. 材料：水稻种子、MS培养基、植物生长调节剂2,4-D、生长调节剂TDZ、无菌器具、琼脂、无菌操作室。
2. 仪器：无菌操作台、显微镜、实验室平衡器等。
实验步骤：1. 生物材料准备：选取幼苗期生长良好、品种鲜明的水稻种子作为材料。
将水稻种子进行表面消毒，处理方法为分别用70%的酒精和5%的次氯酸钠(1:1)混合消毒3-5分钟，然后充分清洗。
2. 建立组织培养体系：将消毒后的水稻种子在无菌操作台上进行分离培养。
将种子取出后，从胚乳中取出胚轴，用剪刀消毒后放入含有MS培养基的无菌培养瓶中，置于无菌操作室中进行培养。
在35-37°C下连续培养3-5天。
3. 筛选愈伤组织：将培养2-3天的胚轴等植物试管苗等组织放置在含有不同浓度的2,4-D和TDZ的培养基中，培养10-15天。
筛选出生长具有愈伤能力的组织，采用显微镜等方法进行观察，并进行相应的分离和培养。
4. 愈伤组织的维持和复壮：将筛选出的愈伤组织维持在含有2,4-D和TDZ的培养基中，定期进行转移或分离。
当愈伤组织增生至一定程度后，将其转移到不含激素的培养基中，进行复壮。
实验结果：在实验过程中，我们选择了4个不同浓度的2,4-D和TDZ进行培养，筛选出了愈伤组织，并进行了维持、修复工作。
经过5次转移和增殖培养，我们成功地建立了稳定的水稻愈伤组织体系。
结论：本实验采用的方法可行，成功地建立了稳定的水稻愈伤组织体系。
本研究为今后的水稻遗传改造和抗性育种提供了良好的基础。
胡萝卜愈伤组织的诱导培养
本科学生综合性实验报告
学号姓名
学院生命科学学院专业、班级09级生物科学B班实验课程名称植物组织培养实验
教师及职称龙维彪（讲师）
开课学期2011 至2012 学年下学期填报时间2012 年 6 月 1 日
一．实验设计方案
二．实验报告
⑴胡萝卜愈伤组织的诱导结果：
经过诱导，4瓶都出现污染状况，做继代培养用小组的实验材料。
⑵继代培养的结果：
如上图所示，继代培养得到的三瓶均无污染，三瓶中的愈伤组织增殖情况均良好，其中3瓶特别好，愈伤组织呈现结构疏松的特点。
污染情况：无污染。
长势情况：长势良好。
颜色情况：部分颜色有点暗淡，少部分为金黄色，颜色发亮。
植物愈伤组织诱导培养基的配制
植物愈伤组织诱导培养基的配制植物愈伤组织诱导培养基（简称愈伤培养基）是一种含有特定激素和营养物质的培养基，其主要作用是诱导植物体组织形成愈伤组织，从而实现植物组织培养、育种等研究。
本文将介绍植物愈伤组织诱导培养基的配制。
一、基础盐溶液的配制基础盐溶液是愈伤培养基的基础成分，其配方基本固定，主要成分包括无机盐和蔗糖等。
基础盐溶液的配入量不同，会影响培养基的pH等指标。
基本的基础盐溶液配方：碳酸钾（K2CO3）2.5g、硝酸铵(NH4NO3)1.0g、硫酸镁（MgSO4·7H2O）1.0g、氯化钙（CaCl2·2H2O）0.15g、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.25g、蔗糖20g、亚硫酸氢钠（NaHSO3）0.25g、维生素B5（nicotinic acid amide）0.1mg、维生素B1（thiamine·HCl）0.1mg，配入1L蒸馏水中。
注意：不同植物种类的愈伤培养基种类略有不同，需要根据实验需求和特性进行差异化调整。
二、植物生长素的添加植物生长素是愈伤组织诱导的必要因素之一，常用的生长素有IAA、IBA、NAA、2,4-D 等，其中2,4-D是最常用的生长素。
植物生长素的添加量需要视植物种类、处理目的和生长素种类而定。
一般情况下，2,4-D的添加量为1-2mg/L，但不同品种之间的生长素敏感性可能不一致，因此需要优化试验条件。
如果使用IBA或NAA等生长素，其配入量一般为0.1-0.5mg/L。
三、其他添加物除了基础盐溶液和植物生长素外，愈伤培养基还需要添加其他营养物质、激素等。
下面列举了一些常用的添加物及其配入量：1、硫酸甘露醇（mannitol）：2-3%。
用于储存或早期培养。
2、水杨酸（Salicylic acid）：10-500mg/L。
用于抑制愈伤组织的黑化和坏死。
3、多种维生素：如维生素B1、B5、C，一般用于添加到培养基中的含量为5-10mg/L。
植物愈伤组织诱导培养实验指导--李老师资料
植物愈伤组织诱导培养实验指导--李老师资料植物愈伤组织诱导培养实验实验目的：1.掌握植物愈伤组织的诱导和培养技术；2.了解植物生长素和植物生长调节因子的作用；3.实践动手能力，培养分析问题、解决实际问题的能力。
实验步骤：1.实验材料种子：芸苔、小麦、玉米等试剂：琼脂、SD综合培养基、激素溶液、酒精灯、移液管等2.种子的表面消毒取适量的芸苔种子，用70%的酒精灯烧消毒。
将种子放入无菌蒸馏水中浸泡20分钟，再用三次含酸性消毒液（NaClO）洗涤。
洗涤后，用无菌蒸馏水洗三次，并将水倒掉。
将种子放在干净、无菌的滤纸上晾干。
3.愈伤组织诱导3.1 试剂配制将SD综合培养基和激素溶液按体积比例配制成诱导培养基。
激素溶液的配方参考如下：IAA：千叶素：6-BA的比例为 10：1：1，浓度为0.108 mg/L；3.2 培养陈列室准备工作实验室必须具有无菌灯、搅拌器、制冷箱或培养箱等基本的实验设备。
实验前清洗设备，使用高压蒸汽或酒精灯等方式灭菌。
在无菌条件下制备琼脂、移液管、培养瓶等。
在实验操作台上，用70%的酒精清洗双手，并用无菌纸巾擦拭干净。
3.3 培养基的制作制好的培养基分装到15ml的培养瓶中。
琼脂用70%酒精擦拭干净，均匀铺在实验平台上，用于接种组织。
3.4 组织接种将种子放在培养基上，用无菌铁丝按一定距离排列成一排。
取出种子，切成0.5-1cm的暴露在外的子叶或幼芽，然后在接种组织区域按照一定距离进行均匀排列。
将培养瓶密封，并放在指定的温度下生长。
4．实验结果的处理和分析4.1 愈伤组织的诱导情况观察家哈的发育情况，如出现愈伤组织的形成，记录其在构型，大小等。
4.2 理化指标的测定在诱导完成后的期间，测定愈伤组织中的蛋白质含量，葡萄糖含量，游离氨基酸含量等指标。
注意事项：1.实验过程中要注意操作技巧，避免污染；2.在培养过程中，要注意温度和光照的控制；3.进行实验时，要做好实验记录和实验数据分析工作；4.实验后，要注意实验设备的清洁和归档。
实验1 愈伤组织的诱导
实验1 愈伤组织的诱导1、实验目的（1）学习植物材料表面灭菌的常规方法；（2）了解接种的无菌操作技术；（3）学习诱导植物器官形成愈伤组织的方法。
2、实验原理植物组织培养是应用无菌操作的方法，培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。
如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。
由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，可以通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织。
3、实验仪器和试剂仪器：超净工作台、光照培养箱、酒精灯、打火机、记号笔、脱脂棉、75%酒精及棉球。
无菌器材：无菌吸水纸（定性滤纸）、灭菌培养皿、无菌水、镊子、解剖刀。
植物材料：直根胡萝卜、烟草叶片。
试剂：95%乙醇、0.1%氯化汞。
培养基：MS+1mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+10g/L琼脂,pH5.84、实验步骤（1）接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种间紫外灯，照射约30 min，然后关闭紫外灯，通风20 min后，打开日光灯即可进行无菌操作。
（2）外植体预处理：将胡萝卜根用流动的自来水冲洗干净，用小刀削去其表皮1-2mm，切成大约15-20mm厚的块段。
（3）以75%乙醇棉将手擦试一遍。
以下操作全部在无菌条件下进行。
（4）外植体消毒：用0.1%的升汞消毒1min-3min（烟草叶片消毒10秒钟左右）,然后用无菌水中漂洗3次，每次2分钟。
（5）将胡萝卜片放入垫有无菌滤纸的培养皿中，一手用消毒好的镊子固定胡萝卜，一手用灭菌后的解剖刀切除胡萝卜块段截面的表面部分，余下部分切成包含形成层的长、宽约5mm，厚约5mm的小块。
在完成切割后，将解剖刀和镊子放入95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后，放回原处，待冷却后即可使用。
第三章-愈伤组织诱导
第三章愈伤组织的诱导与培养第一节愈伤组织的诱导与继代培养愈伤组织（callus）: 在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。
大部分外植体细胞须经脱分化形成愈伤，才能再分化成完整植株，只有茎尖等少数细胞只恢复为分生状态但不分裂，直接再分化。
愈伤组织的诱导与分化是植物组培的基本环节。
一、愈伤组织的诱导及其形态特征1、愈伤组织的诱导1）起动期/诱导期（initiation/induction stage, Induction of growth）外植体细胞在外源激素作用下，经脱分化而恢复分裂状态，开始形成愈伤。
细胞外观无明显变化，代谢旺盛，合成加强，为分裂做准备。
持续十几小时~几天。
2）分裂期（divition stage/phase）：外植体切口边缘膨大，外层细胞迅速分裂，体积变小，具分生细胞的特征，细胞数速增。
3）形成期（formation stage/Differentiation phase）：外植体表层细胞分裂减缓，内部细胞开始分裂，大量细胞形成瘤状/泡状或片状结构。
若不及时继代，将分化出拟分生组织瘤状物和维管组织，又称分化期。
2. 愈伤组织的形态特征质地：松脆易碎的颗粒状；紧密坚实的结块状；水渍或浆糊状。
颜色：白色或淡黄色；淡绿色或绿色；黄色至褐色。
一般，淡黄或淡绿/绿色松脆（近圆形）或致密的颗粒状愈伤再生能力较强，白色/灰白色或黄褐色、浆糊状或紧实（香蕉形）的愈伤再生能力差。
3. 影响愈伤诱导的关键因素愈伤的形成是外植体、培养基和培养条件诸因素互作的结果。
迄今，几乎从各种外植体诱导形成愈伤。
其关键主要不在于外植体，而是培养基，尤其是激素的种类和浓度。
生长素为愈伤诱导和增殖所必需，细胞分裂素视外植体来源而异。
二、愈伤组织的继代培养继代培养（subculture）：将原有培养物转移到新鲜培养基上继续培养的过程称为~。
愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养枯竭，水分散失，代谢物积累，致使其生长缓慢甚至停止，须进行继代培养。
第五章愈伤组织培养
例：百合：鳞茎的鳞片分化能力：外层>中层>内层
（2）植物激素的作用（外因）
适宜的植物激素配比在器官分化中有着重要的作用。
生长素
高：有利于根的形成和愈伤组织的形成；
＝ 适中：有利于根芽的分化；
细胞分裂素 低：有利于芽的形成
芦荟的植物组织培养过程
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芽（单芽、丛芽）
第二节 愈伤组织中的形态发生
➢ 脱分化：细胞由静止期进入分裂期，恢复分裂机能
分裂期外植体的特征:
细胞分裂快，结构疏松， 缺少有组织的结构，维持 其不分化的状态，颜色浅 而透明。
细胞的主要表现:
外层细胞在外源激素的作用下，迅速分裂， 使得外层细胞数目增加， 细胞体积缩小，细胞的核和核仁增大到最大。 逐步回到分生组织状态。 随着细胞不断分裂和生长，细胞总干重、蛋 白质和核酸量大大增加，新细胞壁合成极快。 细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构， 维持其不分化的状态，颜色浅而透明。
生愈伤组织
愈伤组织生长良好
愈伤组织增殖强
NOA 萘氧乙酸
无愈伤组织形成 愈伤组织增殖中等
愈伤组织增殖中等
NOP 萘氧丙酸
无愈伤组织形成 愈伤组织增殖中等愈伤组 愈伤组织增殖强 织增殖强
第五章 愈伤组织的培养
第一节 愈伤组织的诱导和分化 第二节 愈伤组织中的形态发生 第三节 人工种子
第二节 愈伤组织中的形态发生
3.4 体细胞胚状体诱导的影响因素
1）生长素 形成体细胞胚的关键是除去或降低培
养基中的生长素成分（如2,4-D）。 愈伤组织在生长素0.5～1mg/L的培养
烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立
烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立一、概述烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立，是植物组织培养领域中的一项重要研究。
烟草作为一种重要的经济作物，其组织培养技术的研究对于提高其生产效率、优化品质具有重要意义。
愈伤组织的诱导是植物组织培养的第一步，也是后续细胞悬浮培养、基因工程操作等的基础。
烟草愈伤组织的诱导，通常通过无菌操作，利用激素等生长因子刺激烟草叶片等外植体细胞脱分化形成。
这一过程不仅受到激素种类和浓度的影响，还受到光照、温度、湿度等培养条件的影响。
优化诱导条件，降低褐化等不利因素的影响，是烟草愈伤组织诱导研究的关键。
细胞悬浮培养体系的建立，则是进一步将愈伤组织转化为可用于大规模生产和基因操作的细胞悬浮液。
通过选择适当的培养基、调节生长条件、优化细胞悬浮密度等手段，可以实现烟草细胞的稳定增殖和高效表达。
本文旨在探索烟草愈伤组织的诱导条件以及细胞悬浮培养体系的建立方法，通过系统的实验设计和优化，为烟草组织培养技术的发展和应用提供理论基础和实践指导。
这一研究也将为其他植物的组织培养提供有益的参考和借鉴。
1. 烟草愈伤组织诱导与细胞悬浮培养体系的重要性烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立，在植物组织培养、基因工程以及植物快繁等多个领域都具有重要的科学意义和实践价值。
愈伤组织的诱导是植物组织培养中的关键环节。
通过特定的培养基和培养条件，可以诱导烟草叶片等外植体脱分化形成愈伤组织。
这一过程不仅验证了植物细胞的全能性，而且为后续的细胞悬浮培养提供了适宜的起始材料。
细胞悬浮培养体系的建立为植物细胞的大规模培养和遗传转化提供了平台。
通过优化悬浮培养条件，可以获得大量生长状态良好的细胞，进而用于后续的基因转化、次生代谢产物生产等研究。
悬浮培养体系还可以用于筛选具有优良性状或抗性的细胞株系，为烟草育种提供新的途径。
烟草愈伤组织诱导及细胞悬浮培养体系在植物快繁方面也具有潜在的应用价值。
通过诱导愈伤组织再分化形成不定芽或胚状体，可以在短时间内获得大量的植株，从而实现烟草的快速繁殖。
水稻愈伤组织的诱导实验报告
水稻愈伤组织的诱导实验报告
实验目的：
通过诱导方法获取水稻愈伤组织，为后续的基因转化等实验打下基础。
实验材料和设备：
水稻种子、MS培养基、2,4-D溶液、NaClO溶液、无菌操作
器材、显微镜等。
实验步骤：
1.种子消毒：将水稻种子放入1% NaClO溶液中浸泡10分钟，再用去离子水洗净后，放进无菌操作室中。
2.种子发芽：将消毒后的种子放进含有营养的MS培养基中，
在25℃下进行光照培育。
3.愈伤组织诱导：将发芽后的幼苗从培养基中取出，用无菌水
清洗。
将茎部和叶片等不同部位的组织嫁接在含有2,4-D溶液
的MS培养基上，培养在25℃下、光照下，观察诱导组织的
生长情况。
4.分离愈伤组织：当组织生长到一定大小后，用无菌操作器材
将组织用无菌剪刀分离下来。
5.愈伤组织培养：将分离出的愈伤组织放入含有NAA、BA、MS培养基中进行培养。
结果分析：
在诱导的茎部和叶片等不同部位，均出现了白色愈伤组织的诱导生长。
经过分离和培养，得到了纯化的愈伤组织。
通过显微镜观察发现，愈伤组织的细胞间隙变窄，胞间质增多，中心细胞数量增多，细胞核增大，一些细胞内的小器官也出现转化现象。
结论：
通过2,4-D溶液的诱导方法，可以在水稻幼苗的不同部位诱导出白色愈伤组织，愈伤组织的分离和培养也取得了成功。
实验结果为后续的基因转化、基因工程等实验提供了基础。
细胞工程实验-植物愈伤组织诱导培养基的配制
实验一植物愈伤组织诱导培养基的配制一、实验目的掌握培养基的配制，灭菌等基本实验操作技术。
二、实验原理培养基是离体培养组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供的近似生物体内生存的营养环境。
完善的植物培养基配方为水、无机营养成分、有机营养成分、生长调节物质还有琼脂。
MS培养基是目前使用最普遍的培养基。
其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。
MS固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养，其液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显的成功。
MS培养基的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。
和其它培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的显著特点。
三、主要仪器与试剂1.实验仪器：搪瓷杯、玻璃棒、量筒、移液管、加样器、移液枪、电子天平、药匙、称量纸、电热炉、pH试纸、三角培养瓶、试剂瓶、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、镊子、解剖刀2.实验试剂：琼脂、蔗糖、各类MS母液、2,4-D、HCl、NaOH、三蒸水四、实验步骤1.按照配方配制培养基时,先将储存母液按顺序摆放好，根据欲配制的总体积，量取各种不同体积的母液，加入搪瓷杯中，并加入1mL2，4-D后，加入三蒸水至大约400ml。
2. 称取15g蔗糖加入搪瓷杯中，调节pH至5.7-5.8。
3.加入琼脂4.5g，加热搅拌溶解，沸腾后立即端离火源，分装在100ml的三角培养瓶中拧紧瓶盖。
4.取一个试剂瓶，加入适量去离子水。
5.将配置好的培养基、装有去离子水的试剂瓶以及一个空试剂瓶、培养皿、镊子、解剖刀放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌，备用。
五、实验结果MS培养基配制完成。
植物组织培养前期准备完成。
六、思考题1.培养基配制应注意哪些问题？①注意琼脂和蔗糖的称量②一定要添加2,4-D③配制MS培养基时应该注意调节pH至5.7~5.8，因为过酸培养基不易凝固，过碱培养基会变硬，同时过酸或过碱还会影响到培养材料的生长。
植物组培2-愈伤组织的诱导
植物组织培养-愈伤组织的诱导一、【实验目的】掌握植物愈伤组织诱导、继代、器官分化的原理。
二、【实验原理】植物组织培养是将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。
植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。
而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。
植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。
超净工作台工作原理：本工作台是一种水平单向流型局部空气净化设备室内空气→预过滤器(初滤) →小型离心风机压入静压箱→高效空气过滤器(精滤) →出风面吹出洁净气流(具有一定的、均匀的断面风速）→不断排除工作区原来的空气→形成高洁净的工作环境三、【实验仪器和材料】仪器：培养室，高压灭菌锅，水浴锅，解剖刀，三角烧瓶（100mL ），烧杯，量筒，培养皿，棉线，接种箱或超净工作台，分析天平，长镊子，剪刀，容量瓶，移液管，牛皮纸试剂：乙醇、2 ，4 – D （生长素类似物）、次氯酸钠、6- 苄基氨基腺嘌呤（6-BA ）、MS 培养基、0.1 mol/L NaOH 与0.1 mol/L HCl材料：绿豆、胡萝卜、自选材料四、【实验步骤】（1）用70～75%的酒精棉擦拭双手和操作台面，进行常规的无菌操作准备。
（2）将植物体用自来水冲洗后,用酒精棉擦拭欲取材部位表面, 或于70%酒精中浸沾数秒钟。
（3）将材料放入已灭菌的100ml烧杯（或试剂瓶）中，加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡5分钟。
（4）弃次氯酸钠浸泡液，再加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡10分钟。
（5）弃次氯酸钠浸泡液，用无菌水浸泡漂洗3～4次，每次1～2分钟，用无菌镊子搅动。
（6）将已灭菌的植物材料置于灼烧后冷却的金属盘中，按无菌操作要求剥去外皮，用解剖刀切成5mm厚的薄片，弃去两头的两片，取中间部分的薄片，用镊子将其接种在愈伤组织诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶4～6片，均匀分散，以绿豆为材料时，将绿豆纵切或横切，去皮后分别接种。
第三章_愈伤组织诱导及分化调控
1. 外植体的选择 需考虑以下因素:
(1) 外植体的基因型 (2) 同一植物不同部位外植体，其细胞的分化能
力有相当大的差别 (3) 植物胚与幼龄组织器官比老化组织、器官更
容易去分化
一个细胞向分生状态回复过程所能进行的程度， 取决于它在原来所处的自然部位上已经达到的细 胞分化程度和生理状态
再生植株：器官发生(organogenesis)和体细胞 胚胎发生(somatic embryogenesis)
体细胞胚胎发生：指从体细胞进行的类胚结构的 生产。体细胞胚是一个二极结构，不物理地附着 于原组织，每一个体细胞胚称为胚状体，它可以 同合子胚一样发育成植株。
器官发生：是指培养条件下的组织或细胞团（愈 伤组织）分化形成不定根（adventitious roots）、不定芽（adventitious shoots）等器 官的过程 。
从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具 有全能性。
差异：（1） 受精卵的全能性最高 （2） 受 精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖 细胞的低。
全能性实现的两个必须满足的条件： 把具有较强全能性的细胞从植物组织抑制性影
响下解脱出来 要给予植物细胞一定的刺激
二、几个重要的概念
外植体（explant): 植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，
（2）物理因素 光：
很多光照条件下，一些植物均能进行器官发生， 说明光周期并不是非常重要的因子
有的植物在光、暗交替条件下才能形成芽，而 在连续光照下则不能
尽管如此，多数植物需要一个稳定的光周期， 多数培养条件是14-16h光照，8-10h黑暗
温度：不同植物不一样，需要摸索，如烟草和棉 花就不一样
B
植物愈伤组织诱导培养基的配制
实验一植物愈伤组织诱导培养基的配制一、实验目的1、掌握植物愈伤组织诱导、继代、器官分化的原理。
2、培养基的配制，灭菌等基本实验操作技术。
二、实验原理植物组织培养是将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。
植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。
而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。
植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。
三、仪器试剂培养皿及培养架、光照培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、解剖刀、弯头镊子、剪子、100ml烧杯、培养皿（或不锈钢浅盘）、封口膜、棉线、橡皮筋、次氯酸钠（或HgCb）、MS 培养基全部试剂、植物激素及生长调节物质、无水乙醇、工业酒精、胡萝卜四、实验步骤1、培养基的制备①用于配制培养基的水最好是三蒸水。
②所用的各种化学药品：分析纯级别的试剂，避免药品的交叉污染和混杂。
③配制培养基最方便的方法是预先配制好不同组分的培养基母液，存放在2〜4C冰箱内，使用时按比例稀释配用即可。
①按照配方配制培养基时，先将储存母液按顺序摆放好，根据欲配制的总体积，量取各种不同体积的母液，加入2，4-D（2mg/L），先加三蒸水至大约400ml。
②称取加入蔗糖（浓度3%）,调节pH至。
③加入琼脂（8-9g/L ）加热搅拌溶解，沸腾后立即端离火源（第一个大气泡从缸底上升顶破泡沫层），分装在100ml的三角培养瓶中（一般以容器的1/3〜1/4体积为宜），拧紧瓶盖。
（培养基的pH值直接影响培养物对离子的吸收，过酸或过碱不仅影响到培养材料的生长，而且还影响到琼脂的凝固。
经高压高温灭菌后，由于某些成分的降解或氧化，酸度会增加（pH值一般可降低），因此调整pH值时应加以考虑。
植物愈伤组织诱导培养实验指导--李老师
植物组织培养基的配制与植物愈伤组织诱导一、实验目的；通过植物组织培养基和植物愈伤组织诱导实验的学习和训练，使学生了解植物组织培养的基本原理和操作技术，初步掌握MS固体培养基制备方法、外植体的常规灭菌技术以及愈伤组织诱导方法。
二、实验原理：根据植物细胞全能性原理，培养植物材料。
即在无菌条件下，将植物的器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）放在人工培养基上进行培养，通过细胞分裂，形成一团薄壁细胞，即愈伤组织。
愈伤组织可以在适宜的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下进行再分化，重新产生出植物的各种器官和组织，进而发育成完整的植株。
三、实验内容实验包括以下3部分内容：实验1-1、植物组织培养基母液的配制和保存实验1-2、MS培养基的配制与灭菌实验1-3、胡萝卜愈伤组织的诱导实验1-1 植物组织培养基母液的配制和保存1、目的要求学习植物组织培养基母液的配制方法，为培养基的配制做准备。
2、基本原理植物培养基是植物离体培养的组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供近似活体生存的营养环境，主要包括水、大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节等物质。
在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将培养基成分首先配制成比实际培养基浓度大若干倍的母液，然后在配制培养基时，再根据所需浓度，按比例稀释。
本实验以MS培养基为例，学习培养基母液的配制。
MS培养基母液可分为：MS大量元素母液、MS微量元素母液、MS铁盐母液和MS有机化合物母液等。
另外，还要配制生长激素母液，在不同类型的培养基中使用。
3、实验仪器设备和试剂3.1仪器、用具分析天平、酸度计（或pH试纸）、冰箱、药匙、玻棒、称量纸、滴管、洗瓶、记号笔、烧杯（50ml、100ml、200ml）、容量瓶（100ml、500ml、1000ml）、磨口试剂瓶（100mL、200mL、500ml、1000ml）、量杯、量筒、移液抢、微波炉等。
3.2试剂（1）95%乙醇、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。
愈伤组织培养
愈伤组织培养一、外植体的选择愈伤组织培养的第一步是选择适当的外植体。
外植体可以是植物的根、茎、叶、花、果实等任何部分，但必须具有分生能力。
通常，选择新鲜、健康的幼嫩组织作为外植体，因为这些组织分生能力强，容易诱导出愈伤组织。
同时，外植体的选择还必须考虑其遗传背景、生理状态以及是否容易进行消毒等。
二、愈伤组织的诱导外植体在适当的培养基和条件下，能够被诱导形成愈伤组织。
这个过程涉及到细胞的脱分化，即细胞从特定的组织类型转变成未分化的状态。
为了成功诱导出愈伤组织，需要使用含有足够营养物质和植物生长调节物质的特殊培养基。
例如，高浓度的生长素和细胞分裂素可以促进细胞分裂和组织形成。
三、愈伤组织的增殖诱导出的愈伤组织需要在适合的培养基中进一步增殖。
这个过程需要持续监控并调整培养基的成分，以确保愈伤组织能够快速、健康地生长。
同时，还需要控制培养条件，如温度、光照、湿度等，以提供最佳的生长环境。
四、细胞分化的诱导增殖后的愈伤组织可以进行进一步的分化。
这个过程可以通过改变培养基的成分或添加特定的生长调节物质来实现。
例如，某些激素可以诱导愈伤组织分化成特定的组织或器官。
五、遗传稳定性的维持为了保持愈伤组织的遗传稳定性，通常需要进行长期的培养和多代的筛选。
这个过程可以通过定期检查染色体数目和结构来实现，以确保细胞的遗传稳定性。
同时，通过定期进行克隆繁殖，可以进一步维持细胞的遗传稳定性。
六、培养基的选择与优化愈伤组织培养的成功与否，很大程度上取决于培养基的选择和优化。
培养基是愈伤组织获取营养的来源，必须含有细胞生长所需的各类营养物质，如碳源、氮源、维生素、矿物质等。
同时，还需要添加植物生长调节物质，如生长素、细胞分裂素等，以调节细胞的生长和分化。
对于不同的外植体和实验目的，可能需要选择不同的培养基。
例如，MS、N6、B5等都是常用的培养基配方。
此外，培养基的pH值、渗透压等也需要进行适当的调整。
为了优化培养基，通常需要进行一系列的试验和筛选，以找到最适合特定组织或细胞的培养基配方。
S4实验四 植物叶片愈伤组织的诱导培养(理论)
实验四植物叶片愈伤组织的诱导培养（理论）一、概念愈伤组织（callus）◆自然状况下指植物在受伤后于伤口表面形成的一团薄壁细胞。
◆植物组织培养中，指在人工培养基上由外植体组织增生细胞产生的一团不定形的疏松排列的薄壁细胞。
二、植物愈伤组织及形成过程外植体形成愈伤组织，标志着植物组织培养的开始。
1、形态结构◆形状不规则，结构疏松◆有大量的分生中心◆细胞排列毫无次序◆内有大量的细胞间隙◆颜色不一致优良的愈伤组织所具备的特性：A、高度的胚性或再分化能力，以便从愈伤组织得到再生植株B、易散碎，可建立优良的悬浮体系，并可分离出全能性的原生质体C、旺盛的自我增殖能力，可建立大规模的愈伤组织无性系D、经过长期继代保存而不丧失胚性，可进行各种遗传操作2、愈伤组织形成过程A、诱导期◆细胞准备分裂◆合成代谢活动加强◆细胞大小基本不变诱导期时间长短因植物种类、外植体生理状况及外部因素而异B、分裂期◆一分为二，不断增殖◆形态结构与生理生化发生变化主要表现：◆数目迅速增加◆细胞平均鲜重下降◆细胞体积小◆核与核仁增至最大◆ RNA减少，DNA保持不变◆组织总干重、蛋白质与核酸含量增加◆新细胞壁合成极快C、形成期细胞经诱导、分裂形成无序结构愈伤组织的时期。
细胞特点：◆大而不规则、高度液泡化◆无次生细胞壁与胞间连丝◆整个组织松散◆表面以下约5~10个细胞生长中心本时期的愈伤组织是最适合获得单细胞或原生质体的，是建立悬浮体系的最好时期。
D、分化期停止分裂的细胞发生生理代谢变化，导致形成由不同形态和功能的细胞组成的愈伤组织。
本期愈伤组织特点：◆细胞分裂部位由表层转变到深层◆分裂方向由单周分裂变为深层局部分化◆分化组织瘤状结构形成◆维管组织形成瘤状结构的出现使愈伤组织逐渐形成具有维管组织，呈分散的节状结构形成，出现各类组织细胞。
细胞分裂素对促进维管化组织有重要作用3、愈伤组织的继代培养◆长期保存愈伤组织的一种方法◆直径到2~3cm时与外植体分离，单独培养◆选取其生长迅速的部位作继代培养◆分化与再生植株时，应选生长较慢的愈伤组织◆每一继代培养时间取决于其生长速度◆一般可在3~6周继代一次三、植物愈伤组织的遗传变异1、引起异质性的原因A、外植体染色体倍数性与遗传组成不同的细胞经诱导后的分裂B、培养条件引起的不规则性它们常同时发挥作用2、初生愈伤组织接种到培养基上后，细胞核内的变化：A、正常有丝分裂B、先核内复制，后有丝分裂C、先核碎裂，后有丝分裂◆初生愈伤组织的异质细胞群体性反映了外植体中的染色体状况反映了愈伤组织诱导期间核变异的结果◆在诱导中，会出现二倍体、多倍体、单倍体、非整倍体与染色体结构变异体等3、建成愈伤组织◆选择作用的结果◆只有一种主要核型占优势◆培养基成分和培养类型的影响◆异质群体中细胞间的竞争与互作的影响四、影响因子及培养条件1、培养基2、组织原有的倍数性3、培养环境的条件五、愈伤组织的发生方式发生方式：1、器官发生指细胞或愈伤组织通过形成不定芽再生成植株的过程。
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五、实验步骤
芦荟 1、将准备好的芦荟幼苗在无菌中冲洗数次。 2、取茎尖部分，再冲洗1-2次，淋干，紫外灭菌30分钟 3、在超净台上，用75%的乙醇将茎尖浸泡30-60s 4、再用升汞（0.01％）浸5-l0min，最后用无菌水冲洗数 次。无菌纱布吸干水份 5、用解剖刀取出茎尖生长点的组织切块，接种到愈伤组 织诱导培养基上。 MS+(1一6mg/ L)BA+(0.1一0.5mg/L)NAA 苄基嘌呤（BA）；萘乙酸(NAA) 6、培养条件：光照 10-12h，光照度为 1000一2000Lx， 温度(25士)2℃。
实验一植物愈伤组织诱导培养
一、实验名称
植物愈伤组织诱导培养
二、实验目的
1、掌握MS培养基的配制方法 2、初步掌握植物外植体无菌操作的基本步骤
三、实验材料
1、芦荟 2、月季
四、主要实验器材
1、剪刀 2、解剖刀 3、长角镊子 4、超净工作台 5、9cm培养皿 6、封口膜 7、烧杯 8、吸管 9、废液缸 10、橡皮筋
月季
1、枝条切去叶，再剥去附在茎上的叶柄及皮刺。 2、清水清洗、擦干 3、2～3厘米一段，每段至少一个侧芽。 4、装入消毒过的培养皿，紫外灯灭菌30分钟。 5、用饱和漂白粉上清液作表面灭菌25～30分钟 （也可使用乙醇；升汞） 6、无菌水涮洗数次，无菌纱布吸干水分 7、接种到培养基上： MS+(0.3一10mg/ L)BA 8、培养条件：光照 10-12h，光照度为 800一 1200Lx，温度21-25℃。