琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA片段

实验十四琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA片段
一、原理
DNA分子在碱性环境中(PH8.3缓冲液)带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。

不同的DNA片段由于其电荷、分子质量及构型的不同在电泳时泳动的速率就不同，从而可以分出不同的区带。

电泳后经gelview染色，在波长254nm紫外光照射下，单链DNA显红色荧光，双链DNA显绿色荧光。

也可染RNA。

二、试剂：
1.琼脂糖
2.TBE缓冲液：0.89M Tris—0.89M H3BO3(硼酸)—0.02M EDTA，pH8.3；称取10.880 g Tris，5.520 g硼酸，0.740g EDTA·Na2·2H2O，溶于无离子水中，定容至200ml，用时稀释10倍。

3.溴乙啶贮存液：5g/L，纯水配制，不需消毒。

贮棕色瓶于4℃保存。

4.DNA样品液：实验所提取的DNA或前面PCR产物
5.上样缓冲液：40%蔗糖，0.25%溴酚蓝；或Loading buffer
6.无离子水
三、仪器：
微波炉，封口膜(胶)，电泳仪及槽，加样器、头(20ul)，紫外分析仪或凝胶成像仪
四、操作
1.制备琼脂糖溶液：
称取0.18克琼脂糖溶于30ml TBE缓冲液中，沸水浴或微波炉煮沸至琼脂糖完全溶解。

将溶液冷却到60℃，加入gelview染料3ul(终浓度0.5μg/ml)。

2.制备凝胶板
用封口膜(胶)将凝胶槽缺口封住，置水平玻板或工作台面上，将梳子安放在槽的凹槽内，梳子底边须离开电泳架表面1mm左右。

将琼脂糖溶液倒入电泳支架上，胶厚约3mm，冷却30分钟。

待胶凝聚后小心地取出梳子，将凝胶放入装有TBE缓冲液的电泳槽中，TBE缓冲液要浸没过凝胶面2mm-3mm。

3.加样
将样品(样品液∶上样缓冲液=5∶1)小心加入胶板的加样孔内，加样量不宜
超过20ul(12 ul或18 ul)，避免样品过多而溢出，污染邻近样品。

加样时，加样器头悬于加样孔上部，然后缓慢地将样品推进孔内，让其集中沉于孔底部。

4.电泳
样品端连接负极，另一端连接正极，接通电源，开始电泳。

在样品进胶前可用略高电压(10V/cm)，以防止样品扩散，样品进胶后，应控制电压不高于5V/cm。

到溴酚蓝移出2/3距离时，停止电泳。

5.观察结果
小心地取出凝胶槽，将胶板推至预先浸湿并铺在紫外观察台上的玻璃纸上，在波长254紫外灯下进行观察。

DNA存在的位置呈现绿色荧光，肉眼可观察到清晰的绿色DNA条带。