项目十八 B淋巴细胞功能检测

项目十八B淋巴细胞功能检测
一、溶血空斑试验
(Plaque forming cell assay)
【实验原理】
将SRBC免疫动物，隔一定时间取其脾脏制成细胞悬液，当与SRBC混合孵育时，其中抗体形成细胞释放的抗体会与周围SRBC特异性结合，在补体作用下，使这些致敏的SRBC 溶解，从而在琼脂凝胶中的每个抗体形成细胞周围形成一个肉眼可见的溶血空斑。

测定与补体结合力强的IgM形成细胞采用直接方法；测定与补体结合力弱的IgG或IgA形成细胞采用间接法，即实验中需加入抗免疫动物Ig的抗体(二抗)，才能促进溶血空斑形成。

此处只介绍小鼠琼脂直接溶血空斑技术。

【试剂和器材】
1．小白鼠体重18~22 g。

2．补体豚鼠混合新鲜血清。

3．SRBC悬液用Gey液将SRBC洗3次，分别配成2.5×108个细胞/ml和5×108个细胞/ml浓度的红细胞悬液。

4．Gey液、琼脂糖。

5．注射器、剪刀、镊子、不锈钢网、小平皿、试管、吸管、显微镜、温箱、水浴箱。

【步骤和方法】
1．免疫小鼠取1ml 2.5×108个细胞/ml 浓度的SRBC悬液注入小鼠腹腔，或取0.2 ml SRBC悬液经小鼠尾静脉注入。

2．制备脾细胞悬液将免疫4天后的小鼠处死，取脾脏制备细胞悬液(制备方法见动物组织中免疫细胞收集)，用Gey液配成1×107个细胞/ml的细胞悬液(每只小鼠约加6~10ml Gey 液)。

3．制备底层琼脂将14g/L琼脂糖(用Gey液配制)溶化后取2~3ml倾注于水平的小平皿内，凝固后去盖反扣于37℃温箱中预温备用。

4．制备顶层琼脂将5g/L琼脂糖(用Gey液配制)溶化，置48℃水浴中平衡备用。

取脾细胞悬液和5×108个细胞/ml SRBC悬液各0.1ml，再加入未稀释补体0.05ml，混匀，置48℃水浴平衡片刻。

加入0.8ml已平衡好的琼脂糖，混匀后倒入底层琼脂上，旋转平皿使之均匀平铺，凝固后置37℃温育3h。

计数溶血空斑形成细胞(PFC)。

【结果判定】
1．将平皿置低倍显微镜下观察计数。

溶血空斑中心有淋巴细胞，周围为透明区。

2．全脾中PFC数计算：
每个平皿PFC数×10×脾细胞悬液体积(ml)
或以每百万脾细胞所含PFC数来表示。

【注意事项】
1．试验选用Gey液为洗涤液和培养液，优于Hanks液、Eagle液和Dullecco液，但工作液需现用现配。

2．最好选用近交系小鼠，且鼠龄和体重应基本一致。

3．制备脾细胞过程所用Gey液应预先4℃预冷，制好的细胞悬液应及时放4℃备用，以保持脾细胞活力。

4．制备顶层琼脂时，温度应控制在45～48℃之间，温度太高细胞会失活，过低会使琼脂凝固，细胞不能分散，无法倒入平皿。

各细胞成分要充分混匀，同时避免出现气泡；与琼
脂糖混匀、倾倒平皿时动作要敏捷，以免凝固。

【方法评价】
本方法为改良平皿法，稳定性较好，常用于体液免疫功能测定，是临床研究的可靠指标。

与经典平皿法比较具有简便、节省试剂、标本可长期保存、敏感性高等优点。

【临床意义】
可用于研究机体免疫机制；筛选药物并探讨其作用机理及对免疫功能的影响。

【附】Gey液配制
1液NaCl 35 g
KCl 1.85 g
Na2HPO4·12H2O 1.5 g
KH2PO40.119 g
葡萄糖 5 g
酚红50 mg
加蒸馏水至1000ml。

2液MgCl2·6H2O 0.42 g
MgSO4·7H2O 0.14 g
CaCl20.34 g
加蒸馏水至1000ml。

3液NaHCO3 2.25 g
加蒸馏水至1000ml。

以上均高压灭菌(112℃15min)后备用。

用时取1液20ml，2液5ml、3液5ml，蒸馏水70ml，混匀即为工作液。

【思考题】
溶血空斑试验有哪些方法类型？检测人不同Ig形成细胞的溶血空斑试验常用何种方法？它们的原理如何？
二、溶血素测定法
(Hemolysin quantitative determination)
【实验原理】
SRBC免疫的动物血清中存在有溶血素，在补体存在下能使溶血素致敏的SRBC发生溶血反应，用分光光度计检测溶血释放的血红蛋白，即可确定免疫动物血清中溶血素的含量，从而可评价机体体液免疫功能状态。

【试剂和器材】
1．小白鼠18~22g。

2．SRBC悬液将SRBC用生理盐水洗3次，按压积用生理盐水配成10％浓度(约2×109/ml)，用于免疫小鼠。

另按压积用工作BBD配成4％的浓度，用于测定溶血素。

3．补体豚鼠混合新鲜血清，用时用工作BBD 1:30稀释。

4．贮存BBD(5×)和工作BBD 配制见补体结合试验。

5．氰化高铁血红蛋白试剂(都氏试剂)
NaHCO3 1.0 g
KCN 0.05 g
K3Fe(CN)60.2 g
吐温80 0.5 ml
加蒸馏水至1000ml。

6．注射器、眼科镊子、试管、离心管、吸管、水浴箱、分光光度计。

【步骤和方法】
1．溶血素制备
(1)取0.2ml 10％SRBC 悬液给小鼠腹腔注射，每天1次，连续注射3天。

(2)未次注射后6~8天时摘除小鼠眼球取血，分离血清。

(3)将血清用工作BBD 1:10稀释，置56℃作用30min 后备用。

2．溶血素测定
(1)取1:10稀释血清及4％SRBC 悬液各0.2ml ，混匀后置37℃水浴致敏15min 。

(2)加入工作BBD 0.8ml ，1:30稀释补体0.8ml ，混匀，置37℃水浴1h(或放4℃过夜)，中间取出混匀1次。

(3)到时取出离心2000r/min 10min 。

取上清液1ml ，加入氰化高铁血红蛋白试剂3ml ，混匀，置室温10min 后测A 540nm 吸光度。

3．50％溶血(CH 50)管制备。

(1)取0.1ml 4％SRBC 悬液，加入1.5ml 蒸馏水，完全溶血后再加入贮存BBD 0.4ml ，混匀。

(2)取出1ml ，加入氰化高铁血红蛋白试剂3ml ，混匀，置室温10min 后测吸光度， 用氰化高铁血红蛋白试剂做空白对照。

测值为1个CH 50的吸光度。

【结果判定】
1．CH 50单位计算：
血清稀释倍数％溶血管的吸光度
溶血素测定管的吸光度＝
50CH 50⨯ 2．以CH 50单位数表示溶血素含量。

【注意事项】
1．溶血素测定所用玻璃器材必需十分洁净。

2．补体最好用混合的新鲜豚鼠血清，用前临时稀释。

3．溶血素测定管离心后发现完全溶血，或溶血甚微，应将测试血清稀释度调整后再重新测定。

4．SRBC 不能溶血，应作SRBC-补体对照：取4％SRBC 悬液0.2ml ，加入工作BBD 1.0ml ，1:30稀释补体0.8ml ；按实验温育、离心后应无溶血现象。

空白对照：取该上清液1.0ml ，加入氰化高铁血红蛋白试剂3.0ml ，置室温10min ，应以此作为溶血素比色测定的空白对照管。

5．收获免疫血清时应避免溶血，若溶血严重，测定结果应予校正：取1:10稀释血清0.1ml ，加入工作BBD 0.5ml ，1:30稀释补体0.4ml ，氰化高铁血红蛋白试剂3ml ，混匀，置室温10min 后以氰化高铁血红蛋白试剂为空白对照测吸光度，并以下式校正结果。

血清稀释倍数％溶血管的吸光度
－血清对照管的吸光度溶血素测定管的吸光度＝ 50CH 50⨯ 6．溶血素测定时4℃过夜(17～18h)反应结果会更好。

【方法评价】
此法简便、重复性好、结果准确、客观。

【临床意义】
常用于药物筛选及免疫药理作用的研究。

【思考题】
该试验与补体结合试验中的溶血素测定、血清总补体活性测定在原理、方法和应用上有何异同？
三、酶联免疫斑点试验
(Enzyme-linked immunospot assay)
【实验原理】
酶联免疫斑点(ELISPOT)试验是一种直接检测细胞分泌产物的方法，以此可评价被测细胞的功能、特性。

其原理与ELISA类似，此处以测定B细胞分泌抗体活性介绍其检测原理。

该方法是用已知抗原包被组织培养板或平皿，再加入B细胞培养3～4h，B细胞沉积到底部，分泌的抗体可与邻近包被抗原结合，就像一个细胞的足印。

因此在加入酶标抗相应同种型Ig抗体(二抗)并经酶促反应后，底物形成不溶性颜色斑点，据此可检测抗体的含量；并可在低倍光学显微镜下通过计数斑点即可知抗体形成细胞数。

【试剂和器材】
1．抗原包被缓冲液PBS。

2．封闭液含5%的新生小牛血清(NCS)或含1%的牛血清白蛋白(BSA)的PBS。

3．PBS-T 加入0.005% Tween-20及0.1% BSA的PBS。

4．RPMI-1640培养液含5%NCS。

4．HRP或碱性磷酸酶标记的二抗。

6．1.2％琼脂糖用双蒸水配制，加热溶化。

7．1％琼脂糖用PBS-T溶液配制。

用前加热溶化，置46℃水浴平衡。

8．凝胶底物
(1)HRP-底物：将50mg 1,4-对苯二胺(1,4-p-phenylenediamine，PPD)溶于2ml甲醇中，在应用前加入50μl 30% H2O2和46℃预温的1％琼脂糖，混匀后立即应用。

PPD与HRP反应性成棕褐色；
(2)碱性磷酸酶底物：5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(5-bromo-4-chloro-3-indolylpho- sphate，BCIP)与等体积的1.2％琼脂糖混合。

BCIP与碱性磷酸酶反应形成蓝色斑点。

9．可溶性底物
(1)HRP底物：25mg 3-氨基-9-乙基咔巴唑(3-amino-9-ethycarbazole，AEC)溶于2ml二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)中，加入95ml 0.1mol/L醋酸钠缓冲液(pH5.0)。

经0.45μm 滤膜过滤，除去沉淀，获无色溶液，加入40μl 30% H2O2。

AEC与HRP反应形成红色斑点；
(2)碱性磷酸酶底物：将15mg BCIP和30mg NBT分别溶于1ml DMP中。

BCIP和NBT 溶液与100ml 0.1mol/L NaHCO3-1.0mol/L MgCl2(pH9.8)混合。

BCIP或BCIP-NBT与碱性磷酸酶反应形成蓝色斑点。

10．96孔板聚苯乙烯培养板(亦可用6孔、24孔、48孔板)，或聚苯乙烯平皿(直径为40~50mm)，或带有硝酸纤维膜的96孔板；微量移液器、CO2孵育箱、光学显微镜等。

【步骤和方法】
1．包被用PBS将抗原作适当稀释后包被聚苯乙烯培养板或聚苯乙烯平皿，4℃过夜或37℃孵育2h。

用PBS洗涤平皿或培养板3次，每次2~3min。

包被好的平皿或培养板置4℃可保存数周。

2．封闭加入封闭液，每孔200μl，平皿为2ml，置37℃ 30min。

弃去封闭液，用PBS 洗涤3~5次。

3．加样反应加入用RPMI-1640稀释的抗体分泌细胞(1×106/ml)，每孔100~200μl，平皿为2ml。

置37℃ 5%CO2的温箱3~4h或过夜。

用PBS-T洗涤去除细胞，方法同上。

注意防止培养液干枯。

4．结果测定：每孔加入酶标二抗50~100μl(2ml/平皿)，置室温(25℃) 2~3h或4℃过夜。

用PBS洗涤3次。

聚苯乙烯板可用凝胶底物单染色分析，硝酸纤维膜可用可溶性底物作单染色或双染色分析。

(1)凝胶底物法加凝胶底物，每孔50~100μl，平皿为2ml，快速振摇微孔板或平皿使凝胶平铺，置室温使凝胶凝固(需2~5min)，再置5~10min后可见蓝色或棕褐色斑点。

(2)可溶性底物法加可溶性底物50μl至96孔板(盛有硝酸纤维膜)。

首先加入碱性磷酸酶底物，置室温5~10min，显蓝色斑点，用PBS漂洗；然后加入HRP底物，再置1~10min 后显示红色斑点，用水洗硝酸纤维膜。

【结果判定】
可在低倍镜下计数斑点形成细胞(spot-foming cells，SFC)。

阴性和空白对照应无斑点出现。

有斑点形成为阳性，无斑点出现为阴性。

【注意事项】
1．实验条件应统一；并做好阴性、阳性、空白及参考品对照。

2．加样要准确、不要有气泡，洗涤应彻底。

【方法评价】
本实验方法稳定性好、特异性高，且抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞，结果易于观察。

【临床意义】
常用于检测分泌细胞活性，如抗体形成细胞、杂交瘤细胞、细胞因子分泌细胞等；也可用于研究细胞对抗原、刺激剂、抑制剂的应答性，或药物筛选、药理作用研究。

【思考题】
ELISPOT试验和ELISA比较有何不同？。