RNA的分离纯化技术

8/15/2016
异硫氰酸胍—酚法提取植物组织总RNA
1） 取2g左右植物组织放入研钵中，反复加入液氮充分研磨至粉末 状。加4－5mL异硫氰酸胍溶液。转移到小离心管中，每管0.5mL。 2） 置于冰上，顺序加入：50μl 2mol/L NaAc , 混匀，0.5mL水饱和酚， 170μl CI，混匀。置冰上15min。 3） 各管平衡后，4℃,12 000g离心20-30min。转移上清到另一管中， 加入等体积的异丙醇，混匀，－20℃沉淀30min-1hr或－80℃沉 淀10min。4℃,12 000g离心20min回收RNA。 4） 用70％乙醇洗一次，4℃，12 000g离心5min。吸去乙醇，空气中 吹干RNA沉淀。用150μl 异硫氰酸胍溶液，65℃吹打RNA沉淀溶解。
8/15/2016
RNA的分类
• 信使RNA（messengerRNA，mRNA）mRNA是合 成蛋白质的模板，按照细胞核中的DNA所转录； • 转移RNA（transferRNA，tRNA）tRNA是mRNA上 碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸 的转运者； • 核糖体RNA（ribosomalRNA，rRNA）rRNA是组 成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。 • 微小RNA（microRNA，miRNA）内源性的具有调 控功能的非编码RNA
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RNABaidu Nhomakorabea备的条件与环境
• 为防止RNase对RNA 的水解，一要全 力避免细胞外RNase的污染并抑制其 活性，二要尽快地抑制细胞内RNase 的活性并极力地去除RNase。对广泛 存在的细胞外RNase，应在RNA制备 的全过程中保持高度的警惕，并采 取严格的措施以避免其污染和抑制 其活性。
RNA的分离纯化技术
第四组
【实验目的】
1.了解RNA分子的种类、分布及其 结构特点 2.掌握总RNA提取的基本原理和实 验方法 3.掌握总RNA浓度检测的方法 4.掌握总RNA完整性检测的方法
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主要内容
• • • • RNA的概述 分离RNA的意义 总RNA的分离与纯化 结果分析
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2、TRIzol法
• TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总 RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持 RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成 水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收 集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇 沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的 DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙 醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加 入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样 品间标准化RNA的产量十分有用。
异硫氰酸胍—酚法提取RNA的原理如下： GIT与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活 性；GIT与 十二烷基肌氨酸钠 （Sarcosyl） 作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条 件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性 被离心下来，RNA则溶于上清中。该法所提 RNA纯度高完整性好较适合纯化mRNA，逆 转录及构建cDNA文库。
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分离RNA的意义
进行完整的RNA的提取和纯化是进行 RNA方面研究工作的基本前提，如 Northern杂交、mRNA分离、RT-PCR、 基因表达水平检测、cDNA合成及体外 转录和翻译等实验均需要首先得到高 质量的RNA样品。
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总RNA的分离
1、异硫氰酸胍—酚法
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4、密度梯度离心
• 用胍盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度 梯度离心。蛋白质密度<1.33g/cm3在最 上层。DNA密度在1.71g/cm3左右，位 于中间。RNA密度>1.89g/cm3,沉在底部。 用此方法可制备较大量纯度的天然RNA
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结果分析
• 分光光度法测260nm和280nm下OD 值 • Northern-Bolt杂交 • 1）甲醛-琼脂糖凝胶电泳 • 2）聚丙烯酰胺凝胶电泳 • RT-PCR检测
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RNA（Ribonucleic Acid)的概述
存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。 由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类 核酸，因含核糖而得名，简称RNA。RNA普遍存在于动物、 植物、微生物及某些病毒和噬菌体内。RNA和蛋白质生物 合成有密切的关系。在RNA病毒和噬菌体内，RNA是遗传 信息的载体。 RNA一般是单链线形分子；也有双链的如呼肠孤病毒RNA； 环状单链的如类病毒RNA
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试验流程图
细胞
氯仿 水相
细胞选择
纯化 RNA 基因组DNA
离心
贴壁细胞 悬浮细胞
加入裂解液 (TRNzol-A+)
有机相
pH5.7
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3、苯酚法
• 细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起， 以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要 把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含 有十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱 和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层 水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚 变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相 界面处形成凝胶层。 • 苯酚法提取酵母RNA
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5） 加等体积异丙醇－20℃沉淀30min-1hr或－80℃沉 淀10min。4℃,12 000g离心20min回收RNA。 6） 用70％乙醇洗两次后，吹干溶于适量的DEPC－H2O 中。部分分装后进行纯度及完整性的检测。其余加 2.5倍体积乙醇沉淀于－80℃冰箱中存放。 7） 紫外分光光度分析纯度和含量，甲醛变性琼脂糖 凝胶电泳分析完整性。