包含体纯化步骤

同样采用Ni-NTA His结合树脂亲和纯化重组目的蛋白，1、200mL菌液离心收集大量诱导的菌体，并用1×PBS缓冲液洗涤两次。

2、将保存的菌体沉淀用总体积为20mL的1×Bind Buffer (300mM NaCl，50Mm NaH2PO4; 10mM imidazote,pH8.0)重悬，在冰浴中超声波破菌至溶液呈白色澄清。

3、4℃ 12,000 rpm离心30分钟，然后用20mL的包涵体洗涤Buffer (50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.5% Triton x-100，pH8.0)洗涤沉淀两次。

4、加20mL的包涵体溶解Buffer（50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，8mol/L Urea，pH8.0）充分溶解，（旋涡溶解，最好溶解时间长一点，1h左右，也可以用冰盒装放摇床上1h ），4℃10,000 r/min离心30min，收集上清。

2.2.2 亲和层析纯化表达的蛋白pQE40和pET-32a(+)载体表达的蛋白C﹑N端均融合了6个组氨酸的tag，可用金属螯和层析纯化，也可用抗6个组氨酸的单克隆抗体检测表达蛋白的正确性。

根据表达蛋白的溶解情况分两种方法对蛋白进行纯化。

2.2.3 天然条件下纯化可溶形式的目的蛋白目的蛋白的表达和收获：用3.2.2.1所述的方法大量表达目的蛋白。

4℃下10,000 rpm离心5 min弃上清，向细菌沉淀中加入4℃用冰预冷的1×Ni-NTA结合缓冲液(50mmol/L NaH2PO4, 300 mmol/L NaCl, 10 mmol/L咪唑, pH8.0)，每100 mL培养液加入4mL结合缓冲液，重悬菌体。

－40℃冷冻，室温溶解，反复冻融三次。

再在冰水浴中超声10 min(超声10 s, 间隔10 s)，破碎菌体。

4℃下10,000 rpm离心20 min，保留上清液。

Ni-NTA His·Bind resin的准备：将树脂充分重悬，取4 mL悬液(每2mL树脂悬液可吸附5-10 mg蛋白)加到10 mL沉降柱(gravity column)中，树脂自然沉降后，加1×Ni-NTA结合缓冲液洗两次。

目的蛋白的吸附和洗脱：将菌体上清液加到处理好的树脂中，4℃轻柔混匀，结合2h。

树脂自然沉降后，打开沉降柱下端的管帽，让缓冲液缓慢流出。

液体流完后，加1×N i-NTA漂洗缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4, 300 mmol/L NaCl, 20 mmol/L咪唑，pH8.0)5mL，轻柔混匀，漂洗两遍。

结合、漂洗过程中收集上清100 μL，以备电泳分析。

然后加1×Ni-NTA洗脱缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4, 300 mmol/L NaCl, pH8.0，咪唑浓度分别为100、200、300、500、750和1000 mmol/L)，按照咪唑浓度由低向高洗脱并收集目的蛋白，每0.5 mL收集一管。

SDS-PAGE电泳分析各管收集液，合并有目的蛋白的收集液。

2.2.4 变性条件下纯化包涵体形式的目的蛋白1、包涵体的纯化：收集的菌体按每100 mL培养基所得菌体加入20 mL1×变性结合缓冲液(0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-Cl, pH8.0, 不含尿素) 冰浴30 min，按前述方法进行超声，重悬菌体。

5,000×g离心15 min，包涵体和细胞碎片位于沉淀中。

移去上清，将沉淀重悬于20 mL 1×变性结合缓冲液，重复上述步骤。

移去上清，按每100 mL培养基加5 mL缓冲液的比例，加入含8 mol/L尿素的1×变性结合缓冲液重悬沉淀。

冰浴孵育1 h，彻底溶解包涵体。

16,000×g离心30 min去除不溶成分。

Ni-NTA His·Bind resin的准备、目的蛋白的吸附和洗脱方法同前。

1×变性漂洗缓冲液(8 mol尿素，0.1 mol/L NaH2PO4, 0.01 mol/L Tris-Cl, pH6.3)漂洗两遍后，加入pH5.9的1×变性洗脱液(8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH2PO4, 0.01 mol/L Tris-Cl)0.5mL洗两遍，再用pH4.5的1×变性洗脱液洗脱并收集目的蛋白，每0.5 mL收集一管。

结合、漂洗过程中收集上清100 μL，以备电泳分析。

SDS-PAGE电泳分析各管收集液，合并有目的蛋白的收集液。

2.2.5 变性条件下目的蛋白的切胶回收将变性条件下纯化的目的蛋白的收集液进行SDS-PAGE电泳，切胶回收。

－20℃保存胶条。

所有胶条放于研钵中，加入适量0.7%的生理盐水，研磨成很细的颗粒状，用1mL的针头可以吸入。

电泳检测，估计蛋白浓度。

2.2.6 兔和小鼠多克隆抗体的制备用作免疫的动物为日本大耳兔，体重2 kg左右，由武汉病毒所动物饲养中心提供，按以下免疫程序来免疫。

500ug纯化的pQE-40-MT-2和pET32a(+)-MT-2重组融合蛋白多点注射兔腘淋巴结和脚掌，每点注射0.2 mL。

第一次注射2周后加强免疫2次，各次剂量为上次剂量的二分之一，每次间隔两周。

第二次、第三次蛋白溶液背部皮下、脚掌多点注射。

在第三次免疫2周后，自颈动脉抽取血液。

将兔血37℃放置1h后再在4℃放置过夜，1500×g离心30 min，吸取上层的多抗血清，分装后于－70℃冻存。

同时还用pET32a(+)-MT-2重组融合蛋白免疫了5只4周龄的昆明雄性小鼠，每只每周一次皮下注射40ug，6周后眼球取血，小鼠抗体血清的处理方法和兔抗体血清的处理方法相同。

2.3免疫印迹检测鳜MT-2在各组织内的分布实验用鳜，体重为400 g左右，免疫前驯养一周。

用于免疫印迹的器官包括鳃、肝脏、心脏、肾脏、肌肉、头肾、脑、脾脏和肠道。

将所取的组织分别在MEB缓冲液（100 mmol/L β-磷酸甘油，20 mmol/L HEPES，20 mmol/L EGTA，15 mmol/L MgCl2，pH 7.3，临用前加入1 mmol/L DTT，2 mmol/L PMSF，2.5 µg/mL leupetin，2.5 µg/mL aprotinin）中匀浆，-40 ℃冻存。

临用前将组织匀浆液14,000 rpm 4 ℃离心10min取上清，用于免疫印迹检测。

将预染Marker、纯化蛋白样品和含5ug蛋白的组织提取液经16.5% SDS-PAGE胶（Bio-Rad Mini-Protein电泳系统）分离，电泳条件：10mA 1 h，20mA 至电泳结束。

将电泳后胶板在转膜缓冲液（25 mmol/L Tris pH8.3，192 mmol/L甘氨酸，30%甲醇）中平衡20 min。

按照伯乐半干电泳转移系统（Trans-Blot SD semi-dry electrophoretic transfer cell）操作指南装配转膜系统，室温下以15V（120-180mA）转膜30min，将蛋白转移至甲醇浸润过的0.22 um的聚偏氟乙烯膜（PVDF）膜上。

用TBS溶液（10 mmol/L Tris-Cl pH 7.5，150 mmol/L NaCl）轻轻漂洗膜10 min，再用2.5%的戊二醛固定1 h，以防止蛋白在随后的洗膜和孵育中脱落。

然后用TBS洗膜10min×3，再用5%脱脂奶粉（溶于TBS中，含 0.05% Tween 20）室温封闭2 h后，用5%脱脂奶粉（溶于TBS中，含 0.05% Tween 20）按1：500稀释一抗，一抗采用两种重组蛋白免疫产生的兔抗MT-2抗体，4 ℃封闭过夜，再用TBST洗膜10min×3。

以1：1000的稀释比例加入碱性磷酸酶标记的山羊抗兔二抗室温孵育2h。

用TBST溶液洗膜10min×3，每次10 min，再用O洗膜10min。

最后用NBT/BCIP浓缩显色试剂盒配置的底物溶液显色1-5min，滤dd H2膜置于dd HO溶液中终止反应。

22.4免疫组织化学检测鳜MT-2的在细胞内的分布实验用鳜，体重为400 g左右，免疫前驯养一周。

2.4.1 石蜡组织包埋与切片1、取材与固定：迅速取肝脏和肾脏组织剪切成1.0×1.0×0.2厘米的小长条放入4%的多聚甲醛固定液中直接固定24h，4℃冰箱保存。

2、冲洗：固定以后，须在自来水下流水冲洗10分钟。

3、脱水：材料要切成薄片必须以石蜡包埋。

为使石蜡能透入材料内部，必须除去其内部的水分。

这种除去材料内部水分的操作过程，称为脱水。

脱水通常用酒精，必须渐进，不能急骤，否则会引起材料不均匀的收缩。

脱水时用70%、80%、90%、95%、100%各级酒精。

每级10-30分钟。

4、透明：此时材料内部浸满酒精，石蜡仍难渗入，必须用既能与酒精混合又能溶解石蜡的媒浸剂浸渍，本试验采用二甲苯。

每次20-30分钟，进行2次，时间不能长，久浸会使材料变脆，造成切片困难。

5、浸蜡：指石蜡浸入材料内部的操作过程。

将溶解的石蜡倒入浸蜡杯内，将透明好的组织放入，中间换二次蜡，每次20-30分钟，将温箱温度调到与石蜡熔点相同，如温度过高，包埋物变得硬脆，坚实不易切片。

6、包埋：将材料包埋在石蜡中以便于切片。

将熔化的石蜡倒入包埋器中，用热镊子把材料迅速移入包埋器中，并摆好位置，观察面向下摆放。

之后，将包埋器放置于水面，缓慢浸入水中。

等石蜡完全凝结以后，从水中取出，并注明包埋物的编号和日期等。

7、切片：将材料连同周围的石蜡用解剖刀切修成梯形，四周距离材料1-2毫米，前端离材料宜近。

用少许石蜡将蜡块固定在木块上。

将有蜡块的木块固定在切片机上，并调节切片刀的固定器或材料固定器，使切片刀与蜡块靠近。

调节切片厚度为4微米，进行切片，并将切片用毛笔移在铺有黑纸的盘中。

每节蜡带不超过盖玻片的长度。

8、展片与贴片：将切好的蜡带，放入温度为40-50℃的水浴锅内，根据蜡溶与水面的张力，展平组织，取一小滴蛋白甘油涂在载玻片上，用小拇指外侧把它涂成薄层，涂抹面积要超过蜡片所用的面积，涂抹得越薄越均匀越好。

用解剖针把蜡片段拖于载玻片上, 玻片45-50℃烘干。

9、脱腊：把玻片放入盛有二甲苯的染缸中，熔去石蜡（3分钟），再经第二缸（3分钟）。

10、水化：经70%--80%--90%--95%各级酒精入水。

2.4.2 柠檬酸缓冲液煮沸抗原修复1、石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（pH=7.4）冲洗3次，每次3分钟（3×3’）。