应用5种荧光素同时标记24条人染色体-显微镜
-细胞凋亡的检测方法-
细胞凋亡的检测方法细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。
细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。
一、细胞凋亡的形态学检测二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中（图3）。
Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。
将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。
因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
方法1 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min 后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。
2 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。
3 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。
结果（图4、图5）注意事项1. 整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。
2. 操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。
核型与带型分析
35
显带染色体：用特殊的染色方法使染色体沿其长轴 显示出明暗交替或染色深浅不同的横纹——带。
3 2
p
1
1 2
q3
4
6 5 4321
21
31 2
1 2
12 3 5 4 12 13 24
1p31
36
4 光谱核型分析(Spectral karyotyping, SKY)
12
等臂染色体
46，X, i (Xq) 46, X, i (X) (qter→ cen→ qter)
女性核型，有一条正常的X染色体和一 条X染色体长臂形成的等臂染色体（在细胞 分裂期间，染色体的着丝粒区在水平方向上 发生断裂，使染色体的两个臂分开，从而形 成两条等臂染色体 ）。
13
pp
着丝点横裂
17
2 染色体染色技术
2.1 普通染色
普通染料直接染色在染色体标本上。由于整条 染色体都均匀着色，在显微镜下只能看到染色体的 外形，看不清其内部结构，只能根据染色体的相对 长度和着丝粒位置等外形体征来识别染色体。
这种染色方法只能正确地识别出第1、2、3、16、 17、18号及Y染色体，不能正确地识别出其他染色体 及染色体上的不同片段。对各条染色体的微小结构 变化，如缺失、易位等也不能检出。所以，对许多 染色体异常，特别是染色体结构变化的研究，受到 很大的限制。
3
2 染色体核型分析的意义：
◆不同物种的染色体都有各自特定的形态结构 （包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体 大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳定的。 因此，染色体核型分析是生物种质资源遗传性研 究的重要内容，在动植物分类和生物进化研究中 也得到广泛的应用；
实验二 荧光显微镜的基本使用方法
实验二荧光显微镜的基本使用方法荧光显微术是在细胞或组织水平上对生物大分子进行定位和动态观察的最常用的实验方法。
它广泛地应用于核酸、蛋白质、细胞器、细胞骨架、激素、离子等多种细胞结构或物质的定位和功能分析。
很多生命科学的研究工作都需要频繁地使用荧光显微镜。
比如，采用荧光探针的原位分子杂交用于确定某个基因在组织中的表达或在染色体上的定位（Polak et al. 1999; Andreeff and Wiley-Liss 1999），绿色荧光蛋白基因（gfp）用于了解某个基因产物在组织和细胞中的特异性分布（Chalfie et al. 1994; Haseloff and Amos 1995）等等。
然而，在我们接触的一些低年级研究生中，一些同学并没有很好地掌握荧光显微镜的基本原理和使用方法。
他们拍摄的荧光显微照片往往不能满足国际性高水平学术刊物的要求。
这种状况既不利于科研效率的提高，也限制了研究成果的发表。
因此，了解荧光显微术中的一些基本原理和注意事项、掌握荧光显微镜的基本使用方法是非常重要和有意义的。
本实验讲解荧光显微镜的基本结构和使用方法。
要求学生通过细胞核、细胞质DNA的荧光显微显示以及转绿色荧光蛋白基因拟南芥根、茎、叶细胞的观察掌握荧光显微术的基本原理和注意事项，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。
实验目的：1. 了解荧光显微镜的基本结构；2. 掌握荧光显微术的基本原理和注意事项；3. 掌握核酸的荧光显示技术，直观地认识细胞质DNA的存在；4. 了解绿色荧光蛋白（GFP）在蛋白质定位等研究中的应用，直观地认识GFP的荧光显微效果。
实验内容：1.荧光显微镜的基本原理和结构荧光显微镜的放大成像原理与普通透射光显微镜完全相同。
不同的是荧光显微镜需要另外的激发光光源和光路。
因此，只要加上激发光光源和光路，再换上允许激发光通过的目镜（荧光显微镜的目镜在透镜玻璃的材质上与普通透射光显微镜不同），一台普通的透射光显微镜就可以被升级成一台荧光显微镜了。
免疫荧光抗体技术
免疫荧光抗体技术摘要：免疫荧光抗体技术是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。
其中，最常用的是以荧光素标记抗体或抗抗体，用于检测相应的抗原或抗体。
本文主要对他们的原理、特点的介绍，并对其前景进行了探讨。
关键字：免疫荧光抗体技术研究进展Abstact Immunofluorescence antibody technology refers to an antigen or antibody labeled with fluorescein, then observed by fluorescence microscopy and fluorescence analysis in tracing the corresponding antigen or antibody . The most commonly used is labeled with fluorescein antibody or antibody, used to detect the corresponding antigen or antibody 。
This paper mainly introduces the principle, characteristics of them, and their prospects were discussed . Key words immuno ，Immunofluorescence， research progress1.免疫荧光抗体标记技术荧光抗体技术示意图免疫荧光标记技术（immunofluorescence technique）是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位，检测出抗原或抗体。
免疫荧光标记技术始创于20世纪40年[1]代初，1942年Coons等首次报道用异氰酸荧光素标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。
Molecular hybridization 分子杂交
仪器
Dot blot-DNA chip (芯片)
• Development and combination of multiple fields The specific array (阵列)of related genes. e.g.,
Oncogenes (癌基因) Tumor suppressor genes (抑癌基因) thousands,10 thousands of genes
原理 -- 通过杂交检测信息
一组寡核苷酸探针 TACGTTAG ATACGTTA 由杂交位置确定的一组 核酸探针序列 ATACGTTA TACGTTAG ACGTTAGA CGTTAGAT GTTAGATC
杂交探针组
ACGTTAGA
—TATGCAATCTAG
CGTTAGAT GTTAGATC
Aቤተ መጻሕፍቲ ባይዱACGTTAGATC
重组的互补序列
TATGCAATCTAG
靶序列
荧光标记的样品
共聚焦显微镜
基因芯片 获取荧光图象
杂交
探针设计 杂交结果分析
（２）基因芯片制备
• 基因芯片的制备主要有两种基本方法: • 一是在片合成法，
– 在片合成法是基于组合化学的合成原理,它通过一组 定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位 点和次序。在片合成法制备DNA芯片的关键是高空 间分辨率的模板定位技术和固相合成化学技术的精 巧结合。
• How a DNA probe bind with an unkown sequence
Base pairing indicates the gene of interest
3. Ways of Molecular Hybridization
核型与带型分析
人染色体光谱核型分析
乳腺癌细胞染色体复杂的畸变
5.分子细胞遗传学与核型分析 5.1 原位杂交（In situ hybridisation）
标记的核酸探针变性后与已变性的 靶核酸在退火温度下复性，在不改变被 分析对象，即维持其原位的前提下对靶 核酸进行分析。
5.2 荧光原位杂交 ( Fluorescent in situ hybridisation ，FISH) 核酸探针用荧光染料标记，荧光信号 通过显微镜观察。 荧光原位杂交，据标记物不同可分为： • 间接法：用生物素或地高辛标记探针， 通过与荧光染料结合的抗生物素或抗 地高辛抗体将信号放大而进行检测。 • 直接法：直接用荧光素标记，如Vysis 公司的FISH探针。
h）高分辨显带（high-resolution banding）：
分裂中期一套单倍染色体一般显示320条带。70年代后 期，采用细胞同步化方法和改进的显带技术，获得细 胞分裂前中期、晚前期或早前期的分裂相，可以得到 带纹更多的染色体，能显示550-850条带，甚至2000条
带以上。高分辨显带技术，对染色体的分析达到了亚
pp qq
着丝点横裂
pp p
q
p qq q
ห้องสมุดไป่ตู้
等臂染色体
5 人类染色体的核型分析 染色体分组 A,B,C,D,E,F,G七组 A:1～3；最大，中(1,3号)，亚中(2号)，1号常 见副缢痕，可鉴别 B：4～5；次大，亚中，难鉴别 C：6～12,X，中等，亚中，9号常见副缢痕，难 鉴别 E：17～18；小，中(16号)，亚中(17,18号)， 16号可鉴别,17、18难鉴别 F：19～20，次小，中，难鉴别 G：21～22,Y，最小，近端，21,22号有随体,Y 无，难鉴别
DNA重排的检测方法
马欣荣 高方远 康海歧
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1
一、形态学观察 二、细胞遗传学
如：染色体核型分析、染色体显带等 三、分子细胞遗传学
如：荧光原位杂交 四、分子生物学
如： Southern杂交，PCR及相关技术等
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2
一、形态学观察
例子：
• 上个世纪40年代科学家B．McClintock 观察研究玉米籽粒和叶子时发现有颜色 变化。 这种颜色变化是由遗传结构的基 本改变引起的，从而导致转座子的发现。
10、11号染色体易发生 断裂的基因(MLL)位点
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16
小麦－簇毛麦F1 代染色体间易位
染色体涂染显示人染色体组
荧光标记探针
• 不对环境构成污染 • 灵敏度能得到保障 • 可进行多色观察分析，可同时使用多个
探针，缩短因单个探针分开使用导致的 周期过长和技术障碍。
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19
4. 比较基因组杂交
Comparative Genomic Hybridization (CGH)
原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂 交技术而发展起来的技术，主要用于 肿瘤的检测及其基因组分析
是由Kallioniemi等在1992年首先提出的，是检 测整个肿瘤基因组DNA增加或减少的强有力的 工具
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20
• 肿瘤DNA和对照DNA 在染色体上的相对结 合量取决于两种DNA 标本中相应杂交序列 的多少
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4
光谱核型分析原理(Spectral karyotyping, SKY)
1996 年 Schroch等首次描述了SKY技术。 应用5种荧光素同时标记24条人染色体，制成染 色体涂染探针，应用Fourier光谱仪，CC成像 和荧光显微镜进行检测分析，经计算成像处理， 46条染色体形成具有不同颜色的核型影像,可用 以分析各种染色体异常。
核型与带型分析
括号内为结构异常的染色体
重排中用于分开染色体 嵌合体中用于分开不同的细胞系 易位 末端 从．．．．到
4.2 核型描述方法 4.2.1 染色体数目异常的核型描述
首先是书写染色体总数，加一个逗号，接 着写出性染色体的组成，然后写出染色体的异 常。“＋”和“－”号当其放在相应的符号之 前，表示增加或丢失了整条染色体；当其放在 相应符号之后，则表示染色体长度的增加或减 少。 例如：47，XX，＋21为一个女性先天愚型 的核型，有一条额外的21号染色体； 46，XY，5p-表示一个5号染色体短臂长度 减少的男性核型。
人染色体组型模式图
是鉴别染色体进行配对分类的基木技术，是 在对染色体进行测量计算的基础上, 进行分组、 排队、配对, 并进行形态分析的过程。
2 染色体核型分析的意义： ◆不同物种的染色体都有各自特定的形态结构 （包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体
大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳定的。
因此，染色体核型分析是生物种质资源遗传性研 究的重要内容，在动植物分类和生物进化研究中 也得到广泛的应用；
带（subband）的水平。使我们能够确认那些更为
微小的染色体结构改变了。
i）SCE（sister chromatid exchange）显示方法：
5-BrdU→T
5-BrdU
优缺点：染色体显带技术能够识别不同 的染色体，从染色体水平上了解许多疾病的 遗传变异，但是受到分辨率（超过3Mb的DNA 才会识别）的影响，检测出像染色体微缺失 的综合症的微小染色体变异可能性较小；只 能分析中期分裂相细胞；而且，由于许多肿 瘤是实体，染色体重组非常复杂，无法通过 显带技术得到全部的核型。
1996 年 Schroch等首次描述了SKY技术。应用5 种荧光素同时标记24条人染色体，制成染色体涂染探 针，应用Fourier光谱仪，CC成像和荧光显微镜进行检 测分析，经计算成像处理，46条染色体形成具有不同 颜色的核型影像,可用以分析各种染色体异常。
5免疫荧光技术(修改后)-2解析
生物素 生物素
亲和素
生物素 生物素
亲和素— 生物素在ELISA中使用：
三.ELISA结果的判定
（一）肉眼判定
与阳性、阴性对照颜色比较：
结果判定
1.若待检孔显色浅于阴性对照则判定为阴性；
2.若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判 定为阳性；
3.若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照 孔之间则判定为弱阳性。
（二）片子的制作：
1.常做切片、涂片、印片，要求薄、 均匀，并与玻片充分固定。固定后不 能被洗脱。
2.注意保持抗原完整性
3.不同材料固定方法不同（无水已醇、 丙醇、聚甲醛等）
（三）荧光抗体染色法
1.直接法
待测标本固定（Ag？）
洗涤，
AgAb
+ Ab
• 快、直接、干扰因素少
• 用于检测抗原
• 每检测一种抗原需标记相应的荧光抗 体,较麻烦
固相载体 聚苯乙烯
Ag 或 Ab 吸 附 到 固 相 载体上的过程,称为 包被
实验中所需酶标抗体的制备方法 同荧光抗体制备：
纯化后的抗体+酶 透析去除游 离酶 测定酶标抗体工作浓度
试验中有关术语及试剂：
包被(coat)：将Ag或Ab吸附在固相
载体上的过程，又称固相化或吸附。包被后， 不能被洗脱。包被缓冲液：PH9.6 CB
C.显微镜：普通的光学显微镜。
光路程序：
白炽光源 —— 发射紫外光or兰紫 光 —— 激发滤板 ——紫外光
——被检物（荧光染色标本）——紫 外光＋荧光 —— 抑制滤板——荧光 （显微镜下可见）
隔
光 源
热 滤 片
目镜 阻挡滤镜
激 发 滤 载玻片 片
物镜 聚光器
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。
把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。
1 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。
1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。
而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。
这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1．4用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。
而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。
由于综合利用了以上技术。
可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。
2 ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用目前,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ)、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ)等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
荧光分析技术在分子生物学中的应用
荧光分析技术在分子生物学中的应用荧光分析技术是一种利用特定的荧光标记物来探究生物分子相互作用和生物过程的工具。
作为一种强大的科研手段，荧光分析技术已经广泛应用在分子生物学领域，为生物学家们提供了有效的研究手段。
一、荧光探针荧光探针是荧光分析技术中的核心，其不仅仅可以被用来标记蛋白质、核酸、糖类等生物分子，还可以被用来探寻这些分子之间的相互作用。
常用的荧光探针包括荧光素、花青素、萤火虫荧光酶等化合物。
在分子生物学中使用最广泛的荧光探针是荧光素和荧光素衍生物。
这些化合物具有高度荧光发射效率和稳定性，并且可以通过小分子化合物或者蛋白质结合物的变化而产生荧光信号。
二、荧光共振能量转移技术（FRET）荧光共振能量转移技术是一种基于荧光信号传递的技术，用于探测蛋白质、核酸等生物分子之间的相互作用。
该技术基于两个特殊的荧光探针——受体和给体，这两种荧光探针分别发射不同波长的荧光信号。
当受体分子与给体分子靠近时，给体分子会通过荧光共振能量转移技术而发射出荧光信号，而这个荧光信号的能量来自于受体分子。
通过这种方式，研究人员可以得出有关分子之间的相互位置和相互作用的信息。
三、荧光显微镜荧光显微镜是荧光分析技术中最重要的工具之一，其可以在细胞水平上进行高分辨率成像，并进一步探究分子之间的相互作用。
与传统的显微镜不同，荧光显微镜通过使用荧光探针而不是普通的反射光来获得图像。
荧光显微镜通常具有高强度的光源和高灵敏度的摄像机，以及专用的荧光滤光片和物镜来获取高质量的图像。
可以通过在荧光显微镜中结合FRET技术来可视化细胞中分子之间的相互作用，并以此来更好地理解生物过程。
四、荧光酶标记技术荧光酶标记技术是一种将酶与荧光标记物结合的方法，用于检测蛋白质、核酸天然状态下活性的改变。
通过这种方法，研究人员可以更流程地监测生物分子的表达变化或活性的调整。
荧光酶标记技术是一个非常敏感的方法，可以用于监测微笑浓度的变化，从而支持癌症诊断和治疗过程的预测和监测。
荧光原位杂交技术(FISH)常见问答
荧光原位杂交技术（FISH）常见问答对于FISH操作来说，那些因素比较重要？在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。
温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度；各种试剂pH是否符合要求直接关系到FISH的稳定性。
在夏季成功检测的同一探针和样本为什么在冬季就得不到理想的效果？发生上述现象最大的可能是FISH操作的环境温度发生了变化导致的。
在我国，冬季普遍比夏季寒冷，低的环境温度使FISH得不到良好的杂交效率。
此外，探针的保存不当也容易引起荧光素的萃灭而导致效果不佳。
因此保证FISH操作中的温度非常重要。
该如何保证FISH操作中的温度？最佳的措施是使用一些FISH的专用仪器进行操作。
如果是手工操作，首先要对FISH操作过程中可能使用的一些仪器进行温控能力的检查，诸如水浴锅、孵箱，对其中不符合要求的要进行更换（疾病诊断中的探针要求温控精度在1度以内）。
其次，要尽可能地保持操作环境温度在20度以上，对于在冬季进行的FISH 操作尤为重要。
此外对于需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其进行测温。
同时检测的样本最好不能超过4块。
操作中的行动一定要迅速。
操作者还往往忽视一些小部件的温度，诸如载玻片和盖玻片。
特别是在冬季，盖玻片本身温度就低，加之探针的量本就不多（10ul），因此事先没有预热的盖玻片会使得杂交液的温度急剧下降严重地影响了探针和目标DNA的杂交效率。
因此对上述小部件的预热也能有效地提高FISH的杂交效果。
使用荧光显微镜观察结果时，最初有清晰而明亮的信号。
但随后信号急剧衰减。
几分钟后信号就消失了。
这是探针本身的质量问题吗？在正常情况下，目前的商业化探针即使是杂交后，如果保存适当，荧光信号能保持半年以上。
出现上述情况主要的原因是操作观察的过程中或是探针的保存过程中没有采取严格的避光措施。
阳光或是强的灯光都会使荧光染料发生急剧的淬灭，从而造成了观察结果的不稳定。
2021-2022学年山东省实验中学高三(上)第一次段考生物试卷(附详解)
2021-2022学年山东省实验中学高三（上）第一次段考生物试卷1.如图表示真核细胞中发生的某些相关生理和生化反应过程，其中字母代表物质或结构，数字代表生理过程，如果细胞中的r-蛋白含量较多，细胞中会发生④过程。
据此分析，错误的是（）A. 结构a是核糖体，物质b是mRNA，过程①是翻译过程B. c是基因，是指导rRNA合成的直接模板，过程②需要DNA聚合酶参与催化C. 过程③正在形成细胞中的核糖体，这一过程与细胞核中的核仁密切相关D. r-蛋白与b结合，会阻止b与a结合，影响过程①，该机制属于反馈调节2.心肌细胞不能增殖，基因ARC在心肌细胞中特异性表达，抑制其凋亡，以维持正常数量。
细胞中某些基因转录形成的前体RNA经过加工过程中会产生许多非编码RNA，如miR-223（链状），HRCR（环状）。
结合图回答问题：（1）启动过程①时，______酶需识别并与基因上的启动子结合。
过程②的场所是______，该过程最终合成的T1、T2、T3三条多肽链的氨基酸顺序______（填“相同”或“不同”）。
（2）当心肌缺血、缺氧时，基因miR-223过度表达，最终可能导致心力衰竭，请据图分析原因______。
（3）根据所学的知识及题中信息，判断下列关于RNA功能的说法，正确的是______（填写字母序号）。
a．有的RNA可作为遗传物质b．有的RNA是构成某些细胞器的成分c．有的RNA具有催化功能d．有的RNA可调控基因表达e．有的RNA可运输氨基酸f.有的RNA可作为翻译的直接模板（4）与基因ARC相比，核酸杂交分子1中特有的碱基对是______。
科研人员认为，HRCR有望成为减缓心力衰竭的新药物，据图分析其依据是：______。
3.在证明DNA是遗传物质的过程中，T2噬菌体侵染大肠杆菌的实验发挥了重要作用。
下列与该噬菌体相关的叙述，正确的是（）A. T2噬菌体也可以在肺炎双球菌中复制和增殖B. T2噬菌体病毒颗粒内可以合成mRNA和蛋白质C. 培养基中的32P经宿主摄取后可出现在T2噬菌体的核酸中D. 人体免疫缺陷病毒与T2噬菌体的核酸类型和增殖过程相同4.果蝇体内两条X染色体有时可融合成一个X染色体，称为并连X（记作“X^X”），其形成过程如图所示。
5-羧基荧光素标记明胶
5-羧基荧光素标记明胶1.引言1.1 概述概述部分的内容可以根据以下思路编写：概述部分旨在引导读者了解本文的主题和内容，为后续内容提供背景和上下文。
文章的主题是关于5-羧基荧光素标记明胶的研究。
本节将简要介绍荧光素和明胶的基本概念，并明确本文的目的和结构。
首先，荧光素是一种具有荧光特性的有机化合物，它在许多生物学和化学研究中被广泛应用。
荧光素具有高荧光强度、长寿命和良好的光稳定性，使其成为标记生物分子、探针和荧光染料的理想选择。
荧光素标记的生物分子可以用于细胞成像、蛋白质分析、基因检测等多个领域。
明胶是一种常见的蛋白质，它通常从动物的骨骼或软骨中提取得到。
明胶具有良好的生物相容性、生物可降解性和可调节性，因此在医药领域和组织工程中有着广泛的应用。
将荧光素与明胶结合可以赋予明胶新的功能和特性，如荧光成像和药物缓释等。
本文的目的是介绍5-羧基荧光素标记明胶的制备方法和应用，以及相关的研究进展。
具体而言，将探讨荧光素标记明胶的制备过程、性质表征和应用研究，以及潜在的应用前景。
通过阐述这些内容，我们希望为研究人员提供一种新颖且有效的方法，以便在生物医学和材料科学领域开展进一步的研究和应用。
接下来的章节将依次介绍荧光素的特性和荧光素标记明胶的制备方法。
在结论部分，将对整篇文章进行总结，并展望5-羧基荧光素标记明胶在未来的应用前景。
通过这篇文章的阅读，读者将能够全面了解5-羧基荧光素标记明胶的相关知识，并掌握其制备方法和应用领域。
同时，读者也可以对该领域的发展方向和研究前景有一个初步的认识。
1.2文章结构文章结构部分的内容应该对整篇文章进行一个简要的介绍，以帮助读者更好地理解文章的组织结构和内容安排。
下面是一种可能的编写方式：1.2 文章结构本文按照以下结构组织内容：引言部分首先概述了本文的研究背景和相关知识，并明确了文章的目的。
接下来，正文部分分为两个主要部分。
第一部分（2.1节）将重点讨论荧光素的特性。
5-羧基荧光素的检测方法
5-羧基荧光素的检测方法5-羧基荧光素（5-Carboxyfluorescein）是一种常用的荧光染料，广泛应用于生物医学研究、分子生物学和细胞生物学等领域。
本文将介绍5-羧基荧光素的检测方法及其在科学研究和应用中的重要性。
一、5-羧基荧光素的特性5-羧基荧光素是一种强荧光染料，具有较高的荧光量子产率和稳定性。
它在激发光源的作用下会发出明亮的绿色荧光。
5-羧基荧光素的化学结构中含有羧基，使其具有良好的水溶性，可方便地与生物分子进行偶联反应。
1. 荧光显微镜观察5-羧基荧光素可被荧光显微镜直接观察。
将待检样品中的5-羧基荧光素标记物染色后，使用荧光显微镜观察样品的荧光强度和分布情况，可以快速获得关于样品结构、功能和定位等信息。
2. 荧光光谱分析5-羧基荧光素的荧光光谱可用于定量分析。
通过测量5-羧基荧光素在特定波长下的发射光谱，可以确定其浓度和纯度。
同时，荧光光谱还可以用于研究5-羧基荧光素与其他分子之间的相互作用，如荧光共振能量转移（FRET）等。
3. 荧光强度测定荧光强度测定是常用的5-羧基荧光素检测方法之一。
通过测量5-羧基荧光素在特定波长下的荧光强度，可以定量获得样品中5-羧基荧光素的含量。
这种方法简单、灵敏，可以应用于生物样品中5-羧基荧光素的定量分析。
4. 荧光染色技术5-羧基荧光素可作为荧光染料用于标记生物分子。
通过与其他分子或材料的偶联反应，可以将5-羧基荧光素引入到待检样品中，实现对目标分子的定位和可视化观察。
荧光染色技术广泛应用于细胞生物学、分子生物学和生物医学研究中。
三、5-羧基荧光素的应用1. 生物成像5-羧基荧光素作为一种优秀的荧光染料，可用于生物样品的成像研究。
通过将5-羧基荧光素标记于生物分子或细胞上，可以实现对生物过程和细胞内分子的实时观察和定量分析，为生物学研究提供了重要的工具。
2. 分子探针5-羧基荧光素还可用作分子探针，用于检测生物样品中特定分子的存在和活性。
DNA重排的检测方法
小麦－簇毛麦F1 代染色体间易位
染色体涂染显示人染色体组
荧光标记探针
• 不对环境构成污染 • 灵敏度能得到保障 • 可进行多色观察分析，可同时使用多个
探针，缩短因单个探针分开使用导致的 周期过长和技术障碍。
4. 比较基因组杂交
Comparative Genomic Hybridization (CGH)
• 原理：在扩增反应中加入不等量的两段寡核 苷酸引物，引物量相差100倍，通过PCR扩增 获得单链DNA，然后利用双脱氧法直接测序。
• 应用：扩增产物的测序，可以很容易确定群 体中某一特定基因的序列变异情况，这种方 法是了解目的基因突变的较理想的方法。
(5) 原位PCR技术
• 原理：即聚合酶原位扩增技术。将PCR技术 与原位杂交技术结合起来，不改变周围组织 的原有位置，直接在组织、细胞或病原体原 位研究基因变化的技术。
光谱核型分析原理(Spectral karyotyping, SKY)
1996 年 Schroch等首次描述了SKY技术。 应用5种荧光素同时标记24条人染色体，制成 染色体涂染探针，应用Fourier光谱仪，CC成 像和荧光显微镜进行检测分析，经计算成像处 理，46条染色体形成具有不同颜色的核型影像, 可用以分析各种染色体异常。
应用：
• 主要应用在检测肿瘤细胞的遗传变化 • 物种间染色体同源性比较 优势：
• 可快捷检测中期、间期基因组 • 不需预先知道DNA发生改变的部位 • 一次实验即可检出待测样本整个基因
组拷贝数的增减
四、分子生物学技术
1. Southern-blotting • 应用于基因重排检测是1981年Korsmeyer等
• 优势：Southern分析已被应用于IgH、 Igk、 Igl及各种TCR(T-细胞受体)克隆性重排的检测， 并以其令人满意的灵敏度和可靠性被视为基因 重排检测的“金标准”。
生物发光技术在荧光显微镜中的应用
生物发光技术在荧光显微镜中的应用荧光显微镜是分子细胞生物学研究的重要工具，其基本原理是利用特定的荧光染料标记生物分子，通过激发荧光染料的发光来观察样品中的生物分子分布、形态、数量和活动状态等信息。
然而，传统荧光染料存在着染色不均匀、互相干扰、光漂白等问题，限制了荧光显微镜的应用范围。
随着生物发光技术的发展，越来越多的研究者开始利用发光生物体系作为荧光标记，取得了许多有趣的研究进展。
本文将介绍生物发光技术在荧光显微镜中的应用，包括发光蛋白、荧光素、纳米颗粒等。
发光蛋白发光蛋白是指能够在生物体内或外发出荧光的蛋白质分子，具有快速、无需添加荧光染料等优点。
其中最为常用的是来自于水母的荧光蛋白，如绿色荧光蛋白（GFP）、黄色荧光蛋白（YFP）、红色荧光蛋白（RFP）等。
发光蛋白是通过在它们的空间构象中纳入芳环結構来发光的。
芳环结构跨越了α螺旋和β折叠的氨基酸残基，形成带有共轭双键的色团。
在发光状态下，芳环结构的π轨道与相邻的基团相互作用形成自旋极化态，随着自旋松弛，碳氧双键形成共振结构，最终将电子激发至高能级，进而脱离体系形成荧光。
发光蛋白的研究发展经历了不断的改进和优化，包括产生多种颜色变异体、改善抗性等。
目前已经广泛应用于各种生物领域中，如细胞标记、蛋白质交互作用研究、基因表达调控等。
在荧光显微镜中，发光蛋白分子可以直接标记蛋白质、细胞结构等，形成高亮度、无毒性的荧光信号，帮助研究者观察和追踪细胞生命周期、活动过程等。
荧光素荧光素是自然界中广泛存在的一类发光物质，具有自发性荧光的特性。
荧光素分子由苯并噁唑环和苯环构成，其中苯并噁唑环通过与苯环形成氢键，形成电荷转移络合物稳定荧光态。
荧光素分子广泛存在于生物界中，如萤火虫、柿子、蘑菇等，是萤火虫发光的原因。
荧光素也可以通过化学合成获得，被广泛应用于生物荧光显微镜的研究中。
荧光素分子可以一次性激发多种荧光色，最常见的是蓝色荧光素、绿色荧光素和红色荧光素等。
出生缺陷和先天性代谢异常及其新生儿疾病筛查PPT教案
主要内容
1
出生缺陷
2 细胞遗传学和分子细胞遗传学诊断方法
3
新生儿疾病筛查及遗传代谢病
细胞遗传学检查诊断染色体病
· 染色体的形态和类型 · 染色体的显带技术 · 染色体的异常
数目的改变和结构的畸变
染色体的形态和类型
染色体的形态和类型
染色体核型：46，XY
染色体显带技术
• G-显带（胰酶处理后，Giemsa染色） 常规染色体分析 高分辨染色体分析
• 特点： 结果容易判读。然而，整条染色体涂染探针不能 分辨同一染色体臂间易位及染色体倒位
• 应用: （a）染色体数目和结构异常分析 （b）白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究
Identification of a Balanced Translocation
t (6;7)
24 colour karyotype
21-三体综合征
“先天愚型”或“唐氏综合征（Downs syndrome） ” ，在新生儿中的发病率 约为1/600。 临床上有明显的智力和生长发育障碍、 特殊面容和多发畸形，其共同的典型特 征： 眼距宽、外眼角上斜、鼻根低平、 伸舌等痴呆面容和特异的皮肤纹理(通贯 手等)。
Down氏综合征
• 全国约有60万以上 • 每年新增2.66万例 • 每个患者医疗支出45.4万元 • 每年用于抚养、治疗和护理
选择筛查的疾病一般符合以下几个 标准
• 疾病危害严重 • 有一定的发病率 • 疾病早期无特殊症状，但有
实验室指标能显示阳性 • 有可靠的、适合于大规模进行
的筛查方法 • 筛查疾病可以治疗 • 筛查费用低廉
我国新生儿疾病筛查疾病谱
• 先天性甲状腺功能减低症（CH） • 苯丙酮尿症（PKU） • 先天性肾上腺皮质增生症（CAH） • 半乳糖血症 • G-6-PD缺乏症 • 听力筛查 • 其他遗传代谢性疾病
染色体荧光原位杂交技术
3.3 YAC的定位和YAC重叠群 (contig)的构建
• YAC的容量比起cos质粒来就更大了，最大的可达2Mb。定位YAC 的方法有三种。有些探针在染色体上的位置已知(可以用FISH来定 位)，而又可以肯定它在某个YAC中，那么这个YAC在染色体上的 位置就确定了；YAC也可以直接进行FISH。先抽提酵母的DNA， 然后脉冲电泳分离出YAC的插入片段，用此插入片段进行FISH； 现在PCR技术越来越成熟，可以用Alu PCR法扩增YAC上的插入部 分，将A1u PCR产物来进行FISH。在多个YAC分别定位的基础上， 或根据几个YAC经多色标记后同时与染色体杂交后的结果，可以按 YAC间的相对位置来构建YAC重叠群。所得的结果可通过一个 YAC经标记后与YAC库内的其它YAC进行杂交的结果来验证。 1991年，Montanaro报道，他们用FISH的方法定位了102个YAC。这 些YAC覆盖了Xq24－Xq28的50％的区域。他们定位的精度是0.5带， 所以这l02个YAC就分布在9个区段内(半条带为一个区段)。这些结 果综合起来为YAC重叠群的构建提供了一条道路。
• SCP的定位是染色体骨架图构建的主要内容之 一。当SCP用生物素标记之后，与中期染色体 杂交，用免疫荧光标记的试剂检测，就可以明 确地知道某个SCP在做好分带的中期染色体上 的位置。SCP的定位是应用FISH技术进行人类 基因组研究中的最简单的一种。但是太小的片 段在实际工作中的难度较大。FISH不仅可使 SCP直接定位于染色体上，也可以定位于间期 核，为高分辨的基因作图和核组织分析提供了 有力的手段。
影响杂交结果的参数有下列几个：探针浓 度，杂交时间，探针大小，杂交温度， 染色质变性条件，染色体的制备和硬化 程度，RNase作用条件，用于降低背景 的非特异性竞争DNA和醋酸酐处理．其 中有几个因素影响杂交信号的强度和特 异性，具体的讲是DNA探针的纯度；用 于杂交反应的探针的大小．小心掌握好 这些条件，我们就能得到没有荧光背景 的特异性信号。
（完整版）Fish实验
（完整版）Fish实验FISH-荧光原位杂交实验（原位杂交）实验目的通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。
掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。
2. 实验原理荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。
目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。
FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分为三类：1）染色体特异重复序列探针，例如a卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。
间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。
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Figure 5._Southern blot analysis of the T-cell receptor -chain gene. Three specimens are shown, each digested with Eco RI, Bam HI, and Hin dIII restriction enzymes, run in agarose gels, transferred to a nylon membrane, and hybridized with a radioactively labeled J probe. Two specimens, one (negative control) in lanes 2, 5, and 8, and the second in lanes 3, 6, and 9, reveal only germline bands and are polyclonal. The third specimen, in lanes 4, 7, and 10, has evidence of gene rearrangement in all 3 lanes and is monoclonal. Lane 1 shows the markers. Lane 11 is a 5% sensitivity control
原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂 交技术而发展起来的技术，主要用于 肿瘤的检测及其基因组分析
是由Kallioniemi等在1992年首先提出的，是检 测整个肿瘤基因组DNA增加或减少的强有力的 工具
• 肿瘤DNA和对照DNA 在染色体上的相对结 合量取决于两种DNA 标本中相应杂交序列 的多少 • 因此可根据不同荧 光強度的比率而定量 分析肿瘤基因組中 DNA的增加或丟失
人染色体光谱核型分析
乳腺癌细胞染色体复杂的畸变
2.染色体显带技术： • C-banding 主要染异染色质 • R-banding 与C-banding 相反，主要染 常 染色质区域 • G-banding 是Giemsa 染色结果，产生深 浅不同的条带 • Q-banding 是用喹丫因（quinacrine） 染 色得到的荧光条带，带型与G带相似
等比混合
比较基因组杂交原理示意
比较基因组杂交过程
DAPI 4’,6-二联脒-2吲哚苯
FITC 异硫氰酸酯
TRITC 硫氰酸四甲基罗丹明
人染色体不同荧光素染色结果
数 字 化 图 像
FITC/TRITC 荧光强度比率分析图 Ratio image FITC/TRITC
应用： • 主要应用在检测肿瘤细胞的遗传变化 • 物种间染色体同源性比较 优势： • 可快捷检测中期、间期基因组 • 不需预先知道DNA发生改变的部位 • 一次实验即可检出待测样本整个基因 组拷贝数的增减
荧光原位杂交，据标记物不同可分为： • 间接法：用生物素或地高辛标记探针， 通过与荧光染料结合的抗生物素或抗 地高辛抗体将信号放大而进行检测。 • 直接法：直接用荧光素标记，如Vysis 公司的FISH探针。
荧光原位杂交原理示意
荧光原位杂交过程
急性骨髓白血病 10、11号染色体间易位
10、11号染色体易发生 断裂的基因(MLL)位点
G-带 c. 正常染色体 a. 末端缺失 d. 末端倒位 b. 末端单向易位 e. 着丝粒周倒位
G－带显示人急性骨髓白血病异常染色体 9、10、11染色体间易位，右为异常染色体
三、分子细胞遗传学
1. 原位杂交（In situ hybridisation） 标记的核酸探针变性后与已变性的靶核 酸在退火温度下复性，在不改变被分析 对象，即维持其原位的前提下对靶核酸 进行分析。 2. 荧光原位杂交
小麦－簇毛麦F1 代染色体间易位
染色体涂染显示人染色体组
荧光标记探针
• 不对环境构成污染 • 灵敏度能得到保障 • 可进行多色观察分析，可同时使用多个 探针，缩短因单个探针分开使用导致的 周期过长和技术障碍。
4. 比较基因组杂交
Comparative Genomic Hybridization (CGH)
1996 年 Schroch等首次描述了SKY技术。 应用5种荧光素同时标记24条人染色体，制成 染色体涂染探针，应用Fourier光谱仪，CC成 像和荧光显微镜进行检测分析，经计算成像处 理，46条染色体形成具有不同颜色的核型影像, 可用以分析各种染色体异常。
优势： • 特异性和分辨率比传统的显带技术高，它 可以检测到 1.5mb 碱基的转位 • 一次杂交即可分辨人的24条染色体
Fluorescent in situ hybridisation (FISH)
核酸探针用荧光染料标记，荧光信号通 过显微镜观察。
3. 染色体涂染(Chromosome painting)
又称为多重荧光原位杂交(multiplexfluorescence in situ hybridisation, M-FISH) • 可同时检测多个染色体，一次杂交即可检 测人的24条染色体 • 可检测简单及复杂的染色体重排
二、细胞遗传学
染色体核型分析、染色体显带 一个物种的染色体核型及带型是稳定的 1. 染色体核型分析：观察中期染色体，初步 分析染色体有无较大片段的缺失、断裂、 易位、及附加 • 常规核型分析 • 荧光核型分析 • 光谱核型分析(Spectral karyotyping, SKY)
பைடு நூலகம்
光谱核型分析原理(Spectral karyotyping, SKY)
DNA重排的检测方法
马欣荣
高方远
康海歧
一、形态学观察 二、细胞遗传学 如：染色体核型分析、染色体显带等 三、分子细胞遗传学 如：荧光原位杂交 四、分子生物学 如： Southern杂交，PCR及相关技术等
一、形态学观察 例子：
• 上个世纪40年代科学家B．McClintock 观察研究玉米籽粒和叶子时发现有颜色 变化。 这种颜色变化是由遗传结构的基 本改变引起的，从而导致转座子的发现。 • 肿瘤细胞与正常细胞 肿瘤细胞中基因重排现象非常普遍，遗 传结构的改变引起表型的改变。因此从 形态学上可以鉴定肿瘤。
四、分子生物学技术
1. Southern-blotting • 应用于基因重排检测是1981年Korsmeyer等 首先进行的。 • 淋巴瘤DNA重排:将细胞DNA抽提出来,用限 制 性内切酶进行酶切，胚系DNA就会产生特征 性片段。但发生过基因重排的细胞DNA的酶 切位点有所改变，会产生有别于胚系的DNA 酶切片段。转膜后，与标记的DNA探针杂交， 如有一定数量的克隆性增殖的淋巴细胞存 在 (>1 ~ 5% ），克隆性的基因重排条带就 可显示出来。对于正常或多克隆性的淋巴 细胞增生，由于重排片段大小各异而显弥