应用5种荧光素同时标记24条人染色体-显微镜
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1996 年 Schroch等首次描述了SKY技术。 应用5种荧光素同时标记24条人染色体，制成 染色体涂染探针，应用Fourier光谱仪，CC成 像和荧光显微镜进行检测分析，经计算成像处 理，46条染色体形成具有不同颜色的核型影像, 可用以分析各种染色体异常。
优势： • 特异性和分辨率比传统的显带技术高，它 可以检测到 1.5mb 碱基的转位 • 一次杂交即可分辨人的24条染色体
荧光原位杂交，据标记物不同可分为： • 间接法：用生物素或地高辛标记探针， 通过与荧光染料结合的抗生物素或抗 地高辛抗体将信号放大而进行检测。 • 直接法：直接用荧光素标记，如Vysis 公司的FISH探针。
荧光原位杂交原理示意
荧光原位杂交过程
急性骨髓白血病 10、11号染色体间易位
10、11号染色体易发生 断裂的基因(MLL)位点
Fluorescent in situ hybridisation (FISH)
核酸探针用荧光染料标记，荧光信号通 过显微镜观察。
3. 染色体涂染(Chromosome painting)
又称为多重荧光原位杂交(multiplexfluorescence in situ hybridisation, M-FISH) • 可同时检测多个染色体，一次杂交即可检 测人的24条染色体 • 可检测简单及复杂的染色体重排
Figure 5._Southern blot analysis of the T-cell receptor -chain gene. Three specimens are shown, each digested with Eco RI, Bam HI, and Hin dIII restriction enzymes, run in agarose gels, transferred to a nylon membrane, and hybridized with a radioactively labeled J probe. Two specimens, one (negative control) in lanes 2, 5, and 8, and the second in lanes 3, 6, and 9, reveal only germline bands and are polyclonal. The third specimen, in lanes 4, 7, and 10, has evidence of gene rearrangement in all 3 lanes and is monoclonal. Lane 1 shows the markers. Lane 11 is a 5% sensitivity control
人染色体光谱核型分析
乳腺癌细胞染色体复杂的畸变
2.染色体显带技术： • C-banding 主要染异染色质 • R-banding 与C-banding 相反，主要染 常 染色质区域 • G-banding 是Giemsa 染色结果，产生深 浅不同的条带 • Q-banding 是用喹丫因（quinacrine） 染 色得到的荧光条带，带型与G带相似
四、分子生物学技术
1. Southern-blotting • 应用于基因重排检测是1981年Korsmeyer等 首先进行的。 • 淋巴瘤DNA重排:将细胞DNA抽提出来,用限 制 性内切酶进行酶切，胚系DNA就会产生特征 性片段。但发生过基因重排的细胞DNA的酶 切位点有所改变，会产生有别于胚系的DNA 酶切片段。转膜后，与标记的DNA探针杂交， 如有一定数量的克隆性增殖的淋巴细胞存 在 (>1 ~ 5% ），克隆性的基因重排条带就 可显示出来。对于正常或多克隆性的淋巴 细胞增生，由于重排片段大小各异而显弥
DNA重排的检测方法
马欣荣
高方远
康海歧
一、形态学观察 二、细胞遗传学 如：染色体核型分析、染色体显带等 三、分子细胞遗传学 如：荧光原位杂交 四、分子生物学 如： Southern杂交，PCR及相关技术等
一、形态学观察 例子：
• 上个世纪40年代科学家B．McClintock 观察研究玉米籽粒和叶子时发现有颜色 变化。 这种颜色变化是由遗传结构的基 本改变引起的，从而导致转座子的发现。 • 肿瘤细胞与正常细胞 肿瘤细胞中基因重排现象非常普遍，遗 传结构的改变引起表型的改变。因此从 形态学上可以鉴定肿瘤。
等比混合
比较基因组杂交原理示意
比较基因组杂交过程
DAPI 4’,6-二联脒-2吲哚苯
源自文库
FITC 异硫氰酸酯
TRITC 硫氰酸四甲基罗丹明
人染色体不同荧光素染色结果
数 字 化 图 像
FITC/TRITC 荧光强度比率分析图 Ratio image FITC/TRITC
应用： • 主要应用在检测肿瘤细胞的遗传变化 • 物种间染色体同源性比较 优势： • 可快捷检测中期、间期基因组 • 不需预先知道DNA发生改变的部位 • 一次实验即可检出待测样本整个基因 组拷贝数的增减
小麦－簇毛麦F1 代染色体间易位
染色体涂染显示人染色体组
荧光标记探针
• 不对环境构成污染 • 灵敏度能得到保障 • 可进行多色观察分析，可同时使用多个 探针，缩短因单个探针分开使用导致的 周期过长和技术障碍。
4. 比较基因组杂交
Comparative Genomic Hybridization (CGH)
二、细胞遗传学
染色体核型分析、染色体显带 一个物种的染色体核型及带型是稳定的 1. 染色体核型分析：观察中期染色体，初步 分析染色体有无较大片段的缺失、断裂、 易位、及附加 • 常规核型分析 • 荧光核型分析 • 光谱核型分析(Spectral karyotyping, SKY)
光谱核型分析原理(Spectral karyotyping, SKY)
G-带 c. 正常染色体 a. 末端缺失 d. 末端倒位 b. 末端单向易位 e. 着丝粒周倒位
G－带显示人急性骨髓白血病异常染色体 9、10、11染色体间易位，右为异常染色体
三、分子细胞遗传学
1. 原位杂交（In situ hybridisation） 标记的核酸探针变性后与已变性的靶核 酸在退火温度下复性，在不改变被分析 对象，即维持其原位的前提下对靶核酸 进行分析。 2. 荧光原位杂交
原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂 交技术而发展起来的技术，主要用于 肿瘤的检测及其基因组分析
是由Kallioniemi等在1992年首先提出的，是检 测整个肿瘤基因组DNA增加或减少的强有力的 工具
• 肿瘤DNA和对照DNA 在染色体上的相对结 合量取决于两种DNA 标本中相应杂交序列 的多少 • 因此可根据不同荧 光強度的比率而定量 分析肿瘤基因組中 DNA的增加或丟失
优势： • 特异性和分辨率比传统的显带技术高，它 可以检测到 1.5mb 碱基的转位 • 一次杂交即可分辨人的24条染色体
荧光原位杂交，据标记物不同可分为： • 间接法：用生物素或地高辛标记探针， 通过与荧光染料结合的抗生物素或抗 地高辛抗体将信号放大而进行检测。 • 直接法：直接用荧光素标记，如Vysis 公司的FISH探针。
荧光原位杂交原理示意
荧光原位杂交过程
急性骨髓白血病 10、11号染色体间易位
10、11号染色体易发生 断裂的基因(MLL)位点
Fluorescent in situ hybridisation (FISH)
核酸探针用荧光染料标记，荧光信号通 过显微镜观察。
3. 染色体涂染(Chromosome painting)
又称为多重荧光原位杂交(multiplexfluorescence in situ hybridisation, M-FISH) • 可同时检测多个染色体，一次杂交即可检 测人的24条染色体 • 可检测简单及复杂的染色体重排
Figure 5._Southern blot analysis of the T-cell receptor -chain gene. Three specimens are shown, each digested with Eco RI, Bam HI, and Hin dIII restriction enzymes, run in agarose gels, transferred to a nylon membrane, and hybridized with a radioactively labeled J probe. Two specimens, one (negative control) in lanes 2, 5, and 8, and the second in lanes 3, 6, and 9, reveal only germline bands and are polyclonal. The third specimen, in lanes 4, 7, and 10, has evidence of gene rearrangement in all 3 lanes and is monoclonal. Lane 1 shows the markers. Lane 11 is a 5% sensitivity control
人染色体光谱核型分析
乳腺癌细胞染色体复杂的畸变
2.染色体显带技术： • C-banding 主要染异染色质 • R-banding 与C-banding 相反，主要染 常 染色质区域 • G-banding 是Giemsa 染色结果，产生深 浅不同的条带 • Q-banding 是用喹丫因（quinacrine） 染 色得到的荧光条带，带型与G带相似
四、分子生物学技术
1. Southern-blotting • 应用于基因重排检测是1981年Korsmeyer等 首先进行的。 • 淋巴瘤DNA重排:将细胞DNA抽提出来,用限 制 性内切酶进行酶切，胚系DNA就会产生特征 性片段。但发生过基因重排的细胞DNA的酶 切位点有所改变，会产生有别于胚系的DNA 酶切片段。转膜后，与标记的DNA探针杂交， 如有一定数量的克隆性增殖的淋巴细胞存 在 (>1 ~ 5% ），克隆性的基因重排条带就 可显示出来。对于正常或多克隆性的淋巴 细胞增生，由于重排片段大小各异而显弥
DNA重排的检测方法
马欣荣
高方远
康海歧
一、形态学观察 二、细胞遗传学 如：染色体核型分析、染色体显带等 三、分子细胞遗传学 如：荧光原位杂交 四、分子生物学 如： Southern杂交，PCR及相关技术等
一、形态学观察 例子：
• 上个世纪40年代科学家B．McClintock 观察研究玉米籽粒和叶子时发现有颜色 变化。 这种颜色变化是由遗传结构的基 本改变引起的，从而导致转座子的发现。 • 肿瘤细胞与正常细胞 肿瘤细胞中基因重排现象非常普遍，遗 传结构的改变引起表型的改变。因此从 形态学上可以鉴定肿瘤。
等比混合
比较基因组杂交原理示意
比较基因组杂交过程
DAPI 4’,6-二联脒-2吲哚苯
源自文库
FITC 异硫氰酸酯
TRITC 硫氰酸四甲基罗丹明
人染色体不同荧光素染色结果
数 字 化 图 像
FITC/TRITC 荧光强度比率分析图 Ratio image FITC/TRITC
应用： • 主要应用在检测肿瘤细胞的遗传变化 • 物种间染色体同源性比较 优势： • 可快捷检测中期、间期基因组 • 不需预先知道DNA发生改变的部位 • 一次实验即可检出待测样本整个基因 组拷贝数的增减
小麦－簇毛麦F1 代染色体间易位
染色体涂染显示人染色体组
荧光标记探针
• 不对环境构成污染 • 灵敏度能得到保障 • 可进行多色观察分析，可同时使用多个 探针，缩短因单个探针分开使用导致的 周期过长和技术障碍。
4. 比较基因组杂交
Comparative Genomic Hybridization (CGH)
二、细胞遗传学
染色体核型分析、染色体显带 一个物种的染色体核型及带型是稳定的 1. 染色体核型分析：观察中期染色体，初步 分析染色体有无较大片段的缺失、断裂、 易位、及附加 • 常规核型分析 • 荧光核型分析 • 光谱核型分析(Spectral karyotyping, SKY)
光谱核型分析原理(Spectral karyotyping, SKY)
G-带 c. 正常染色体 a. 末端缺失 d. 末端倒位 b. 末端单向易位 e. 着丝粒周倒位
G－带显示人急性骨髓白血病异常染色体 9、10、11染色体间易位，右为异常染色体
三、分子细胞遗传学
1. 原位杂交（In situ hybridisation） 标记的核酸探针变性后与已变性的靶核 酸在退火温度下复性，在不改变被分析 对象，即维持其原位的前提下对靶核酸 进行分析。 2. 荧光原位杂交
原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂 交技术而发展起来的技术，主要用于 肿瘤的检测及其基因组分析
是由Kallioniemi等在1992年首先提出的，是检 测整个肿瘤基因组DNA增加或减少的强有力的 工具
• 肿瘤DNA和对照DNA 在染色体上的相对结 合量取决于两种DNA 标本中相应杂交序列 的多少 • 因此可根据不同荧 光強度的比率而定量 分析肿瘤基因組中 DNA的增加或丟失