免疫组化在皮肤科中的应用

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反应原理
链霉
SP或SAP法
该法是ABC法基础上的进一步改良,使卵白素与链霉 (而非生物素)结合,而后再结合过氧化物酶 。它有 4个亚基可与生物素结合,灵敏特异,背景低,成本低。
优点:更简便,放大倍数↑,等电点中性更适合组织, 分子量小,穿透力↑。
(三)染色步骤(SP法为例)
每份组织均切3μm的薄片,于60℃烤箱烤片6h 以上备用。具体步骤如下:
人体常见细胞的免疫组化特性
淋巴细胞
B 细胞:CD45+;CD20+;CD45RA+ ; CD79a+
T 细胞: CD45+; CD3+; CD45RO+; CD43+; 多数TCRαβ, 有时TCR-γδ; CD4+ /CD8+; T细胞亚群可表达细 胞溶解因子(granzyme B, TIA1, perforin)
人体常见细胞的免疫组化特性
肥大细胞
CD117+
组织细胞
CD45+; S100-; CD68+; CD1a-; lysozyme+; HLA-DR+; CD43+
人体常见细胞的免疫组化特性
皮肤、粘膜、软组织器官
1、上皮 CK+ (腺上皮倾向表达低分子量CK,有些上皮 可表达特殊CK亚型); vimentin-/+; BerEP4+/-; EMA+/-; E-cadherin+/-
人体常见细胞的免疫组化特性
2、特殊类型上皮细胞 * 表皮:34E12+, CAM5.2-, CK5/6+ 基底层上方:CK1、CK10 基底层:CK5、CK14 * 腺上皮:CEA 可能+ (管腔面); EMA 通
常+ , CK8+
人体常见细胞的免疫组化特性
3、肌上皮 CK+; CK14+; 高分子量 CK+; Actin+; calponin+; S100-/+; GFAP-/+; Vimentin+
4、黑素细胞 S100+; Vimentin+; CK-; c-kit+; HMB45- (交界区黑色素细胞可+);
人体常见细胞的免疫组化特性
5、Merkel细胞:CK+; CK20+; NSE+; synaptophysin+; chromogranin+; neurofilament+
6、 Langerhans细胞:CD45+; S100+; CD68-/+; CD1a+; lysozyme-/+; HLADR+
除去血清
PBS冲洗3次×3min 除去PBS液
滴加一抗,室温60min或4℃过夜
加生物素-二抗,室温孵育10~30’
PBS冲洗3次×3min,除去PBS液
人体常见细胞的免疫组化特性
淋巴细胞 浆细胞 自然杀伤细胞 肥大细胞 组织细胞 皮肤、粘膜、软组织器官 间质细胞 间皮细胞 骨髓 神经来源细胞
IHC标记:CK8、Bcl-2等
鉴别诊断:鳞癌(低分化)、毛发上皮瘤、毛源性 肿瘤、毛囊漏斗肿瘤、汗管样小汗腺癌、日光 角化病等
左图:BCC
右图:BCC表达CK8阳性, CK10阴性
BCC伴有导管分化: CEA表达阳性
化生性BCC:梭形细胞 表达结合蛋白,示其向 平滑肌分化
Bowen病(原位鳞状细胞癌) 肿瘤细胞标记如下:泛角蛋白+;EMA+;
其共同特点是以一种物质对某种组织成分具有高 度亲合力为基础,其本质上又非抗原抗体反应。 因此,Bayer(1976)首次称之为亲合组织化学。 事实上,抗原抗体反应从本质上也属于亲合组织 化学这一范畴。
目前,亲合组织化学包括抗原与抗体、植物凝集 素和糖类、生物素与抗生物素、葡萄球菌A蛋白与 IgG、阳离子与阴离子、激素、维生素、糖及类脂 质作用部位和受体等。
亲和免疫组织化学技术
70年代以来,免疫组织化学在技术方法上不断 改进,涌现了一批新的技术方法,其特点为一 些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素 (Lectin)、生物素(Biotin)、亲和素 (avidin)和葡萄球菌A蛋白(SPA)等被应 用于免疫细胞化学技术,从而建立了SPA— HRP法、ABC法、BRAB法和LAB法等。
左:浅层细胞表达HMB-45,深层痣细胞不表达; 中:只有一种或两种痣细胞表达Ki-67; 右:只有少量真皮浅层痣细胞表达CyclinD1 ,注意只有胞核着
色的细胞才是阳性细胞。
左图:晕痣,多数为复合痣,可见色素失禁。
右图:随着痣细胞的调亡,痣细胞越来越难鉴别,而被含色素的 巨噬细胞所取代,残余的痣细胞S-100染色阳性可识别。
Spitz痣
又称Spitz瘤、幼年黑素瘤和梭形上皮痣。 IHC鉴别诊断:与恶性黑素瘤鉴别如下
石蜡切片常规脱蜡和水化
PBS冲洗3次×3min
热修复
封片,镜下观察,保存 水冲洗,苏木素复染,PBS返蓝
3% H2O2,室温10’
镜下观察控制DAB显色
PBS冲洗3次×3min 除去PBS液
PBS冲洗3次×3min 除去PBS液
滴加非免疫性动物血清,室温10’
加链霉-过氧化物酶溶液室温10-30’
嗜碱, b 周边细胞呈栅栏状排列,肿瘤团块与周围基
质间常有裂隙。
基底细胞癌组织类型很多,如结节性、浅表性、 色素性、透明细胞性、印戒细胞性、侵袭性、 硬化性、角化性、多形性、腺样、异型基底细 胞癌、基底鳞状细胞癌、向毛囊分化基底细胞 癌、纤维上皮瘤型、向肌上皮、皮脂腺、大汗 腺、小汗腺分化基底细胞癌。
7、基底膜:IV型胶原 8、皮脂腺:EMA+;CEA-;低分子量CK
(CAM5.2)-;S100-。
人体常见细胞的免疫组化特性
间质细胞
1、纤维母细胞 Vimentin+; Actin-; Desmin-; CK-
2、肌纤维母细胞 Vimentin+; Actin+; Desmin-/+; CK-/+
鉴别诊断:日光性角化病以及与各亚型相似的 各种疾病等。
高分化CK10阳性
低分化CK10阴性
低分化CK8阴性
黑素细胞痣
分型:皮内痣、交界痣和复合痣。 IHC标记:S-100等。 鉴别诊断:恶性黑素瘤HMB-45、Ki-67和
Cyclin D1肿瘤细胞全层阳性表达,而黑素细 胞痣只有表浅的痣细胞表达阳性;恶黑表达 P53蛋白,而痣阴性。
基本原理
近年来,亲和免疫组化技术不断创新,目前为 止拥有标记亲和素-生物素技术(LAB)、桥 亲和素-生物素技术(BAB)、亲和素—生物 素—过氧化物酶复合物法(ABC)以及链霉亲 和素—生物素—过氧化物酶复合物法(SP)等。
1.LAB法
以生物素标记抗体作第一抗体,过氧化物酶标 记亲和素作为第二抗体(见图):
常用标记物
① 荧光素:最常用的是异硫氰酸荧光素 (FITC) —— 荧光显微镜下呈绿色荧光;四 乙基罗达明(RB200)——荧光显微镜下发橙 红色荧光;使用荧光显微镜观察上述荧光标记 物(荧光抗体法)。
② 辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素等:运 用普通光学显微镜观察的标记物。
③ 铁蛋白金等:主要应用于免疫电镜。
亲合细胞化学引入免疫细胞化学后使其敏感性 得到进一步提高,因此更有利于微量抗原(或 抗体)在细胞或亚细胞水平的定位,从而出尽 了免疫组化技术的发展和亲和免疫组化的创立。
亲和素与生物素系统
1、亲和素 是一种碱性糖蛋白,分子量为68000,具 有4个同维生素H亲合力极高的结合点。一般从蛋白清 中提取,故又称卵白素。
CAM5.2-;CEA-;S-100-,HMB-45-。
鉴别诊断:浅表性基癌、光化性角化病、
Bowen病样丘疹病、Paget病等。
鳞状细胞癌
IHC:CK10、EMA、CAM5.2等
多种亚型:透明细胞SCC、梭形细胞SCC、促 结缔组织增生性SCC、棘突松解型SCC、假血 管性SCC、腺性SCC、疣状癌、化生性皮肤癌 (癌肉瘤)等。
人体常见细胞的免疫组化特性
间皮细胞
CK+; CK5/6+; Vimentin+; Calretinin+; HBME1+; N-cadherin+; E-cadherin-; CEA-; BerEP4-; LeuM1-; Desmin -/+ (occasional)
常见皮肤病和性病的IHC标记
BAB法
把两者连接起来先用生物素标记的抗体与细胞/组织内 的抗原反应,洗去未结合的抗体,加入抗生物素孵育 后,洗去未结合的抗生物素,再加入已标记酶的生物 素孵育,洗片以细胞化学方法呈色反应(见图)。
ABC法
(1)ABC复合物的制备:
(2)ABC法反应原理
SP或SAP法
即过氧化物酶标记的链霉卵白素或过氧化物酶 标记的碱性磷酸酶染色。
3、链霉亲和素 是一种从链霉菌培养物中提取的蛋白质, 相对分子量60000,且不含糖链。同亲和素一样,具有 4个生物素结合位点,亲和力高达10-15mol/L,是一种 更完美的生物素结合蛋白。
优点:很少有低聚糖残余成分,可保持中性等电点,避 免了组织中的非特异性染色。
借助此特点建立了亲和素—链霉免疫染色法。
免疫组织化学 在皮肤肿瘤中的应用
吴潞明
免疫组织化学概论 (Immunohistochemistry)
定义:
又称免疫细胞化学。它是组织化学的分 支,为确定某一特定物质在组织内的局 部定位,使用以目的物作为抗原的特异 性抗体进行检测的方法,即免疫组织化 学(简称免疫组化)。
原理
其主要原理是用荧光素、生物素或地高辛 等标记的抗体(或抗原)对细胞或组织内 的相应抗原(或抗体)进行定性、定位或 定量检测,经过组织化学的呈色反应之 后,用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜 观察。
免疫组化的技术分类
免疫组化的方法有直接法和间接法: ➢ 直接法直接标记特异性抗体; ➢ 间接法不直接标记特异性抗体,一般标记
免疫球蛋白,将被标记的免疫球蛋白再结 合到特异性抗体上。 免疫组化技术常用方法按标记物种类可分 为:免疫荧光法、免疫酶法、免疫金属技 术、亲和免疫组化技术以及免疫电镜技术 等。
2、维生素H(以下统称生物素) 是一种小分子的维生 素,与卵白素之间有极强的亲合力,较之抗体对抗原 亲合力要高出100万倍,能彼此牢固结合而不影响彼此 的生物学活性。
注:生物素与卵白素都具有与其它示踪物质如荧光素、 铁蛋白和过氧化物酶等相结合的能力。利用上述特性, 建立了卵白素—生物素免疫染色系统,即亲和素—生 物素免疫染色法。
3、平滑肌 Vimentin+; Actin+; Desmin+; CK-/+
4、树枝状细胞 Vimentin+; CD34+; Actin-/+; Desmin-
人体常见细胞的免疫组化特性
5、内皮细胞:第VIII 因子相关抗原+; CD31+; CD34+; Vimentin+
6、血管周细胞:第VIII 因子相关抗原-; CD31-; Cຫໍສະໝຸດ Baidu34-; vimentin+; Actin+; Desmin-
肿瘤标记:上皮来源肿瘤、间叶来源肿瘤、造 血干细胞来源肿瘤
色素性疾病标记 其他标记:银屑病、扁平苔藓、副银屑病等
常见皮肤肿瘤
表皮肿瘤 黑素细胞痣 恶性黑素瘤 皮肤淋巴增生性疾病及相关肿瘤 皮肤附属器肿瘤 结缔组织肿瘤
表皮肿瘤 ——基底细胞癌
重要病理改变 a 瘤体由基底样细胞组成,核大,浆少,染色
免疫组化在皮肤病理中的应用
凡是组织细胞内具有抗原性的物质,如肽 类、激素、神经递质、细胞因子、受体、 表面抗原、病原体等均可用免疫组织化学 方法显示。
免疫组化在皮肤病理中的作用主要是鉴别 组织类型或细胞来源,在淋巴细胞增生疾 病中,免疫组化可在其克隆方面提供信息, 有助于判断细胞的良恶性来源。
7、脂肪细胞:Vimentin+; S-100+
人体常见细胞的免疫组化特性
8、软骨细胞 Vimentin+; S100+; GFAP+/-
9、骨骼肌 Vimentin+; Actin+/-; Desmin+; Myoglobin+; MyoD1- (仅原始或胚胎肌细 胞+); Myogenin- (仅原始或胚胎肌细胞+); S100-/+ (弱阳性); CD56-/+ (受损肌肉+)
人体常见细胞的免疫组化特性
浆细胞
CD138+; CD45-/+; CD20-; CD79a+/-; Ig+; EMA+/-
NK 细胞
CD45+; 表面CD3-; 胞浆 CD3+; CD43+; CD45RO+; CD56+; CD57+/-; Granzyme B+; TIA1+; Perforin+
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