常见限制酶识别序列
分子生物学实验常用工具酶总结
现代分子生物学实验手册工具酶基因工程：在人工可以控制条件下，将基因剪切或重新组合，再导入另一生物体内，使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。
核心：对基因进行人工切割、连接和重新组合，构建重组DNA。
工具酶：在基因工程的重组DNA过程中，所需要用到的酶的统称。
一、限制性内切酶（restriction endonuclease）主要功能：对外源性的双链DNA进行切割、水解，不允许外源性DNA存在于细菌自身细胞内。
（这种酶能对在自身细胞内存在的DNA种类给予限制——限制性内切酶）限制-修饰系统：合成限制性内切酶的细胞，其自身的DNA不受酶的切割，这是因为细菌细胞还会合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变DNA 原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解。
保护自身遗传物质稳定的机制。
限制性内切酶：从原核生物中发现的，约600种，可识别108种不同的特定DNA顺序。
以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生DNA片段的5’端为P，3’端为- OH。
命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写）+该菌种名的前两个字母(小写)+株系的字母（小写）或数字+罗马数字（同一株菌种不同内切酶的编号）例：细菌属名细菌种名菌株名称限制酶名称Arthrobacter luteus Alu I Escherichia coli RY13Eco R IH Ham H IBacillus amyloliquefaciensHaemophilus influenzae Rd Hin d III（一）三种常用内切酶1. I型限制性内切酶同时兼有切割DNA的功能和修饰酶的修饰功能。
在酶的识别位点上，若DNA两条链菌没有发生甲基化，则行使内切酶的功能，对DNA进行切割，同时转变成ATP酶。
若DNA双链中有一条链已发生甲基化，则此类酶显示修饰酶的作用，对另一条DNA进行甲基化修饰，然后在行切割功能。
限制性核酸内切酶
生理意义
限制作用实际就是限制酶降解外源DNA ，维护宿主遗传稳定的保护 机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受 到保护。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目 的。所以，能产生防御病毒侵染的限制酶的细菌，其自身的基因组中 可能有该酶识别的序列，只是该识别序列或酶切位点被甲基化了。但 并不是说一旦甲基化了，所有限制酶都不能切割。大多数限制酶对 DNA甲基化敏感，因此当限制酶目标序列与甲基化位点重叠时，对酶 切的影响有3种可能，即不影响、部分影响、完全阻止。对甲基化 DNA的切割能力是限制酶内在和不可预测的特性，因此，为有效的切 割DNA，必须同时考虑DNA甲基化和限制酶对该类型甲基化的敏感 性。另外，现在很多商业限制酶专门用于切割甲基化DNA。
E
Escherichia
(属)
co
coli
(种)
R
RY13
(品系)
I
的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限 制酶分为三种类型，分别是第一型(Type I)、第二型(Type Ⅱ) 及第三型(Type Ⅲ)。
类型
第一型限制酶 同时具有修饰(modification)及识别切割(restriction)的作用;另有识别 (recognize)DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离 识别位(recognition site)可达数千个碱基之远。例如:EcoB、EcoK。
第二型限制酶 只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行。所识别的位置多为短的回文 序列(palindrome sequence);所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列。是遗 传工程上，实用性较高的限制酶种类。例如:EcoRI、HindⅢ。
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶：是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
限制性核酸内切酶的分类：依照限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，别离是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。
第一型限制酶同时具有修饰(modification)及认知切割(restriction)的作用；还有认知(recognize)DNA 上特定碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离认知位(recognition site)可达数千个碱基之远,并非能准确信位切割位点，因此并非经常使用。
例如：EcoB、EcoK。
第二型限制酶只具有认知切割的作用，修饰作用由其他酵素进行。
所认知的位置多为短的回文序列(palindrome sequence)；所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。
是遗传工程上，有效性较高的限制酶种类。
例如：EcoRI、HindIII。
第三型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。
可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对，并非能准确信位切割位点，因此并非经常使用。
例如：EcoPI、HinfIII。
限制酶在遗传学方面的应用：1、在甚因工程方面利用能产生“粘性结尾”的限制酶, 进行DNA的体外重组, 是较为方便的, 只要用同一限制酶处置不同来源的DNA, 由于所产生的水解片段具有相同的粘性结尾, 能够彼此“粘合”,再经连接酶处置, 就成为重组DNA分子了. 目前, 基因工程上, 限制酶要紧应用于以下两方面（1）目的基因与载体的重组细菌细胞中的限制酶能水解外源DNA , 因此必需通过适当的载体(质粒或噬菌体)的帮忙才能将外源DNA引人受体细胞并在其中增殖和表达。
将供体DNA与载体用一样的限制酶处置, 使载体带上各类各样的外源DNA片断, 然后引人受体细菌细胞增殖, 菌细胞增殖, 再挑选出所需的菌株, 便取得带有某一目的基因的繁衍系.用这种方式, 已成功地将酵母菌的咪哇甘油磷酸脱水酶基因、夕一异丙基苹果酸脱氢酶基因和色氨酸合成酶基因通过几噬菌体转人大肠杆菌,并表达了信息.（2）建造新的基因载体作为基因载体,在引人受体细胞后, 必需有较高的复制率, 以求取得大量的基因产物；必需具有一个选择性标志, 以便挑选；还要有一最多种限制酶的作用位点（每种酶只有一个切口）；也要求利用平安。
常见限制酶识别序列
ApaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5'GGGCC^C 3'BamHI（类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' G^GATCC 3'BglII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' A^GATCT 3'EcoRI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' G^AATTC 3'HindIII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' A^AGCTT 3'KpnI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' GGTAC^C 3'NcoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' C^CATGG 3'NdeI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' CA^TATG 3'NheI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' G^CTAGC 3'NotI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' GC^GGCCGC 3'SacI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' GAGCT^C 3'SalI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' G^TCGAC 3'SphI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' GCATG^C 3'XbaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' T^CTAGA 3'XhoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' C^TCGAG 3'。
高中生物基因工程如何选取限制酶专题练 (含答案)
2024届高三生物提分攻略：如何选取限制酶选择限制酶时需要考虑哪些因素？①为了防止目的基因、载体自身环化和及2者的反向连接，尽量选择双酶切法，选择2种限制酶。
②酶切位点位于目的基因两侧，不能破坏目的基因；③不能破坏启动子、终止子、复制起原点。
④通常选择含有目的基因的DNA片段和载体上共有的酶切位点，或者能产生相同黏性末端的限制酶；⑤若载体上有2个及以上的标记基因，为了便于筛选，通常需要破坏一个标记基因；若载体上只有1个标记基因，不破坏这个标记基因。
⑥考虑转录的方向，需要将目的基因插入载体的启动子和终止子之间，且考虑到目的基因插入后能正常转录出正确的RNA。
1、构建重组质粒时可选用四种限制酶，其识别序列如下图。
为防止酶切片段的自身环接，不可选用的限制酶组合是（）A.①③B.②③C.①④D.③④2、若要利用某目的基因（见图甲）和P1噬菌体载体（见图乙）构建重组DNA（见图丙），限制性内切核酸酶的酶切位点分别是BglⅡ（－A↓GATCT－），EcoRⅠ（－G↓AATTC－）和Sau3AⅠ（－↓GATC－）。
下列分析合理的是（）A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体B．用BglⅡ和EcoRI切割目的基因和P1噬菌体载体C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体3、获得相关基因后，利用PCR技术进行融合得到目的基因，可选择与乳腺细胞表达载体pBC1构建重组DNA 分子。
目的基因、表达载体pBCl如图乙所示。
①PCR扩增图示目的基因时需加入种引物和酶。
②本实验应选择限制酶切割目的基因与pBCl载体，将酶切产物正确连接后形成重组DNA分子，以便后续通过荧光检测筛选。
4、人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的前胰岛素原，经加工后形成具有两条肽链（A链和B链）的有生物活性的胰岛素。
此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：“AB”法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；“BCA”法是利用人体某细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
限制酶识别序列
二轮小专题限制酶识别序列一．回文诗：静思伊久阻归期，久阻归期忆别离；忆别离时闻漏转，时闻漏转静思伊。
赏花归去马如飞，去马如飞酒力微。
酒力微醒时已暮，醒时已暮赏花归。
二．DNA回文序列限制性内切酶Ⅱ类酶有EcoR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ等。
其分子量小于105道尔顿；反应只需Mg2+；最重要的是在所识别的特定碱基顺序上有特异性的切点，因而DNA分子经过Ⅱ类酶作用后，可产生特异性的酶解片断，这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。
限制性内切酶识别DNA序列中的回文序列。
有些酶的切割位点在回文的一侧（如EcoR I、BamH I、Hind等），因而可形成粘性末端，另一些Ⅱ类酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal Ⅲ、HPa I、Sma I等，切割位点在回文序列中间，形成平整末端。
Alu I的切割位点如下：5'-A G^C T-3'3'-T C^G A-5'酶类型识别序列ApaI Type II restriction enzyme 5'GGGCC^C 3' BamHI Type II restriction enzyme 5' G^GATCC 3' BglII Type II restriction enzyme 5' A^GATCT 3' EcoRI Type II restriction enzyme 5' G^AATTC 3' HindIII Type II restriction enzyme 5' A^AGCTT 3' KpnI Type II restriction enzyme 5' GGTAC^C 3' NcoI Type II restriction enzyme 5' C^CATGG 3' NdeI Type II restriction enzyme 5' CA^TATG 3' NheI Type II restriction enzyme 5' G^CTAGC 3' NotI Type II restriction enzyme 5' GC^GGCCGC 3' SacI Type II restriction enzyme 5' GAGCT^C 3' SalI Type II restriction enzyme 5' G^TCGAC 3' SphI Type II restriction enzyme 5' GCATG^C 3' XbaI Type II restriction enzyme 5' T^CTAGA 3' XhoI Type II restriction enzyme 5' C^TCGAG 3'。
酶切位点识别序列
酶切位点识别序列 Document serial number【KKGB-LBS98YT-BS8CB-BSUT-BST108】
酶切位点（Restriction Enzyme cutting site）：DNA上一段碱基的特定序列，能够识别出这个序列并在此将序列切成两段。
可能存在同尾酶，不同酶的识别序列不同，
有的可能能识别多个酶切位点比如STY1识别序列有WW
PCR引物设计时酶切位点的保护碱基表
不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求（在本表中没有列出的
注释
1.如果要加在序列的5’端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的
碱基（黑色），如果要在序列的3’端加上保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。
2.切割率：正确识别并切割的效率。
3.加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。
基因工程的原理与应用例题和知识点总结
基因工程的原理与应用例题和知识点总结基因工程，这个听起来充满科技感的词汇，其实已经在我们的生活中发挥着越来越重要的作用。
它就像是一把神奇的钥匙，打开了生命奥秘的大门，让我们有能力对生物的基因进行改造和重组，从而实现各种奇妙的目标。
接下来，让我们一起深入了解基因工程的原理，并通过一些例题来巩固知识，同时总结其广泛的应用。
一、基因工程的原理基因工程，简单来说，就是在分子水平上对基因进行操作的技术。
它基于几个关键的原理：首先是“中心法则”。
我们知道，遗传信息从 DNA 传递到 RNA，再从 RNA 翻译成蛋白质，这是生命遗传信息传递的基本规律。
基因工程就是要在这个过程中进行干预。
其次，基因是具有特定碱基序列的 DNA 片段。
通过特定的工具，我们能够识别、切割和连接这些片段。
再者，不同生物的基因具有相同的化学本质，这意味着我们可以将一种生物的基因转移到另一种生物中，并使其发挥作用。
而实现基因工程操作的关键工具包括限制酶、DNA 连接酶和载体。
限制酶能够识别特定的碱基序列，并在特定的位点切割 DNA 分子；DNA 连接酶则负责将切割后的 DNA 片段连接起来；载体，如质粒、噬菌体等，能够将目的基因运送到受体细胞中。
二、基因工程的例题为了更好地理解基因工程的原理，让我们来看几个例题。
例 1：假设我们要从一种细菌中获取一个具有抗药性的基因，并将其转移到一种植物细胞中，使其获得抗药性。
首先，我们需要使用特定的限制酶来切割含有抗药基因的细菌 DNA 和植物细胞的 DNA。
然后，用 DNA 连接酶将抗药基因与植物细胞的 DNA 连接起来。
最后，通过适当的方法将重组后的 DNA 导入植物细胞。
例 2：给定一段 DNA 序列，要求找出可能的限制酶切割位点。
这就需要我们熟悉常见限制酶的识别序列，并运用相关知识进行分析。
三、基因工程的应用基因工程的应用范围极其广泛，给人类带来了诸多的好处。
在农业领域，基因工程使得我们能够培育出具有优良性状的农作物。
限制性内切酶小知识
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简介
限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease):识别并切割 特异的双链DNA序列的一种内 切核酸酶。 [别名] Endodeoxyribonuclease [酶反应] 限制性内切酶能分 裂DNA分子在一限定数目的专 一部位上。它能识别外源DNA 并将其降解。 [单位定义] 在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中， 1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。
特征和种类
1．限制与修饰现象 早在 50 年代初，有许多学者发现了限制与修饰现象，当时称作寄主 控制的专一性（host controlled specificity）。 l 噬菌体表现的现 象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题 （表 2-1）。 l 在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。 E.coli 菌株 λ噬菌体感染率 lK lB lC E.coli K 1 10-4 10-4 E.coli B 10-4 1 10-4 E.coli C 1 1 1 说明 K 和 B 菌株中存在一种限制系统，可排除外来的 DNA 。 104 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。 而在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用实际就是限 制酶降解外源 DNA ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的 修饰作用，可使腺嘌呤 A 成为 N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶 C 成为 5' 甲 基胞嘧啶。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目 的。
3．限制酶切割的位置 限制酶对 DNA 的切割位置大多数在内部，但也有在外部的。在外部的， 又有两端、两侧和单侧之别。切点在两端的有 Sau3AⅠ（↓GATC）、 NlaⅢ（CATG↓）和 EcoRⅡ（↓CCWGG） 等；在两侧的有 BcgⅠ[（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）]和 TspRⅠ （CASTGNN↓）， BcgⅠ 酶的切割特性与其它酶不同，它们在识别位点 的两端各切开一个断点，而不是只产生一个断点。切点在识别位点外侧的还 有 BbvⅠ[GCAGC（8/12）] 和 BspMⅠ[ACCTGC（4/8）] 等。 BcgⅠ ↓10（N）CGA（N）6TGC（N）12↓； ↑12（N）CGA（N）6ACG（N）10↑ TspRⅠ NNCAC（G）TGNN↓ ↑NNGTG（C）ACNN
常见限制性内切酶识别序列
常见限制性内切酶识别序列(酶切位点)（BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等）Time：2009-10-22 PM 15:38Author:bioer Hits: 7681 times在分子克隆实验中，限制性内切酶是必不可少的工具酶。
无论是构建克隆载体还是表达载体，要根据载体选择合适的内切酶（当然，使用T 载就不必考虑了）。
先将引物设计好，然后添加酶切识别序列到引物5' 端。
常用的内切酶比如BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等可能你都已经记住了它们的识别序列，不过为了保险起见，还是得查证一下。
下面是一些常用的II型内切酶的识别序列，仅供参考。
先介绍一下什么是II型内切酶吧。
The Type II restriction systems typically contain individual restriction enzymes and modification enzymes encoded by separate genes. The Type II restriction enzymes typically recognize specific DNA sequences and cleave at constant positions at or close to that sequence to produce 5-phosphates and 3-hydroxyls. Usually they require Mg 2+ ions as a cofactor, although some have more exotic requirements. The methyltransferases usually recognize the same sequence although some are more promiscuous. Three types of DNA methyltransferases have been found as part of Type II R-M systems forming either C5-methylcytosine, N4-methylcytosine or N6-methyladenine.酶类型识别序列ApaIType II restrictionenzyme5'GGGCC^C 3'BamHIType II restrictionenzyme5' G^GATCC 3'BglIIType II restrictionenzyme5' A^GATCT 3'EcoRIType II restrictionenzyme5' G^AATTC 3'HindIIIType II restrictionenzyme5' A^AGCTT 3'KpnIType II restrictionenzyme5' GGTAC^C 3'NcoIType II restrictionenzyme5' C^CATGG 3'NdeIType II restrictionenzyme5' CA^TATG 3'NheIType II restrictionenzyme5' G^CTAGC 3'NotIType II restrictionenzyme5' GC^GGCCGC 3'SacIType II restrictionenzyme5' GAGCT^C 3'SalIType II restrictionenzyme5' G^TCGAC 3'SphIType II restrictionenzyme5' GCATG^C 3'XbaIType II restrictionenzyme5' T^CTAGA 3'XhoIType II restrictionenzyme5' C^TCGAG 3'要查找更多内切酶的识别序列，你还可以选择下面几种方法：1. 查你所使用的内切酶的公司的目录或者网站；2. 用软件如：Primer Premier5.0或Bioedit等，这些软件均提供了内切酶识别序列的信息；3. 推荐到NEB的REBASE数据库去查（网址：/rebase/rebase.html）当你设计好引物，添加上了内切酶识别序列，下一步或许是添加保护碱基了，可以参考：NEB公司网站提供的关于设计PCR引物保护碱基参考表下载（也可见图片）双酶切buffer的选择（MBI、罗氏、NEB、Promega、Takara）再给大家推荐一种新的不需要连接反应的分子克隆方法，优点包括：①设计引物不必考虑选择什么酶切位点；②不必考虑保护碱基的问题；③不必每次都选择合适的酶来酶切质粒制备载体；④而且不需要DNA连接酶；⑤假阳性几率低（因为没有连接反应这一步，载体自连的问题没有了）。
酶切用的酶
酶切用的酶简介酶切是分子生物学研究中常用的一种技术手段，用于切割DNA分子。
酶切用的酶是一类特殊的酶，能够识别特定的DNA序列并将其切割成特定的片段。
在基因工程、DNA测序和DNA重组等领域，酶切用的酶发挥着重要的作用。
酶切原理酶切用的酶主要是一类特殊的内切酶，也叫限制性内切酶（Restriction Enzyme）。
它们能够识别DNA分子中的特定核酸序列（酶切位点），并在该位点上进行切割。
酶切位点通常是一个对称的序列，例如5’-GAATTC-3’。
酶切用的酶能够识别并切割这样的序列，产生两个粘性末端或平滑末端的DNA片段。
酶切用的酶具有高度的特异性，即只能识别特定的酶切位点。
它们通过与DNA分子中的特定序列进行互补配对，形成酶-底物复合物，然后在酶切位点上切割DNA链。
酶切用的酶的分类根据酶切位点的序列特征，酶切用的酶可以分为不同的类别。
常见的酶切用的酶包括：1.限制性内切酶I类（Type I）：这类酶切用的酶切割DNA时具有两个酶切位点，但切割位点与识别位点并不重合。
它们通常在识别序列附近的随机位置进行切割，产生不规则的切口。
2.限制性内切酶II类（Type II）：这是最常用的一类酶切用的酶。
它们能够直接在识别位点进行精确的切割，产生具有平滑末端或粘性末端的DNA片段。
常见的II类酶切用的酶有EcoRI、HindIII等。
3.限制性内切酶III类（Type III）：这类酶切用的酶切割DNA时具有两个酶切位点，与Type I类酶相似。
它们也将切割位点与识别位点分开，产生不规则的切口。
与Type I类酶不同的是，Type III类酶需要与其他辅助蛋白一起作用才能发挥酶切功能。
4.限制性内切酶IV类（Type IV）：这类酶切用的酶不常见，它们不在识别位点进行切割，而是在较远的位置附近进行切割。
5.限制性内切酶V类（Type V）：这类酶切用的酶是一类泛素修饰酶（Methylase）。
它们不能直接切割DNA链，而是在酶切位点上对DNA进行甲基化修饰。
1978诺贝尔——限制酶
1978年诺贝尔生理学或医学奖得主
阿尔伯(Werner Arber 1929～)瑞士生物 学家，史密斯(Hamilton O．Smith 1931～) 美国微生物学家，内森斯(Daniel Nathans 1928～1999)美国微生物学家，由于限制性 核酸内切酶的发现及其在分子遗传学中的 应用，为遗传工程的产生拉开了序幕而获 得1978年诺贝尔生理学或医学奖。
• Arber discovered restriction enzymes. He postulated that these enzymes bind to DNA at specific sites containing recurring structural elements made up of specific basepair sequences. • Smith verified Arber's hypothesis with a purified bacterial restriction enzyme and showed that this enzyme cuts DNA in the middle of a specific symmetrical sequence. Other restriction enzymes have similar properties, but different enzymes recognize different sequences.
限制酶识别的序列
1．限制酶识别序列的长度 限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基。当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每 256 个和 4096 个碱 基中会出现一个识别位点（44=256，46=4096）。以下是几个有代表性的种类，箭头指切 割位置。 4 个碱基识别位点：Sau3AⅠ ↓GATC 5 个碱基识别位点：EcoRⅡ ↓CCWGG NciⅠ CC↓SGG 6 个碱基识别位点：EcoRⅠ G↓AATTC HindⅢ A↓AGCTT 7 个碱基识别位点：BbvCⅠ CC↓TCAGC PpuMⅠ RG↓GWCCY 8 个碱基识别位点：NotⅠ GC↓GGCCGC SfiⅠ GGCCNNNN↓NGGCC 以上序列中部分字母代表的碱基如下： R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 C K=G 或 T S=C 或 G W=A 或 T H=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=A 或 C 或 G D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T
常用限制性内切酶酶切位点保护残基
酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶发布: 2010-05-24 20:19| 来源:生物吧| 编辑:刘浩| 查看: 161 次本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。
限制性酶识别序列
限制性酶的识别序列Enzyme Name SequenceAatI AGGCCTAatII GACGTCAccI GTMKACAccII CGCGAccIII TCCGGAAcyI GRCGYCAflI GGWCCAflII CTTAAGAflIII ACRYGTAhaI CCSGGAhaII GRCGYCAhaIII TTTAAAAluI AGCTAlwI GGATCNNNNAlwI NNNNNGATCCAlwNI CAGNNNCTGAocI CCTNAGGAocII GDGCHCAosI TGCGCAAosII GRCGYCApaI GGGCCC ApaLI GTGCAC ApyI CCWGG AquI CYCGRG AseI ATTAATAspI GAANNNNTTC AspI GGTACCAspI GACNNNGTC AsuI GGNCC AsuII TTCGAA AvaI CYCGRG AvaII GGWCC AvaIII ATGCATAvrI CYCGRG AvrII CCTAGGAxyI CCTNAGG BalI TGGCCA BamHI GGATCC BanI GGYRCC BanII GRGCYC BanIII ATCGATBbeI GGCGCCBbiII/AcyI GRCGYCBbvI GCAGCNNNNNNNNBbvI NNNNNNNNNNNNGCTGC BbvII GAAGACNNBbvII NNNNNNGTCTTCBcefI ACGGCNNNNNNNNNNNN BcefI NNNNNNNNNNNNNGCCGT BclI TGATCABcnI CCSGGBglI GCCNNNNNGGCBglII AGATCTBinI NNNNNGATCCBinI GGATCNNNNBsePI GCGCGCBsmAI GTCTCBsmAI GAGACBsmI GAATGCNBsmI GCATTCBspI GDGCHCBspHI TCATGABspMI ACCTGCNNNNBspMI NNNNNNNNGCAGGTBspMII TCCGGABsrI ACTGGNBsrI CCAGTBssHII GCGCGCBstBI TTCGAABstEII GGTNACCBstI GGATCCBstNI CCWGGBstPI GGTNACCBstUI CGCGBstXI CCANNNNNNTGG BstYI RGATCYBsuI CCTNAGGCcrI CTCGAGCfoI GCGCCfrI RCCGGYCfrI GGNCCCfrI YGGCCRClaI ATCGATCviJI RGCYCvnI CCTNAGGDdeI CTNAGDpnI GATCDraI TTTAAADraII RGGNCCYDraIII CACNNNGTG DsaI CCRYGGEaeI YGGCCREagI CGGCCGEarI CTCTTCEarI GAAGAGEclXI CGGCCGEcoI TACGTAEcoI GGTCTCNEcoI NNNNNGAGACC EcoI GGWCCEcoIII AGCGCTEcoI CGGCCGEcoI CTGAAGEcoI CTTCAGEcoI CCTNAGGEcoNI CCTNNNNNAGG EcoOI RGGNCCYEcoRI GAATTCEcoRII CCWGGEcoRV GATATCEcoTI CCWWGGEcoTI ATGCATEcoTI GRGCYCEheI GGCGCCEspI GCTNAGCFinI GTCCCFinI GGGACFnuHI GCNGCFokI GGATGNNNNNNNNNFokI NNNNNNNNNNNNNCATCC FspI TGCGCAGdiII NNNNNYGGCCGGdiII CGGCCRNGsuI CTCCAGGsuI CTGGAGHaeI WGGCCWHaeII RGCGCYHaeIII GGCCHapII CCGGHgaI GACGCNNNNNHgaI NNNNNNNNNNGCGTC HgiAI GWGCWCHgiEII ACCNNNNNNGGT HhaI GCGCHinI GRCGYCHinPI GCGCHincII GTYRACHindIII AAGCTTHinfI GANTCHpaI GTTAACHpaII CCGGHphI GGTGANNNNNNNN HphI NNNNNNNTCACC KpnI GGTACCKspI CTCTTCNKspI NNNNGAAGAGMaeI CTAGMaeII ACGTMaeIII GTNACMboI GATCMboII GAAGANNNNNNNN MboII NNNNNNNTCTTCMfeI CAATTGMflI RGATCYMluI ACGCGTMmeI TCCRACMmeI GTYGGAMnlI CCTCNNNNNNN MnlI NNNNNNNGAGG MroI TCCGGAMseI TTAAMspI CCGGMstI TGCGCAMstII CCTNAGGMvaI CCWGGNaeI GCCGGCNarI GGCGCCNciI CCSGGNcoI CCATGGNdeI CATATGNdeII GATCNheI GCTAGCNlaIII CATGNlaIV GGNNCCNruI TCGCGANsiI ATGCATNsp()I RCATGYNsp()V TTCGAANspBII CMGCKGNspII GDGCHCNspIII CYCGRGNspIV GGNCCNunII GGCGCCPaeR CTCGAGPalI GGCCPflMI CCANNNNNTGG PleI GAGTCNNNN PleI NNNNNGACTC PmaCI CACGTG PpuMI RGGWCCY PstI CTGCAGPvuI CGATCGPvuII CAGCTGRsaI GTACRsrI GAATTCSacI GAGCTCSacII CCGCGGSalI GTCGACSauAI GATCSauI GGNCCSauI CCTNAGGScaI AGTACTScrFI CCNGGSduI GDGCHCSecI CCNNGGSexI CTCGAGSfaNI GCATCNNNNN SfaNI NNNNNNNNNGATGC SfiI GGCCNNNNNGGCC SinI GGWCCSmaI CCCGGGSnaBI TACGTASnaI GTATACSpeI ACTAGTSphI GCATGCSplI CGTACGSspI AATATTSstI GAGCTCSstII CCGCGGSstIII ACGTStuI AGGCCTStyI CCWWGGStySJI GAGNNNNNNGTRC StySJI GYACNNNNNNCTCTaqI TCGATaqII GACCGANNNNNNNNNNN TaqII NNNNNNNNNTCGGTC TaqII CACCCANNNNNNNNNNN TaqII NNNNNNNNNTGGGTG ThaI CGCGTspI GTSACTspEI AATTTthI GACNNNGTCTthII CAARCANNNNNNNNNNN TthII NNNNNNNNNTGYTTG TthHBI TCGAVspI ATTAATXbaI TCTAGAXcyI CCCGGGXhoI CTCGAGXhoII RGATCYXmaI CCCGGG XmaIII CGGCCGXmnI GAANNNNTTC XorII CGATCG。
基因工程中常用的酶
分类与用途
分类
根据识别序列的长度和切割位点的特性，限制性内切核酸酶 可分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型限制性内切核酸酶识别位点较长， 切割位点不规则；Ⅱ型限制性内切核酸酶识别位点较短，切 割位点规则。
用途
限制性内切核酸酶在基因工程中主要用于DNA的克隆、基因 的定位、突变分析等方面。通过限制性内切核酸酶的切割， 可以将DNA片段分离出来，再进行后续的克隆和转化等操作 。
生物制药
在生物制药中，使用DNA 连接酶将药物基因或疫苗 基因插入到载体中，制备 基因药物或基因疫苗。
03
聚合酶
定义与特性
聚合酶
是一种能够催化DNA复制和修复的酶， 通过聚合核苷酸片段，合成新的DNA 链。
特性
聚合酶具有专一性、高效性和耐受性 等特性，能够在特定的模板指导下， 高效地合成DNA链。
分类与用途
分类
根据来源不同，反转录酶可分为天然反转录酶和重组反转录酶。
用途
在基因工程中，反转录酶主要用于将RNA转录为cDNA，以便进行基因克隆、表达和功能研究。
反转录酶的应用案例
基因克隆
通过反转录酶将mRNA转化为 cDNA，再利用限制性内切酶将其 切割成适当大小的片段，进行基 因克隆和测序。
基因工程中常用的酶
• 限制性内切核酸酶 • DNA连接酶 • 聚合酶 • 反转录酶 • 其他常用酶类
01
限制性内切核酸酶
定义与特性
定义
限制性内切核酸酶是一类能够识 别并切割DNA特定序列的酶，是 基因工程中常用的工具酶之一。
特性
限制性内切核酸酶具有高度的特 异性，能够识别并切割DNA中的 特异序列，切割位点通常是DNA 双链中的特定位点。
限制性内切核酸酶的应用案例
酶切位点识别序列
酶切位点识别序列 Last revised by LE LE in 2021
酶切位点（Restriction Enzyme cutting site）：DNA上一段碱基的特定序列，能够识别出这个序列并在此将序列切成两段。
可能存在同尾酶，不同酶的识别序列不同，
有的可能能识别多个酶切位点比如STY1识别序列有WW
PCR引物设计时酶切位点的保护碱基表
不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求（在本表中没有列出的
注释
1.如果要加在序列的5’端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的
碱基（黑色），如果要在序列的3’端加上保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。
2.切割率：正确识别并切割的效率。
3.加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。
限制酶bamhi识别序列
限制酶bamhi识别序列全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：BamHI酶是最常用的限制酶之一，在分子生物学领域被广泛应用于DNA分子的切割和连接。
BamHI酶的识别序列为5'-GGATCC-3'，具有非常高的识别特异性和切割效率。
在实验室中，研究人员常常需要使用BamHI酶来对DNA分子进行特定的切割，以便进行进一步的实验操作。
BamHI酶的识别序列非常短，只有6个碱基对，但却能够在DNA 分子中非常准确地识别并切割特定的DNA序列。
这种高度特异性的作用是由于BamHI酶的结构和活性机制所决定的。
BamHI酶是一种双链DNA切割酶，它可以同时切割DNA分子的两条链，形成具有“突出末端”的DNA断裂。
这种特殊的切割方式使得BamHI酶可以在切割后方便地用于DNA连接实验。
BamHI酶的识别序列为5'-GGATCC-3'，其中GGATCC是酶的具体识别部位。
在DNA序列中，只有当该识别序列被BamHI酶完全识别时，酶才能够进行切割作用。
由于BamHI酶对识别序列的要求非常严格，即使是一个碱基对的差错也会导致酶无法进行切割。
在实验操作中，研究人员需要非常小心地设计和检查DNA序列，确保BamHI 酶能够准确识别和切割目标序列。
除了识别序列的准确性外，BamHI酶的切割效率也是研究人员需要考虑的重要因素之一。
在实验操作中，一般情况下会根据需要调节BamHI酶的酶活性和反应条件，以确保DNA分子能够被完全切割。
由于BamHI酶的酶活性受到许多因素的影响，如酶的来源、纯度和保存状态等，研究人员在实验操作中需要仔细控制这些因素，以确保实验结果的准确性和可靠性。
第二篇示例：限制酶（Restriction Enzyme）是一种能够识别和切割DNA特定序列的酶类，广泛应用于分子生物学和基因工程领域。
BamHI是一种常用的限制酶，它具有识别并切割GGATCC序列的能力。
本文将主要讨论BamHI限制酶的特点及其在科研实验中的应用。
新课标高中生物人教版选择性必修123册生物世界〖限制酶简介〗
限制酶简介限制酶是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列的DNA水解酶。
最初，限制酶是从微生物中分离纯化得到的，而现在基本都采用基因重组的方法进行生产。
202160年代，阿尔伯（W Arber）等人在研究λ噬菌体侵染大肠杆菌的机制时，发现简称λK）和简称λB），可以高效感染它们各自的大肠杆菌宿主菌株，但是当用λK感染B菌株或用λB感染K菌株时，其感染效率大大下降，这说明λK受到了B菌株的限制，λB则受到了K 菌株的限制，这一现象称作限制。
科学家还发现，当用λK感染B菌株时，即便感染效率很低，也仍然有极少数的λK感染成功，如果用B菌株繁殖出来的λK再次感染B菌株，这时λK可以像λB一样高效感染B菌株，而不会出现上述限制现象，这种现象称作修饰。
宿主细胞的限制和修饰作用广泛存在于细菌中。
通过进一步研究，科学家弄清了细菌限制和修饰作用的分子机制。
大肠杆菌K菌株和B 菌株拥有不同的限制和修饰系统，它们受hd R、hd M和hd S基因的调控。
hd R编码产生限制酶，它能识别双链DNA分子上特定的核苷酸序列并将双链DNA分子切断；hd M编码产生DNA甲基化酶，它催化DNA分子特定位点上的碱基的甲基化反应；hd S编码的产物能协助限制酶和DNA甲基化酶识别作用位点。
大肠杆菌细胞内的DNA甲基化酶封闭了其自身DNA 上能被自身所产生的限制酶识别的位点。
λK和λB长期寄生在宿主细胞中，宿主细胞中的DNA 甲基化酶也封闭了其DNA上能被宿主细胞所产生的限制酶识别的位点，所以大肠杆菌的限制酶不会降解自身的DNA以及长期在它体内生存的噬菌体的DNA。
外来的DNA入侵时，宿主细胞中的限制酶会将其降解，但是这种降解作用并不完全，总有少数入侵的DNA能在宿主细胞中复制，并在复制过程中被宿主的DNA甲基化酶所修饰，这就是为什么B菌株繁殖出来的λK可以高效感染B菌株的原因。
根据结构和功能的差异，限制酶可以分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。
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ApaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5'GGGCC^C 3'
BamHI（类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' G^GATCC 3'
BglII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' A^GATCT 3'
EcoRI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' G^AATTC 3'
HindIII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' A^AGCTT 3'
KpnI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' GGTAC^C 3'
NcoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' C^CATGG 3'
NdeI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' CA^TATG 3'
NheI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' G^CTAGC 3'
NotI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' GC^GGCCGC 3'
SacI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' GAGCT^C 3'
SalI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' G^TCGAC 3'
SphI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' GCATG^C 3'
XbaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' T^CTAGA 3'
XhoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' C^TCGAG 3'。