小鼠睾丸支持细胞体外培养特性

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小鼠睾丸支持细胞体外培养特性

生物工程学报Chin J Biotech2009, May 25; 25(5): 745-753 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061cjb@© 2009 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved小鼠睾丸支持细胞体外培养特性师冰洋1, 张淑香1, 郭美锦1, 王永红1, 张嗣良1, 史小林21 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室, 上海 2002372 首都医科大学生殖医学中心, 北京 100069摘要:支持细胞是睾丸的重要组成部分, 其主要功能是为生精细胞提供适宜的生长环境。

从幼鼠睾丸中分离得到支持细胞, 并通过苏木精-伊红和Fas-L免疫组化染色对分离得到的细胞进行了鉴定。

通过对原代小鼠睾丸支持细胞的贴壁、生长和培养液中葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸等营养底物及其副产物乳酸、铵根离子等的代谢以及培养液渗透压和pH的研究, 发现支持细胞的贴壁时间主要集中在接种后2~4 h; 当培养液中氨根离子浓度高于 2.3 mmol/L, 渗透压高于326 mosm/kg, pH≤6.8时支持细胞生长进入衰亡期; 在氨基酸代谢方面, 发现培养过程中丙氨酸和谷氨酸浓度迅速增加,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸浓度略有降低, 丝氨酸、精氨酸和甘氨酸浓度基本保持不变。

因此培养液中铵根离子浓度的过量积累、渗透压和pH的异常和贴壁面积不足是限制支持细胞静态生长的主要因素。

研究结果为支持细胞大规模培养及工艺优化奠定了基础。

关键词:支持细胞, 分离与鉴定, 体外培养, 代谢特性Metabolic characterization of rat sertoli cell in vitro cultureBingyang Shi1, Shuxiang Zhang1, Meijin Guo1, Yonghong Wang1, Siliang Zhang1, and Xiaolin Shi21 State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China2 Reproductive Medical Center of Capital Medical University, Beijing 100069, ChinaAbstract: Sertoli cell (SC) is intrinsic to the testis and provides an appropriate growth environment for the germ cells. It was separated from rat’s testis and identified by hematoxylin and eosin staining(HE) and immunocytochemical reaction, then cultivated invitro. Culture conditions such as pH, osmotic pressure and metabolic parameters that include consumption rates of glucose, glutamine,amino acids and formation rates of lactic acid, ammonium ion were investigated. It was showed that adhesion process of SCs was accomplished within 2−4 hours after inoculation. It was also observed that the SCs entered into the decline phase when the concentration of ammonium ion and lactic acid were above 2.3 mmol/L and 14 mmol/L, respectively, which caused osmotic pressureabove 326 mosm/kg and pH below 6.8 in the medium. As the changes of amino acids during culture were concerned, Glu and Ala accumulated rapidly, while Val, Leu, Ile reduced slightly and at the same time Ser, Arg, and Gly were stable. The restrict factors forSCs grown in static culture might be high osmotic pressure and low pH, which were generated when glutamine and glucose were metabolized into lactic acid. The findings could be fundamental in the process optimization of large scale Sertoli cells in vitro culture.Received:December 9, 2008; Accepted:February 19, 2009Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA02Z216), ShanghaiBiotechnology Industrialized Platform (No. 07DZ22914), National Special Fund for State Key Laboratory of Bioreactor Engineering (No. 2060204). Corresponding author: Shuxiang Zhang. E-mail: zhangsx1976@Meijing Guo. E-mail: guo_mj@国家高技术研究发展计划(863计划)(No. 2007AA02Z216), 上海市生物技术产业化平台(No. 07DZ22914), 国家重点实验室专项经费(No. 2060204)资助。

体外培养小鼠生精细胞的形态学研究

体外培养小鼠生精细胞的形态学研究1江中良，李青旺，张明涛，李文烨，帅春晓，程磊西北农林科技大学动物科技学院11＃陕西杨凌 712100E-mail：jiangzhongliang73@摘要：利用姬姆萨原液和瑞－姬染色法对30-35日龄小鼠精液和睾丸组织培养后的生精细胞和精子进行形态学鉴定。

结果表明，用姬姆萨原液染色精子形态清晰，细胞膜边缘清楚，呈紫红色，未成熟精子的染色程度浅于成熟精子；另外，姬姆萨原液也可以替代其它混合染料。

睾丸组织经培养后，用姬姆萨原液染色，生精细胞形态清晰，细胞核呈颗粒状，开始呈现深紫红色，胞质粉红色且带有蓝色背景，颜色较深，过一定时间后，颜色变浅；瑞－姬染色生精细胞形态完整清晰，细胞核、核仁、胞质分别呈现不同颜色。

关键词：生精细胞；体外培养；形态学；细精管生精细胞包括精原细胞、各级精母细胞和精子细胞，其中精原细胞包括Ａ型精原细胞和Ｂ型精原细胞，前者作为人体内唯一可自我更新的干细胞，逐渐受到科学家的重视[1－3]。

而Ａ型精原细胞发育成为成熟精子的过程仍存在许多问题，包括精子发生的基因调控，精原细胞增殖分化的启动和调控，干细胞状态的维持及自我更新的方式等[4，5]。

生精细胞培养可用于人类男性生殖生理及精子发生，调控机制及治疗精子发生阻滞的患者；对精子发生机制的进一步阐明；可促进各种类型的精子微注射[6]，也可以促进动物转基因技术的发展及珍稀野生动物繁殖和濒危物种的保护[7]等。

随着细胞培养技术的发展，人们可直接对所培养的细胞进行观察处理。

因此，生精细胞体外成熟培养的研究已越来越重要，各国学者为之作了大量的努力。

本研究通过对小鼠精液、细精管中生精细胞和精子的染色，及细精管组织培养方面的研究，以期为今后的应用提供一定的数据和理论基础。

1.材料和方法：1.1实验动物选择小白鼠购自第四军医大学实验动物中心，昆明系30-35日龄，健康状况良好，生殖系统发育成熟。

1.2仪器、设备与试剂电子天平（上海精密科学仪器有限公司），相差显微镜及显微镜温控仪（南京凯尔医疗器械有限公司），恒温室水浴锅，CO2培养箱等。

小鼠睾丸支持细胞分离培养

小鼠睾丸支持细胞分离培养一、材料和器械：1、材料：小白鼠（18~ 20 日龄）1只2、配液：PBS 1L，高压灭菌细胞洗液：DMEM+双抗消化液：0 25% ( 质量分数) 胰蛋白酶，0 1%( 质量分数) 胶原酶细胞培养液：DMEM+10%FBS+双抗3、器械：镊子、手术剪、手术刀各3-4把，高压灭菌500mL烧杯2个，高压灭菌25 mL离心管、5 mL离心管各20个，高压灭菌酒精棉一瓶细胞培养皿若干冰块若干二、操作步骤：1、处死小鼠颈椎脱臼法处死；2、消毒置于含75% ( 体积分数) 乙醇平皿中浸泡2 min, 然后置于超净台上；3、取睾丸用中剪剪开下腹部皮肤, 眼科剪从下腹部附睾部剪断精索, 取出双侧睾丸, 放入含预冷细胞洗液的培养皿中；4、取实质修剪睾丸附带的精索。

剥除睾丸被膜, 将睾丸实质剪成约1 mm 1 mm 1 mm 碎块, 静置3~ 4 min；5、消化转入25mL 离心管中。

吸出上层细胞洗液, 每只睾丸加入1 5mL 37 预温的0 25% ( 质量分数) 胰蛋白酶，37 高速振荡消化15~ 20min, 直到残存的间质消化成粘液状, 可见成片断的曲细精管；6、终止消化加入入少许血清终止消化,；7、离心1000 r/ min离心5 min, 倾去上层胰酶。

加入DMEM/ F12 培养基重悬, 1000r/min 离心5min。

倾去上层培养液；8、再消化每只睾丸加入1 mL 37 预温的0 1%( 质量分数) 胶原酶, 37 低速缓慢振荡消化20~ 25min；9、铜网过滤取滤液800 r/ min 离心5min, 2 次去除胶原酶, 用培养液洗涤；10、接种往离心管加入细胞培养液5ml左右，吹打均匀，接种到两个30细胞培养皿中，补加培养液到培养皿1/3~1/2,培养皿标记显微观察后放入36CO2培养箱培养。

三、换液纯化，计数结果鉴定。

体外受精与自然受孕小鼠生殖能力的比较

南昌大学学报(医学版)2021年第 61卷第2期JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2021/Vol.61No.21体外受精与自然受孕小鼠生殖能力的比较付磊，马帅，李媛(首都医科大学附属北京朝阳医院生殖医学中心，北京100020)摘要：目的比较体外受精(IVF)与自然受孕(NC)小鼠的生殖能力.方法建立IVF和NC小鼠模型，观察雌鼠的阴道涂片、卵巢中卵泡刺激素受体(FSHR)的表达、雄鼠精液参数、精子DNA碎片指数及每窝产仔数.结果IVF与NC雌鼠动情周期［(4.90±0.17)d比(4.83±0.14)d］和动情持续期［(1.77+0.68)d比(2.00+0.25)d］差异无统计学意义(均P>0.05)；每窝产仔数［(13.70+2.08)只比(12.70+2.08)只］差异亦无统计学意义(P〉0.05).2类小鼠卵巢中FSHR表达量在不同卵泡中的表达差异无统计学意义.雄性IVF和NC小鼠在精子密度［(115.33+5.03)X106mL"1］比［(109.33士7.09)X106mL"1)］.畸形率［(0.13+0.02)比0.13+0.02)］及精子DNA碎片指数［(0.003+0.003)比(0.016士0.016)差异均无统计学意义(均P>0.05).正常雌鼠分别与IVF或NC雄鼠交配后的每窝产仔数［(13.00+1.00)只比(12.70+2.08)只］差异无统计学意义(P>0.05).结论性成熟IVF小鼠与NC 小鼠的生殖能力无明显差别.关键词：辅助生殖；体外受精；生殖能力评估；动物，实验；小鼠中图分类号：R321文献标志码：A文章编号：2095-4727(2021)02-0001-05DOI：10.13764/ki.ncdm.2021.02.001Comparison of Reproductive Capacity of Mice Conceivedby In Vitro Fertilization and Natural ConceptionFU Lei,MA Shuai,LI Yuan(Medical Center for Human Reproduction^Beijing Chao-Yang Hospital,Capital Medical University,Beijing100020,China)ABSTRACT：Objective To compare the reproductive capacity of mice conceived by in vitro ferti-lization(IVF)and natural conception(NC).Methods IVF and NC mouse models were established in this study.Vaginal smears and follicle stimulating hormone receptor(FSHR)expression in the ovary were observed in the female mice,and semen parameters and sperm DNA fragment index were determined in the male mice.In addition,the litter size was recorded.ResulSs There were no significant differences between IVF-conceived mice and NC-conceived mice in estrous cycle((4.90士0.17)d vs(4.83士0.14)d)?estrous duration((1.77+0.68)d vs(2.00士0.25)d),litter size(13.70士2.08vs12.70士2.08),FSHR expression,sperm concentration((115.33士5.03)X106mL vs(109.33+7.09)X106mL),sperm deformity rate(0.13+0.02vs0.13+0.02),and sperm DNA fragmentation index(0.003士0.003vs0.016+0.016)(P>0.05).Similarly,the litter size was not significantly di f erent between normalfemale mice mated with IVF-conceived male miceand those mated with NC-conceived male mice(13.00士1.00vs12.70+2.08)(P>0.05).Conclusion Therewasnosignificantdi f erenceinreproductiveabilitybetweenIVF-conceived miceand NC-conceived mice.KEY WORDS：assisted reproduction；in vitro fertilization；reproductive assessment;animal?experiment;mice收稿日期:2020-10-21基金项目：国家自然科学基金(81501323)；首都卫生科研发展项目(2020-1-2039)作者简介：付磊(1985-),女，博士，助理研究员，主要从事生殖生物学研究.通信作者：李媛，主任医师,E-mail:****************.2南昌大学学报（医学版）2021年4月，第61卷第2期随着辅助生殖技术（ART）应用的不断推广，其安全性越来越受到人们的关注。

小鼠睾丸支持细胞分离培养及生物学特性鉴定

睾丸支持细胞是由意大利组织学家Ｓｒｌ于ｅｔｉｏ
１１，．主要试剂２
胶原酶Ｖ（ｉ公司）胰蛋白酶Ｓｍａｇ、
１６８５年发现的存在于生精上皮中的一种大细胞，作为曲精细管的重要组成部分，多年来被认为是生精细胞的支架［２１１。它参与构成生精细胞分化发育的最
１．方２法
释放、泌、疫豁免等多种功能【１分免３。
睾丸支持细胞的体外分离、培养对明确体内精子发生机理具有重要作用ｌ５１。另外，临床上将睾丸支持细胞和胰岛共移植可以降低免疫排斥反应，提高糖尿病治愈的成功率ｌ６１试验对国外睾丸支持细。本胞分离、化技术加以改进，此基础上，行小鼠纯在进
Ｎａ８０Ｃ１．ｇ，ＫＣ１．００４ｇ，Ｃ２１ｇ，ｇＯ４‘ Ｈ２Ｃａ１０．４ＭＳ７００．０ｇ，２２ＮａＨＰＯ４‘ Ｏ０ＫＨ２Ｏ４０．６ｇ，ＨＣＨ２０．６ｇ，Ｐ０ＮａＯ３
睾丸支持细胞原代培养，并对其生物学特性进行检
突起很多，核仁清晰，胞质中可见大小不等的红色空泡状脂质小滴。
关键词：睾丸支持细胞；离；分纯化；培养；小鼠
中图分类号：８５１０３￥６．－．￣３文献标识码：Ａ文章编号：２８７３（０８０－０７００５ — ０３２０）９０１— ４

SD大鼠睾丸支持细胞的分离、培养、纯化及鉴定

ｃｌｅｒａｅｆｅ６ｈＴｅｌｇｒｍｉｒｗｈｄｒｔｎｏｅｌｓｆｕｄｔｎｅｓｄｃｓｄａｔｒ９．ｈｏａｉｅｈｔｃｇｏｔｕａｉｆｃｌｗａｏｎｏｂ — ａｓａｏｎｎｖｔｇｏｕａｉｏｔｏ
ｔｎｕｉｇｔｒｅｅｚｍｅｄｄｆｒｎｉｔｄａｃｏｎｔ０．ｈｈａｔｃｕｅｏｅｏｅａｄｎｉｅｓｎｉｓｅｎｙｓａｉｅｅｔｅｈｒｇｍｅｌｄＴｅｕｒｓｒｔｒｆｓａｈｃｌｗｓｉｅｔｄｕｉｇＨＥ．ｌｏｎｈｎａｎｉｌｕｉｆＯｉ
ｔｌｓｕｔｈｕｖｖａｅａｏｅ９％．ｅｃｌｂｇｎｔｎｈｒａｔｒ５ｈｕｓ／／ｏｃｌｒ．ｎｈｒｗｈｒｔｆｉｅｔｓｅｗｉｔｅｓｒｉａｒｔｂｖ０Ｔｅｌｅａａｃｏｆｏｒｎｖｔｕｔｅａｄｔｅｇｏｔａｅｏｃｉｈｌｈｏｅｒｕ
构与支持细胞的形态特征一致。可见，采用三酶两步消化法和差异贴壁法，可达到分离、培养、纯化Ｓ大鼠支持细胞的Ｄ
目的。
关键词：睾丸；支持细胞；体外培养；鉴定；Ｄ鼠Ｓ大
中图分类号：８２１Ｑ５．— ３１￥５．；９４６３＋文献标识码：Ａ文章编号：０２８６（００Ｏ — ２９０１０ — １１２１）３０５ — ４
（ＣｒｇｆｎｍｌｃｅｃｎｅｈｏｏｙＧａｇｉｎｖｒｔ，ａｎｎ３０５Ｃｉ；ｉｅＢｏｃｎｌ１ｏｅｅｉａＳｉｅａｄＴｃｎｌ，ｕｎｘＵｉｓｙＮｎｉ５００，ｈｎ２ＷｅｉｉｅｈｏｇｔｏＡｎｇｅｉｇａｍｔｏｙ

两步酶法在小鼠睾丸支持细胞分离与培养过程中的研究

两步酶法在小鼠睾丸支持细胞分离与培养过程中的研究目的：探讨两步酶法分离小鼠睾丸支持细胞以及在体外培养、纯化、鉴定过程中的优越性。

方法：选取7～8d雄性昆明小鼠，用胶原酶Ⅳ及胰蛋白酶两步酶法分离小鼠睾丸组织获得支持细胞，利用细胞差速贴壁特性纯化支持细胞，利用倒置显微镜、PI染色、特异性抗体标记的方法从多个维度鉴定小鼠睾丸支持细胞。

结果：培养72 h后支持细胞呈片状平铺于培养皿底层，相互接触，连接成片。

用波形蛋白特异性鉴定证实本实验分离所获得的小鼠睾丸支持细胞。

经过PI染色提示这些支持细胞为具有活性的支持细胞。

结论：本研究提示两部酶法是一种简便且高效的分离小鼠睾丸支持细胞的有效方法，值得推广。

标签：两部酶法；细胞分离；睾丸支持细胞；研究Abstract：Objective To investigate the advantages of the two step enzyme method to Isolated mouse Sertoli cells and culture in vitro，purify and identify.Methods Selection the KunMing male mice which born 7-8 days，using collagenase IV and trypsin to digestive testis tissue to get the sertoli cell and spermatogonium.Purification of Sertoli cells using differential adherent characteristics of the two cells.Sertoli cells were identified in several ways by using inverted microscopy，PI staining，and specific antibody labeling.Results After 72 hours of culture，The Sertoli cell spread at the bottom of the culture dish in？patches，and there are no obvious spermatogonial stem cells here whice looks like round.The PI staining indicated that these Sertoli cells are active.Vimentin specific identification proved that the isolated Testis Sertoli cells were obtained in this study.To verify what we got from the seperation experiment were the sustentacular cells of mouse testicles through vimentin specificity identification.Conclusion This research suggests the two enzymes is a simple and efficient method for separating Sertoli cells from mouse testis，the method is worth to be spread.Keywords：Two Step Enzyme Method；Cell Separation；Sertoli Cells；Research小鼠睾丸支持细胞是存在于小鼠睾丸生精上皮内的一种非生殖细胞，对生殖细胞具有支持营养作用[1]，每个支持细胞都营养着一定数目的生殖细胞[2-3]。

小鼠睾丸支持细胞分离培养及生物学特性鉴定

幼鼠睾丸进行分离、纯化和生物学特性鉴定。结果表明：分离、纯化后的睾丸支持细胞损伤少、活率高、睾丸支持细
胞占培养细胞总数的９０％以上；根据形态学观察及油红Ｏ脂质染色法鉴定，睾丸支持细胞的生长状态良好，细胞
图２睾丸支持细胞培养２４ｈ（２００×）
１８
２００８年第４４卷第９期
ＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ · 繁殖生理
图３睾丸支持细胞培养８ｄ（２００×）
２．２．２ＨＥ染色形态学观察睾丸支持细胞胞体呈宽大的柱状或不规则形状，其胞质铺展得很大，一般有３～４个突起，细胞核为卵圆形，位于胞质的中央或稍偏位，有２～３个清晰可见的核仁。多个一起存在时，细胞的突起相互连接，界限不清，呈单层膜状，胞质中可见有多量大小不一的空泡状结构（图４）。
２结果与分析
２．１睾丸支持细胞的分离纯化刚分离后的睾丸支持细胞中夹杂有大量的生精细胞，纯化后计数，平均每个睾丸可获得４×１０５个细胞（图１）。细胞悬液
接种２４ｈ后经Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ液低渗处理，可融解除去绝大部分精原细胞，获得均一、高纯度的睾丸支持细胞，其纯度可达９０％（图２）。经台盼兰染色，活细胞均透亮，拒染，少数死细胞蓝染，活细胞可占总数９５％以上。

小鼠睾丸支持细胞使用说明

小鼠睾丸支持细胞小鼠睾丸支持细胞产品说明：为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。

派瑞金提供的小鼠睾丸支持细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。

研发的小鼠睾丸支持细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。

同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。

注意事项：1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。

3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。

4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。

5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。

小鼠睾丸支持细胞产品简介：产品名称：小鼠睾丸支持细胞组织来源：小鼠睾丸产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶小鼠睾丸支持细胞细胞简介：睾丸支持细胞又称sertoli细胞。

它是生精细胞的支架,为其提供必需的营养物质,能合成与分泌雄激素结合蛋白,为其提供高浓度的雄激素环境等,还具有构成血-睾屏障,形成睾丸内微环境,调节精子发生等功能。

制备高活率的sertoli 不仅对sertoli的基础研究有重要价值,而且在精子发生等领域有重要意义。

本研究旨在建立小鼠sertoli的快速高效分离方法,并根据其分泌FasL的特性,采用细胞免疫化学方法对分离的小鼠sertoli进行鉴定,以期为进一步研究和应用sertoli奠定基础。

小鼠支持细胞体外培养的一般特性

传递促性腺激素的过程中发挥着中枢作用 ,而且具有支持、营红染色 30 s ,甘油明胶封固 ,普通光镜观察。
养、吞噬、释放、分泌等多种功能。体外培养支持细胞有助于研 2 结果
究其各种生物学特性及功能 ,以便于人们能更好地控制精子发 2. 1 酶消化的效果
生过程 ,为畜牧业生产及临床医学提供方便。本实验分离培养
1999 年 4 月 10 日对采用芬兰体型大的种公狐人工采精、冻 1 549 只 ,准胎率 90. 7 % ;产仔 16 700 只 ;成活 15 083 只 ,成活精、输精等技术做了试验研究 ,效果很好。现将结果报告如下。率 90. 3 % ;平均窝产仔 11. 5 只 ,平均窝活仔 10. 4 只 ,最多产
去 ,重新加入培养液继续培养。
平均 10 4. 219 4. 43 (9. 92) 3. 776 (90. 08) 3. 26 (8. 91) 4. 136
1. 2. 3 光镜样品的制备用 Lillie 和 Ashburn 修正的异丙醇油红法[2 ]略加改进后进行脂质染色。先配制油红 O 染色原液 :油红 O 0. 5 g ,含量 98 %以上的异丙醇 100 mL ,充分溶解后作为贮存液 (染色原液) 。染色步骤 :细胞体外培养约 24 h 后 , 弃去培养液 , 加入 PBS 缓冲的 4 %多聚甲醛 , 在 4 ℃下固定 1 h ,PBS 洗 2 次。临用时取染色原液 6 mL ,加蒸馏水 4 mL ,稀
关键词 :支持细胞 ;体外培养 ;一般特性 ;小鼠
摘要 :用组合酶消化法、选择性贴壁法将 7～8 日龄小鼠的支持细胞分离纯化后进行体外培养 ,观察其体外培养的一般
生物学特性。结果表明 ,所获细胞悬液中活细胞、死细胞及细胞团的百分率分别为 90. 08 % ,9. 92 % ,8. 91 % ,平均每个

小鼠睾丸输出管注射法建立转基因小鼠的试验研究

小鼠睾丸输出管注射法建立转基因小鼠的试验研究作者：王鹤曹文广来源：《天津农业科学》2013年第04期摘要：应用玻璃针将脂质体包裹的质粒pEGFP-C1通过睾丸输出管注射到4周龄昆明（KM）小白鼠睾丸曲精细管内。

共注射6只小鼠，其中一只注射后马上做石蜡切片观察转染液注射入曲细精管内的情况，其他5只继续饲养，1周后取1只小鼠培养睾丸的支持细胞，观察是否有荧光出现。

4周后，用PCR法检测剩余4只小鼠睾丸组织曲细精管基因组中的外源DNA，4只都显示为阳性。

表明用睾丸输出小管注射法将外源基因导入小鼠睾丸是一条简便可行的新途径。

关键词：小鼠；转基因；睾丸输出管注射法中图分类号：S865.1文献标识码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.04.008Construction of Transgenic Mice by Testicular Efferent Duct InjectionWANG He1，2， CAO Wen-guang2（1. College of Animal Science， Xinjiang Agriculture University， Urumqi， Xinjiang 830052， China； 2.Institute of Animal Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193， China）Abstract： Using glass needle plasmid pEGFP-C1 liposome-encapsulated was injected into the testicular efferent of 4 weeks male KM mice. Do immediately after an injection of paraffin sections to obserne the transfection solution was injected into the seminiferous tules， remanent mouse to continue to raise， after a week， take one mouse cultivating testicular sertoli cells. After four weeks， exogenous DNA in the PCR method for detecting the remaining four mouse testis seminiferous tubules genome， all as positive. The result indicated that the data in this study to transgenic animals could be established by testicular efferent injection.Key words： mice；transgenic；testis efferent injection转基因动物在生命科学、医学、生物制药等领域有着广泛的研究和应用前景，因此，科学家们一直在探索一种更简便易行、经济实用而又高效的转基因方法。

小鼠睾丸支持细胞的分离培养与生物学研究

小鼠睾丸支持细胞的分离培养与生物学研究刘慧莲(潍坊学院生物工程学院,山东潍坊261061)摘要 [目的]分离得到高纯度的小鼠睾丸支持细胞(S e rto li ce ll ),用以研究它对精原干细胞(S SC s)生长的影响。

[方法]取鼠龄3～7d 的雄性ICR 小鼠睾丸,采用胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶和D NA 酶消化分离S e rto li 细胞及SSC s ,经多次差异离心贴壁及低渗处理法进行纯化,用S e rto li 细胞作饲养层观察SSC s 的生长情况。

[结果]S er to li 细胞纯度达90%,且以S er to li 细胞作饲养层培养SSC s ,与对照相比,能明显促进SSC s 的增殖。

[结论]四酶消化低渗处理法可获得高纯度的S e r to li 细胞,且S er to li 细胞能明显促进S SC s 的增殖。

关键词小鼠;支持细胞;分离;精原干细胞;增殖中图分类号 Q 343 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)03-01066-03C u ltu re an d B io lo g ic a l S tud ie s on S e rto li C e lls Is o la ted from M ou s e T e s t is LI U H u i-lian (B io logy E n g in ee rin g In stitu te o f W e ifan g U n ive rs ity ,W e ifan g ,S h andon g 261061)A b s tra c t S e rto li ce lls fro mm ou se tes tis w e re iso la ted and cu ltu red to s tu dy th e e ffect o f S e r to li ce lls feede rs on m ou se spe rm a tog on ia l s te mce lls i n v it-ro .S e rto li ce lls an d spe rm a togon ia l s temce lls w e re iso la ted from3～7d ICR m ou se and su bje cted to sequ en tia l en zym a tic trea t m en t .S e rto li ce lls w ere tre a ted w ith T r is-H C l to rem ove spe rm a to gen ic ce lls an d h igh pu r ity se rto li ce lls w e re ob ta in ed .S e r to li ce lls tre a ted w ith m itom ycin C w e re u sed as feede r ce lls ,to s tu dy th e e ffect on m ou se spe rm a togon ia l stemce lls .A fter a w eek o f cu ltu re ,co m pa red w ithcon tro l ,th e re w e re m ore num be r o f spe rm a togon ia l s tem ce lls rem a in ed .M o re th an 90%o f th e S e r to li ce lls w e re iso la ted an d cu ltu red .S e r to li ce lls canprom o te p ro lifera tiono f spe rm a to gon ia l stemce lls obv iou s ly.M o re S e r to li ce lls w e re ob ta in ed th rou ghth is expe r i m en t m e th od w ith h igh pu r ifica tion.S e rto li ce lls can be u sed a s fe eder s n o t on ly to prom o te su rv iv a l bu t a lso ren ew a l o f sperm a togon ia l stemce lls .K e y w o rd s M ou se ;S e r to li ce ll ;Iso la tion ;S pe rm a to gon ia l s te mce ll ;P ro life ra tion基金项目国家自然科学基金项目(30300182)。

小鼠附睾脂肪干细胞的分离培养及鉴定

小鼠附睾脂肪干细胞的分离培养及鉴定张鉴清1，季佳霖2，崔新明2，张祺3，李艳茹21吉林大学第四医院，吉林省长春市130011；2吉林大学病理生物学教育部重点实验室，吉林大学基础医学院病理学系，吉林省长春市130021；3吉林大学，吉林省长春市130021 Isolation, culture and identification of adipose-derived stem cells from mouse epididymisZhang Jian-qing1, Ji Jia-lin2, Cui Xin-ming2, Zhang Qi3, Li Yan-ru21 the Fourth Hospital of Jilin University, Changchun 130011, Jilin Province, China;2 the Key Laboratory of Pathobiology of Ministry of Education, Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China;3 Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China 摘要背景：脂肪干细胞作为一种新的成体干细胞，具有来源丰富、取材容易、增殖能力强等优点，受到人们越来越多地关注。

目的：体外分离培养小鼠附睾脂肪组织中的脂肪干细胞，并鉴定其生物学特性。

方法：无菌切取小鼠附睾处脂肪组织，采用胶原酶进行消化，利用1次消化多次收集与差速贴壁法分离纯化脂肪干细胞。

倒置显微镜及透射电子显微镜观察脂肪干细胞的形态。

绘制脂肪干细胞的生长曲线。

流式细胞术检测脂肪干细胞的免疫表型。

加入细胞诱导剂对脂肪干细胞进行成骨及成脂肪的诱导分化。

睾丸间质细胞在小鼠生精恢复过程中的作用

睾丸间质细胞在小鼠生精恢复过程中的作用摘要：研究睾丸间质细胞对小鼠生精恢复过程的作用，可以为深入理解睾丸精原干细胞与其微环境（体）细胞间的相互关系提供实验证据选取8周龄健康C57近交系成年雄性小鼠60只，腹腔注射22mg/kg白消安建立小鼠精子发生受阻模型，随机分成1，2--甲磺酸乙烷（ethanel，2-dimethanesulphonate，EDS）处理组、氟他胺处理组和对照组，每组20只，3d后分别给予EDS腹腔注射（100mg/kg）、氟他胺埋植，对照组仅注射溶剂、埋植空管，分别在处理后的1个月内每周采样，Real-time RT-PCR检测CSF1.Gdnf、PLZF和Nanog mRNA表达水平，Gdnf蛋白水平表达，并在4周时进行睾丸组织HE染色，观察组织学变化并对相关指标进行量化分析结果表明，小鼠睾丸间质细胞去除及雄激素受体阻断均能促进睾丸损伤后的生精恢复过程，但是，受体阻断的效果更强，说明间质细胞除了通过雄激素发挥作用外还直接对生精恢复起着一定的促进作用，这种促进作用可能是通过分泌CSF1等细胞因子来实现的。

关键词：间质细胞；生精恢复；小鼠；睾丸The Role of Leydig Cell for Restoration of Spermatogenesis in Testis of miceYUANLi-fang1，2，AN Na2，WANG Shan-lin2，GUAN Shu-luan2，WANG Feng2，LI Zong-yue2，ZHU Bao-chang，（1.College of Mathematics and Computer Science，Shangrao Normal University，Shangrao 334000，Jiangxi，Chian；2.College of Life Science，Capital Normal University，Beijng 100048，Chian）Abstract：To study the role of Leydig cells inrestoration of spermatogenesis in testis of mice，we compared reestablishment of spermatogenesis in testes with ablation of Leydig cells and blockage of androgen receptors for understanding relationship between spermatogonial stem cells and their microenvironment.Total numbers of 60 male mice（C57）were selected at age of 8 weeks old.Spermatogenesis disruption model was made by intraperitoneal injection with busulfan（22mg/kgBW （body weight））.Then they were randomly divided into 3 groups.Treatments of EDS group（n=20），flutamide group（n=20）and the control group（n=20）were received intraperitoneal in jection of ethane 1，2-dimethanesulphonate（EDS）（100mg/kg BW），flutamide implantation and viechle solution，respectively.The expression of CSF1，Gdnf，PLZF and Nanog mRNA were measured by Real-time RT-PCR at 4 weeks after treatment.In addition，the protein expression of GDNF was assayed by Western blot.The histological changes in testicular tissue were observed under microscope with HE staining at 4 weeks.Although both removal of Leydig cells and blockage of androgen receptors could promote restoration of spermatogenesis in testis of mice，we found that androgen receptor blockage gave rise to a stronger effect.在生理条件下，睾酮对于成年动物的精子发生是不可或缺的，然而Ogawa 和Dohrinski等在精原干细胞移植研究中相继表明[1]，使用GnRH激动剂抑制受体动物睾酮后能显著增加精原干细胞移植后的克隆形成效率，进而证实促进精原干细胞克隆率就是通过抑制睾酮与受体结合来实现的，因此，不论何种方法只要抑制了睾酮的作用就能表现出这种促进作用（包括GnRH激动剂、受体拮抗剂等），其作用机理至今仍不完全明了。

1动物胚胎工程实验教程小鼠卵的体外成熟与体外受精材料与方法

《动物胚胎工程实验教程》王子玉自编南京农业大学动科院2005年8月实验一小鼠卵母细胞的体外成熟实验一、实验目的熟悉雌鼠的生殖器官的结构特点；掌握小鼠的超数排卵方案；掌握从卵巢上扎取未成熟卵母细胞的方法、卵母细胞的分类方法、体外成熟培养方法及核成熟情况和卵丘扩展程度的观察。

二、实验器材和材料1. 器材及药品体视显微镜，手术器械（眼科剪，眼科镊），1mL注射器，胶头滴管，口吸管，CO2培养箱，水浴锅，移液器，枪头，塑料培养皿，记号笔。

操作液（M2），成熟培养液（M－199），激素（PMSG和HCG），石蜡油。

2．实验动物：3-4周龄昆明系雌性小白鼠，自由采食饮水。

三、实验内容1.小鼠的超数排卵注射剂量皮下或腹腔注射PMSG 10 IU/只小鼠。

注射方法皮下注射：用手指捏住小鼠的头及尾部固定（图1-1），以酒精棉球消毒其背部，提起皮肤，将注射针头平插刺入皮下，将针头微向上挑起不露出针尖时，再注入药物。

随着药物的推入，在皮下可看到鼓起一个小泡，即证实药物确已注入皮下部位。

皮下注射时防止药液从针孔处逸出。

腹腔注射：针头刚进入腹腔后向上挑，防止损伤小鼠腹腔内器官。

注射针头宜选用小号细针头。

注射药物后的小鼠自由饮水、采饲，自然光照。

2.卵巢的采集方法在注射PMSG后46h利用颈椎脱臼法处死小鼠（将供体鼠置于饲养笼上，鼠爪自然抓紧笼上铁支架，此时一只手拉紧鼠尾，另一只手食指与拇指压紧鼠颈部，或用镊子压紧颈部即可致死，此为引颈法。

用75%酒精喷湿鼠全身以消毒并防止毛发飞扬）。

将小鼠头部固定，用力牵拉鼠尾，可感到颈椎部位脱臼的振动；也可用食指和拇指直接掐断颈椎致死。

然后用图钉将小鼠呈仰卧姿势固定于小木板上或鼠解剖台上。

图1－1 小鼠的固定将处死并固定好的小鼠，在下腹部中间剪开1个小口，一只手抓住鼠尾，另一只手抓住切开的皮肤向头部牵拉直至充分暴露腹部（图1-2）。

剪开腹膜，向前方揭去肠胃内脏，即暴露出生殖器官，可在肾脏后方看到两侧呈乳白色的卵巢及与输尿管相平行的两子宫角（图1-3）。

小鼠原始生殖细胞体外增殖与分化的研究

小鼠原始生殖细胞体外增殖与分化的研究
小鼠原始生殖细胞体外增殖与分化的研究
目的探讨小鼠原始生殖细胞(PGC)的体外增殖与分化.方法将PGC 与睾丸支持细胞(SC)共培养进行PGC的体外增殖.用原代PGC悬浮培养获取类胚体(EB),将EB贴壁培养,观察自然分化的结果.结果PGC与SC共培养可获得大量PGC集落.组织化学与免疫组织化学法显示,PGC 集落碱性磷酸酶(AKP)和阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)均呈阳性表达.将PGC悬浮培养可获得EB,EB贴壁生长后,可自然分化形成上皮样细胞、成纤维样细胞和神经样细胞.结论小鼠PGC与SC共培养能在体外大量增殖.并保持干细胞特性.PGC可形成EB,EB自然分化后大多数形成神经样细胞、其次是上皮样细胞和成纤维样细胞.
作者：孙燕史小林 SUN Yan SHI Xiao-lin 作者单位：首都医科大学生殖医学研究中心,北京,100069 刊名：解剖学报ISTIC PKU英文刊名：ACTA ANATOMICA SINICA 年，卷(期)：2006 37(3) 分类号：Q813 关键词：原始生殖细胞增殖类胚体分化细胞培养小鼠。

睾丸细胞的生物学特征及研究进展

睾丸细胞的生物学特征及研究进展睾丸形态与功能的维持主要依靠生精细胞、支持细胞、管周肌样细胞、间质细胞发挥作用。

生精细胞、支持细胞功能的正常是精子发生的基础，管周肌样细胞的收缩促使精子排出至睾丸网，间质细胞是睾酮的主要来源。

目前，睾丸细胞研究主要集中在细胞体外培养、细胞基因组学、细胞应用三大领域。

本次研究将分别探讨生精细胞、支持细胞、管周肌样细胞、间质细胞的的生物学特征及其研究进展。

Abstract：Testicular morphology and function mainly depends on the maintenance of Spermatogenic cells、Sertoli cells、peritubularmyoid cells and Leydig cells.The normal function of Spermatogenic cells and Sertoli cells is the basis of spermatogenesis，The sperm released into Rete testis by the contraction of peritubularmyoid cells，Leydig cells is the main source of testosterone.Currently，the mainly research of testicular cells concentrated in vitro culture、genomics and cell applications.Key words：Spermatogenic cells；Sertoli cells；Peritubularmyoid cells；Leydig cells；Biology；Applications睾丸由生精小管和间质构成，1～4条生精小管（seminiferous tubule）高度盘曲于睾丸小叶中。

睾丸生精细胞完全体外成熟培养的研究

到成熟精子用于卵胞浆内单精子显微注射。１９９８年Ｔｓｒｅａｉｋ等… 提出将无精子症患者睾丸内的生精细胞在体外培养到精子细胞成熟阶段或成熟的精子，通再过显微注射技术使其获得妊娠，非梗阻性无精子症为患者的治疗提供了解决的途径。本研究通过ｌ无精子症患者的睾丸组织分离４例出生精细胞，在体外成熟培养、分化的过程进行初步探索，临床上无精子症的治疗提供实验基础。尝试着为将体外培养后获得的长形精子细胞行卵胞浆内显微注射，果１观察出现受精的雌雄原核，２—７结４ｈ后３２ｈ后分裂成８一ｌ细胞的早期胚胎。现将实验结果报６个
１２临床资料．
本组１无精子症患者的年龄为（２７±１．），育４例３．４３岁不
比次级精母细胞大２。圆形精子细胞是无鞭毛的正圆形。但倍
是晚期或被变形的精细胞在近精子时期可见一个小小的鞭毛。１３３２细胞涂片、Ｅ染色．．．Ｈ１３３３生存活力检查．．．取部分细胞按常规方法涂
在男性不育症中有１％是由无精子症（ｚｏｐｒ０ａｏｓｅ－ｍａ引起的，精子症分为精子通路梗阻或缺如导致ｉ）无
的梗阻性无精子症（ｂｔｃｉｚｏｐｒｉ，Ａ）精ｏｓｕｔｅａｏｓｅａＯ和ｒｖｍ子发生障碍导致的非梗阻性无精子症（ｏｏｓｃｖｎｎｂｔｔｅｕｒｉａｏｓｅｉ，Ｏ。梗阻性无精子症患者睾丸或附睾ｚｏｐｒａＮＡ）ｍ