小鼠睾丸支持细胞使用说明

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小鼠睾丸支持细胞分离培养

小鼠睾丸支持细胞分离培养一、材料和器械：1、材料：小白鼠（18~ 20 日龄）1只2、配液：PBS 1L，高压灭菌细胞洗液：DMEM+双抗消化液：0 25% ( 质量分数) 胰蛋白酶，0 1%( 质量分数) 胶原酶细胞培养液：DMEM+10%FBS+双抗3、器械：镊子、手术剪、手术刀各3-4把，高压灭菌500mL烧杯2个，高压灭菌25 mL离心管、5 mL离心管各20个，高压灭菌酒精棉一瓶细胞培养皿若干冰块若干二、操作步骤：1、处死小鼠颈椎脱臼法处死；2、消毒置于含75% ( 体积分数) 乙醇平皿中浸泡2 min, 然后置于超净台上；3、取睾丸用中剪剪开下腹部皮肤, 眼科剪从下腹部附睾部剪断精索, 取出双侧睾丸, 放入含预冷细胞洗液的培养皿中；4、取实质修剪睾丸附带的精索。

剥除睾丸被膜, 将睾丸实质剪成约1 mm 1 mm 1 mm 碎块, 静置3~ 4 min；5、消化转入25mL 离心管中。

吸出上层细胞洗液, 每只睾丸加入1 5mL 37 预温的0 25% ( 质量分数) 胰蛋白酶，37 高速振荡消化15~ 20min, 直到残存的间质消化成粘液状, 可见成片断的曲细精管；6、终止消化加入入少许血清终止消化,；7、离心1000 r/ min离心5 min, 倾去上层胰酶。

加入DMEM/ F12 培养基重悬, 1000r/min 离心5min。

倾去上层培养液；8、再消化每只睾丸加入1 mL 37 预温的0 1%( 质量分数) 胶原酶, 37 低速缓慢振荡消化20~ 25min；9、铜网过滤取滤液800 r/ min 离心5min, 2 次去除胶原酶, 用培养液洗涤；10、接种往离心管加入细胞培养液5ml左右，吹打均匀，接种到两个30细胞培养皿中，补加培养液到培养皿1/3~1/2,培养皿标记显微观察后放入36CO2培养箱培养。

三、换液纯化，计数结果鉴定。

小鼠精巢生殖细胞减数分裂各时相识别

小鼠精巢生殖细胞减数分裂各时相识别谢文美; 周凤娟; 王强; 赵小荣; 朱春燕【期刊名称】《《解剖学杂志》》【年(卷),期】2019(042)005【总页数】5页(P435-438,封2)【关键词】减数分裂; 秋水仙素; 染色体; 性泡; 小鼠【作者】谢文美; 周凤娟; 王强; 赵小荣; 朱春燕【作者单位】甘肃医学院遗传病研究室平凉 744000; 甘肃医学院基础医学院生物教研室平凉 744000【正文语种】中文减数分裂过程中不同时相染色体变化复杂，染色体减数分裂异常也是许多人类遗传病发生的主要原因之一。

准确观察和识别减数分裂各时相特点是医学细胞生物学课程学生熟悉细胞生命活动的重要组成部分，也是医务工作者及有关研究者必须具备的技能。

然而目前多数教材及参考文献[1-3] 多以蝗虫为主，且各时期辨识描述及图谱简单且不清楚。

苏爱等[4] 采用十一酸睾酮与秋水仙素联合应用的方法制备，提高了对小鼠减数分裂前期I染色体标本分裂相细胞的检出率；Cai等[5] 通过免疫荧光染色方法制备并清晰分辨小鼠精母细胞联会复合体，对减数分裂第1次分裂前期观察具有很好的参考价值，但都未对小鼠减数分裂各时相识别及染色体的影响做介绍。

本研究应用常规小鼠睾丸生殖细胞减数分裂制片并加以改进，同时运用不同染色方法获取良好的观察标本，进行了大量对比形态学观察，以期为减数分裂课程教学及染色体异常研究提供参考。

1 材料和方法1.1 实验动物与试剂6～8周龄的ICR/JCL品系雄性小鼠4只（购买于兰州大学实验动物中心），体质量25 g 左右，用鼠颗粒饲料喂养，常规饮水。

秋水仙素、Giemsa染液购自广州市达晖生物技术有限公司；苏木精-伊红染液购自上海舜百生物科技有限公司；枸橼酸钠、甲醇、冰醋酸等常规分析纯购置。

1.2 小鼠生殖细胞减数分裂染色体标本制备雄性小鼠经腹腔注入秋水仙素（1 μg/kg）处理。

3～4 h后颈椎脱臼法处死小鼠，剖开腹腔，迅速分离双侧睾丸，于盛有2%枸橼酸钠溶液的培养皿中，用眼科剪和尖头镊子剥离睾丸外膜，暴露精细小管，移入10 ml 离心管管口，用眼科剪将精细小管剪碎呈糊状，以尽可能多释放生殖细胞。

新生小鼠精原干细胞诱导分化精子样细胞

新生小鼠精原干细胞诱导分化精子样细胞（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：毕聪明，王珅，王军，费东亮，肖银霞【摘要】目的探讨小鼠精原干细胞体外诱导分化精子样细胞的可行性。

方法以7～8日龄小鼠睾丸为材料，采用小鼠睾丸支持细胞作为饲养层，应用维甲酸诱导、成年小鼠睾丸组织液诱导以及低温诱导精原干细胞分化，应用流式细胞仪分析诱导精子样细胞的染色体倍性。

采用显微注射法将精子样细胞注射到卵母细胞和去核卵母细胞，观察受精卵的发育状况。

结果三种方法诱导精子样细胞比例分别为5.9%、1.6%、0.35%；流式细胞仪分析维甲酸诱导单倍体比率为19.3%；诱导精子样细胞能激活卵母细胞，囊胚发育率20.36%。

结论新生小鼠精原干细胞体外可以诱导分化为精子样细胞，并具有激活卵母细胞的能力。

【关键词】精原干细胞分化单倍体小鼠Abstract: Objective To discuss the possibility of SSCs of Newly-born mice inducing the differentiating Sperm-like cells. Methods Taking the testis of male mice of 7～8 days for materialand adopting the testis of mice , SSCs differentiating were induced by using retinoic acid, tissue fluid of adult mice and low temperature. Flow cytometry was used to analyse the ploidy of chromosome inducing sperm-like cells. Microinjection was used to inject the sperm-like cells into oocytes and enucleate oocytes to observe the development situation of zygotes. Results The proportions of sperm-like cells induced by the three methods were 5.9%,1.6%,0.35% respectively. The rate of Flow cytometry to analyse retinoic acid haploid is 19.3% .The sperm-like cells achieved could activate bovine oocytes by sperm injection (ICSI), and the development rate of blastosphere was 20.36%. Conclusions SSCs of newly -born mice can be induced and differentiated into sperm-like cells and are also capable of activating oocytes.Key words:SSCs; differentiating; haploid; mice 在生精过程中，原始生殖细胞在胚胎期迁移到生殖嵴，经有丝分裂，迅速增殖形成精原干细胞（spermatogoial stem cells， SSCs），然后进一步形成精原细胞。

小鼠睾丸支持细胞分离培养及生物学特性鉴定

幼鼠睾丸进行分离、纯化和生物学特性鉴定。结果表明：分离、纯化后的睾丸支持细胞损伤少、活率高、睾丸支持细
胞占培养细胞总数的９０％以上；根据形态学观察及油红Ｏ脂质染色法鉴定，睾丸支持细胞的生长状态良好，细胞
图２睾丸支持细胞培养２４ｈ（２００×）
１８
２００８年第４４卷第９期
ＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ · 繁殖生理
图３睾丸支持细胞培养８ｄ（２００×）
２．２．２ＨＥ染色形态学观察睾丸支持细胞胞体呈宽大的柱状或不规则形状，其胞质铺展得很大，一般有３～４个突起，细胞核为卵圆形，位于胞质的中央或稍偏位，有２～３个清晰可见的核仁。多个一起存在时，细胞的突起相互连接，界限不清，呈单层膜状，胞质中可见有多量大小不一的空泡状结构（图４）。
２结果与分析
２．１睾丸支持细胞的分离纯化刚分离后的睾丸支持细胞中夹杂有大量的生精细胞，纯化后计数，平均每个睾丸可获得４×１０５个细胞（图１）。细胞悬液
接种２４ｈ后经Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ液低渗处理，可融解除去绝大部分精原细胞，获得均一、高纯度的睾丸支持细胞，其纯度可达９０％（图２）。经台盼兰染色，活细胞均透亮，拒染，少数死细胞蓝染，活细胞可占总数９５％以上。

热应激小鼠体内睾酮浓度的变化及其与支持细胞HSPs表达的关系

理０．５、１ｈ和２ｈ，气候箱内相对湿度保持在５０％。１－３样品的采集与测定试验小鼠按照０．３５ｍＬ／１００ｇ
用，其中最主要的是以分子伴侣的形式协助细胞内
蛋白质的正常折叠以及修复变性蛋白［２１。尽管国内
摘要：实验旨在研究热应激条件下小鼠体内睾酮浓度的变化以及外源性睾酮对ＴＭ４细胞（小鼠支持细胞）中
热休克蛋白（ＨＳＰｓ）ｍＲＮＡ表达的影响。将４０只７周龄的雄性昆明种小白鼠随机分为４纽，每组１０只，对照组在
的表达没有显著影响。结果显示，热应激降低了小鼠体内的睾酮浓度：热应激时外源性睾酮可通过雄激素受体
上调Ｈｓｐ７２和Ｈｓｐｌ０５ｍＲＮＡ的表达。
关键词：热应激；睾酮：支持细胞；ＨＳＰｓ；小鼠
氨基酸（ＮＥＡＡ）均购自Ｇｉｂｃｏ公司；睾酮、Ｆｌｕｔａｍｉｄｅ购
于Ｓｉｇｍａ公司；水合氯醛购于国药集团化学试剂有限
公司，纯度 ≥９９．５％。
１．２实验动物与分组
７周龄的健康雄性昆明种小
外许多研究表明，热应激影响动物体内性激素的分
泌和性腺中ＨＳＰｓ的表达，但是在热应激过程中，性激素本身是否参与调控ＨＳＰｓ的表达还不清楚。因

基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制

基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制摘要:少精症是一种常见的男性生殖系统疾病，其表现为精子数量减少或无精子，给生殖力造成了严重影响。

本研究旨在探究睾丸支持细胞中4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制。

通过建立少精症小鼠模型，观察并分析4.1R蛋白的表达变化以及其对精子数量和质量的影响。

实验结果表明，4.1R蛋白在少精症小鼠模型中表达水平显著下降，并且与精子数量和质量呈正相关。

进一步的机制研究发现，4.1R蛋白在睾丸支持细胞中可以调节睾酮的合成和分泌、维持血-睾丸屏障的完整性以及促进精子发生和成熟过程中的细胞黏附和迁移等。

本研究的结果对于揭示少精症的发病机制和开发相关治疗策略具有重要意义。

关键词: 少精症，睾丸支持细胞，4.1R蛋白，睾酮，细胞黏附，细胞迁移引言:少精症是男性生殖系统常见的疾病之一，其严重影响到患者的生殖能力和生活质量。

目前，关于少精症的病因和作用机制尚不完全清楚。

睾丸支持细胞是保持正常精子发生和成熟所必需的细胞类型之一，对于精子数量和质量的调节起到重要作用。

因此，研究睾丸支持细胞中的4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制具有重要意义。

方法:1. 少精症小鼠模型的建立：选择健康成年小鼠，采用放射线或化学药物等方法诱导少精症。

2. 4.1R蛋白表达分析：使用免疫组织化学和蛋白质印迹等方法，检测4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的表达变化。

3. 睾酮水平测定：采用酶联免疫吸附法等方法，测定小鼠睾丸组织中睾酮的合成和分泌水平。

4. 血-睾丸屏障完整性分析：利用组织切片技术，观察并评估血-睾丸屏障的完整性。

5. 精子发生和成熟过程中的细胞黏附和迁移研究：采用细胞培养技术和细胞迁移实验等方法，研究4.1R蛋白对精子发生和成熟过程中细胞黏附和迁移的调节作用。

结果与讨论:实验结果显示，少精症小鼠模型中4.1R蛋白在睾丸支持细胞中的表达水平显著下降。

铁死亡与睾丸功能障碍的研究进展完整版

铁死亡与睾丸功能障碍的研究进展完整版铁是生物体内必需的微量元素，是氧运输、能量代谢和许多胞内酶的关键组分。

然而，过量铁可增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生，加剧细胞氧化应激［1］。

铁稳态对人体正常生理代谢至关重要。

2012年，Dixon等［2］首次发现Erasin可通过上调转铁蛋白和降低铁蛋白造成细胞内铁超载，导致铁依赖性的细胞死亡，被称为铁死亡。

铁死亡主要表现为细胞内铁和脂质过氧化物的积累，本质是细胞ROS过多引起氧化还原稳态失衡，与凋亡、自噬、坏死相比具有完全不同的特征和调控方式［3］。

铁死亡与多种退行性疾病、肿瘤和肾脏疾病等有关。

此外，铁死亡与男性不育也存在关联［4］。

男性不育的发病率近年有增加趋势，占所有不孕症的30%~50%，易受到环境、遗传和生活方式的影响［5］。

氧化应激是指ROS和抗氧化剂水平的失衡，其对男性生殖细胞的损害是男性不育的主要原因之一［6］。

铁死亡与氧化应激密切相关，铁缺乏会抑制抗氧化酶的活性，增加睾丸内的氧化应激；而铁超载会促进ROS的产生导致精子发生障碍［7］。

近年来，铁死亡这种新型细胞死亡方式与男性生殖障碍的相关性引起学者们的广泛关注和不断探索。

故本文结合最新的研究进展，主要从铁死亡相关机制、铁死亡在睾丸功能中的作用、与男性不育的关系和相关男性生殖疾病的潜在治疗策略等方面阐述铁死亡对睾丸功能的影响，为防治男性生殖疾病拓展思路。

一.铁死亡的机制1.脂质过氧化：脂质过氧化是铁死亡发生的重要标志，关键在于铁参与催化含多不饱和脂肪酸的磷脂（polyunsaturated-fatty-acid-containing phospholipids，PUFA-PLs）攻破铁死亡的防御系统［8］。

酰基辅酶A （acyl-coenzyme A，CoA）合成酶长链家族成员4（CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4）和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3（lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3）是脂质过氧化过程中起重要作用的蛋白，其增加可促进铁死亡的产生［9］。

两步酶法在小鼠睾丸支持细胞分离与培养过程中的研究

两步酶法在小鼠睾丸支持细胞分离与培养过程中的研究作者：南涛张奎原张虎骆衡徐述雄宋大龙罗光恒孙兆林胡建新来源：《中国民族民间医药·下半月》2018年第03期【摘要】目的：探讨两步酶法分离小鼠睾丸支持细胞以及在体外培养、纯化、鉴定过程中的优越性。

方法：选取7～8d雄性昆明小鼠，用胶原酶Ⅳ及胰蛋白酶两步酶法分离小鼠睾丸组织获得支持细胞，利用细胞差速贴壁特性纯化支持细胞，利用倒置显微镜、PI染色、特异性抗体标记的方法从多个维度鉴定小鼠睾丸支持细胞。

结果：培养72 h后支持细胞呈片状平铺于培养皿底层，相互接触，连接成片。

用波形蛋白特异性鉴定证实本实验分离所获得的小鼠睾丸支持细胞。

经过PI染色提示这些支持细胞为具有活性的支持细胞。

结论：本研究提示两部酶法是一种简便且高效的分离小鼠睾丸支持细胞的有效方法，值得推广。

【关键词】两部酶法；细胞分离；睾丸支持细胞；研究【中图分类号】R-332 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2018）06-0041-04Abstract：Objective To investigate the advantages of the two step enzyme method to Isolated mouse Sertoli cells and culture in vitro，purify and identify.Methods Selection the KunMing male mice which born 7-8 days，using collagenase IV and trypsin to digestive testis tissue to get the sertoli cell and spermatogonium.Purification of Sertoli cells using differential adherent characteristics of the two cells.Sertoli cells were identified in several ways by using inverted microscopy， PI staining，and specific antibody labeling.Results After 72 hours of culture，The Sertoli cell spread at the bottom of the culture dish in？patches，and there are no obvious spermatogonial stem cells here whice looks like round.The PI staining indicated that these Sertoli cells are active.Vimentin specific identification proved that the isolated Testis Sertoli cells were obtained in this study.To verify what we got from the seperation experiment were the sustentacular cells of mouse testicles through vimentin specificity identification.Conclusion This research suggests the two enzymes is a simple and efficient method for separating Sertoli cells from mouse testis，the method is worth to be spread.Keywords：Two Step Enzyme Method；Cell Separation；Sertoli Cells；Research小鼠睾丸支持细胞是存在于小鼠睾丸生精上皮内的一种非生殖细胞，对生殖细胞具有支持营养作用[1]，每个支持细胞都营养着一定数目的生殖细胞[2-3]。

小鼠睾丸输出管注射法建立转基因小鼠的试验研究

小鼠睾丸输出管注射法建立转基因小鼠的试验研究作者：王鹤曹文广来源：《天津农业科学》2013年第04期摘要：应用玻璃针将脂质体包裹的质粒pEGFP-C1通过睾丸输出管注射到4周龄昆明（KM）小白鼠睾丸曲精细管内。

共注射6只小鼠，其中一只注射后马上做石蜡切片观察转染液注射入曲细精管内的情况，其他5只继续饲养，1周后取1只小鼠培养睾丸的支持细胞，观察是否有荧光出现。

4周后，用PCR法检测剩余4只小鼠睾丸组织曲细精管基因组中的外源DNA，4只都显示为阳性。

表明用睾丸输出小管注射法将外源基因导入小鼠睾丸是一条简便可行的新途径。

关键词：小鼠；转基因；睾丸输出管注射法中图分类号：S865.1文献标识码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.04.008Construction of Transgenic Mice by Testicular Efferent Duct InjectionWANG He1，2， CAO Wen-guang2（1. College of Animal Science， Xinjiang Agriculture University， Urumqi， Xinjiang 830052， China； 2.Institute of Animal Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193， China）Abstract： Using glass needle plasmid pEGFP-C1 liposome-encapsulated was injected into the testicular efferent of 4 weeks male KM mice. Do immediately after an injection of paraffin sections to obserne the transfection solution was injected into the seminiferous tules， remanent mouse to continue to raise， after a week， take one mouse cultivating testicular sertoli cells. After four weeks， exogenous DNA in the PCR method for detecting the remaining four mouse testis seminiferous tubules genome， all as positive. The result indicated that the data in this study to transgenic animals could be established by testicular efferent injection.Key words： mice；transgenic；testis efferent injection转基因动物在生命科学、医学、生物制药等领域有着广泛的研究和应用前景，因此，科学家们一直在探索一种更简便易行、经济实用而又高效的转基因方法。

小鼠睾丸支持细胞的分离培养与生物学研究

小鼠睾丸支持细胞的分离培养与生物学研究刘慧莲(潍坊学院生物工程学院,山东潍坊261061)摘要 [目的]分离得到高纯度的小鼠睾丸支持细胞(S e rto li ce ll ),用以研究它对精原干细胞(S SC s)生长的影响。

[方法]取鼠龄3～7d 的雄性ICR 小鼠睾丸,采用胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶和D NA 酶消化分离S e rto li 细胞及SSC s ,经多次差异离心贴壁及低渗处理法进行纯化,用S e rto li 细胞作饲养层观察SSC s 的生长情况。

[结果]S er to li 细胞纯度达90%,且以S er to li 细胞作饲养层培养SSC s ,与对照相比,能明显促进SSC s 的增殖。

[结论]四酶消化低渗处理法可获得高纯度的S e r to li 细胞,且S er to li 细胞能明显促进S SC s 的增殖。

关键词小鼠;支持细胞;分离;精原干细胞;增殖中图分类号 Q 343 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)03-01066-03C u ltu re an d B io lo g ic a l S tud ie s on S e rto li C e lls Is o la ted from M ou s e T e s t is LI U H u i-lian (B io logy E n g in ee rin g In stitu te o f W e ifan g U n ive rs ity ,W e ifan g ,S h andon g 261061)A b s tra c t S e rto li ce lls fro mm ou se tes tis w e re iso la ted and cu ltu red to s tu dy th e e ffect o f S e r to li ce lls feede rs on m ou se spe rm a tog on ia l s te mce lls i n v it-ro .S e rto li ce lls an d spe rm a togon ia l s temce lls w e re iso la ted from3～7d ICR m ou se and su bje cted to sequ en tia l en zym a tic trea t m en t .S e rto li ce lls w ere tre a ted w ith T r is-H C l to rem ove spe rm a to gen ic ce lls an d h igh pu r ity se rto li ce lls w e re ob ta in ed .S e r to li ce lls tre a ted w ith m itom ycin C w e re u sed as feede r ce lls ,to s tu dy th e e ffect on m ou se spe rm a togon ia l stemce lls .A fter a w eek o f cu ltu re ,co m pa red w ithcon tro l ,th e re w e re m ore num be r o f spe rm a togon ia l s tem ce lls rem a in ed .M o re th an 90%o f th e S e r to li ce lls w e re iso la ted an d cu ltu red .S e r to li ce lls canprom o te p ro lifera tiono f spe rm a to gon ia l stemce lls obv iou s ly.M o re S e r to li ce lls w e re ob ta in ed th rou ghth is expe r i m en t m e th od w ith h igh pu r ifica tion.S e rto li ce lls can be u sed a s fe eder s n o t on ly to prom o te su rv iv a l bu t a lso ren ew a l o f sperm a togon ia l stemce lls .K e y w o rd s M ou se ;S e r to li ce ll ;Iso la tion ;S pe rm a to gon ia l s te mce ll ;P ro life ra tion基金项目国家自然科学基金项目(30300182)。

竹节参总皂苷减轻高脂饮食诱导的小鼠睾丸支持细胞连接功能损伤

Protective effects of total saponins from Panax japonicus against high-fat diet-induced testicular Sertoli cell junction damage in miceZHOU Benwen 1,2,3,ZHANG Changcheng 1,3,DENG He 1,2,CHEN Siming 1,3,CHANG Yanyu 1,3,YANG Yanna 1,2,FU Guoqing 1,3,YUAN Ding 1,ZHAO Haixia 1,21Third-grade Pharmacological Laboratory on Traditional Chinese Medicine of State Administration of Traditional Chinese Medicine,2College of Basic Medical Science,3College of Medicine and Health Science,China Three Gorges University,Yichang 443002,China摘要：目的探究竹节参总皂苷（TSPJ ）对高脂饮食诱导的小鼠睾丸支持细胞功能损伤的保护作用及机制。

方法将40只C57BL/6J雄性小鼠随机分为正常饮食组、高脂饮食组、TSPJ 低剂量（25mg/kg ）组和TSPJ 高剂量（75mg/kg ）组，10只/组。

正常饮食组给予普通饲料喂养，其余组均给予高脂饲料喂养，TSPJ 连续灌胃给药5月，小鼠称重处死，取出睾丸和附睾组织称重并计算其指数；取附睾组织进行精液分析；HE 染色观察小鼠睾丸组织形态变化，测量统计生精上皮厚度与生精小管直径；Western blot 检测睾丸支持细胞紧密连接功能蛋白ZO-1、Occludin 和Claudin11以及外质特化功能蛋白N-cadherin 、E-cadherin 和β-catenin 的表达水平；免疫荧光法检测睾丸组织中ZO-1和β-catenin 蛋白定位及表达；免疫荧光双标法检测睾丸支持细胞中LC3B 、p-AKT 和p-mTOR 表达变化。

雌激素受体α下调导致小鼠睾丸TM4支持细胞连接功能损伤的作用机制

网络出版时间：２０２３－０８－２８１３：５０：５７　网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／３４．１０８６．ｒ．２０２３０８２５．１００６．０３６◇生殖药理学◇雌激素受体α下调导致小鼠睾丸ＴＭ４支持细胞连接功能损伤的作用机制杨焱娜１，２，张长城１，３，常言语１，３，周本文１，３，陈思敏１，３，邓　何１，２，赵海霞１，２（三峡大学１．国家中医药管理局中药药理科研三级实验室、２．基础医学院、３．健康医学院，湖北宜昌　４４３００２）收稿日期：２０２３－０３－０６，修回日期：２０２３－０６－２４基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ８２２７４１９１，８２０７４２０５）作者简介：杨焱娜（１９９５－），女，硕士生，研究方向：机体衰老的生理病理机制与药物防治机制；Ｅｍａｉｌ：１１９２０４３５１２＠ｑｑ．ｃｏｍ；赵海霞（１９８６－），女，博士，副教授，硕士研究生导师；研究方向：生殖衰老的发生机制与中医药防治机制；Ｅｍａｉｌ：２８３９１９８７４＠ｑｑ．ｃｏｍｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２３０３０１０文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）０９－１７１８－０７中国图书分类号：Ｒ３３２；Ｒ３２２６４；Ｒ３２９２４；Ｒ３９２１１摘要　目的　探究雌激素受体α（ｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒａｌｐｈａ，ＥＲα）下调导致的小鼠睾丸ＴＭ４支持细胞连接功能损伤是否与自噬相关。

方法　不同浓度ＥＲα抑制剂ＩＣＩ１８２７８０（ＩＣＩ）处理ＴＭ４细胞，ＣＣＫ８法检测细胞增殖活性；将细胞分为正常对照组、不同浓度ＩＣＩ处理组。

光镜观察细胞数量及形态变化；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测ＥＲα蛋白、连接功能相关蛋白、自噬标志物蛋白表达变化；免疫荧光法检测缝隙连接蛋白４３（Ｃｘ４３）表达与定位；氯喹（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ，ＣＱ）与ＩＣＩ联合作用细胞２４ｈ，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测自噬及连接功能相关蛋白表达水平。

小鼠睾酮(T)说明书(1)

5.625ng/L
1 号标准品
150μl 的 2 号标准品加入 150μl 标准品稀释液
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样 50μl，待测样品孔中先加样品稀释液 40μl，
然后再加待测样品 10μl（样品最终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。 4. 配液：将 20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 20 倍稀释后备用 5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50μl，空白孔除外。 7. 温育：操作同 3。 8. 洗涤：操作同 5。 9. 显色：每孔先加入显色剂 A50μl，再加入显色剂 B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15 分钟. 10. 终止：每孔加终止液 50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。操作程序总结：
12 密封袋
1个
标本要求
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能
马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
Hale Waihona Puke 操作步骤1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀
小鼠睾酮(T)酶联免疫分析
试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研究使用。

睾丸间质细胞在小鼠生精恢复过程中的作用

睾丸间质细胞在小鼠生精恢复过程中的作用摘要：研究睾丸间质细胞对小鼠生精恢复过程的作用，可以为深入理解睾丸精原干细胞与其微环境（体）细胞间的相互关系提供实验证据选取8周龄健康C57近交系成年雄性小鼠60只，腹腔注射22mg/kg白消安建立小鼠精子发生受阻模型，随机分成1，2--甲磺酸乙烷（ethanel，2-dimethanesulphonate，EDS）处理组、氟他胺处理组和对照组，每组20只，3d后分别给予EDS腹腔注射（100mg/kg）、氟他胺埋植，对照组仅注射溶剂、埋植空管，分别在处理后的1个月内每周采样，Real-time RT-PCR检测CSF1.Gdnf、PLZF和Nanog mRNA表达水平，Gdnf蛋白水平表达，并在4周时进行睾丸组织HE染色，观察组织学变化并对相关指标进行量化分析结果表明，小鼠睾丸间质细胞去除及雄激素受体阻断均能促进睾丸损伤后的生精恢复过程，但是，受体阻断的效果更强，说明间质细胞除了通过雄激素发挥作用外还直接对生精恢复起着一定的促进作用，这种促进作用可能是通过分泌CSF1等细胞因子来实现的。

关键词：间质细胞；生精恢复；小鼠；睾丸The Role of Leydig Cell for Restoration of Spermatogenesis in Testis of miceYUANLi-fang1，2，AN Na2，WANG Shan-lin2，GUAN Shu-luan2，WANG Feng2，LI Zong-yue2，ZHU Bao-chang，（1.College of Mathematics and Computer Science，Shangrao Normal University，Shangrao 334000，Jiangxi，Chian；2.College of Life Science，Capital Normal University，Beijng 100048，Chian）Abstract：To study the role of Leydig cells inrestoration of spermatogenesis in testis of mice，we compared reestablishment of spermatogenesis in testes with ablation of Leydig cells and blockage of androgen receptors for understanding relationship between spermatogonial stem cells and their microenvironment.Total numbers of 60 male mice（C57）were selected at age of 8 weeks old.Spermatogenesis disruption model was made by intraperitoneal injection with busulfan（22mg/kgBW （body weight））.Then they were randomly divided into 3 groups.Treatments of EDS group（n=20），flutamide group（n=20）and the control group（n=20）were received intraperitoneal in jection of ethane 1，2-dimethanesulphonate（EDS）（100mg/kg BW），flutamide implantation and viechle solution，respectively.The expression of CSF1，Gdnf，PLZF and Nanog mRNA were measured by Real-time RT-PCR at 4 weeks after treatment.In addition，the protein expression of GDNF was assayed by Western blot.The histological changes in testicular tissue were observed under microscope with HE staining at 4 weeks.Although both removal of Leydig cells and blockage of androgen receptors could promote restoration of spermatogenesis in testis of mice，we found that androgen receptor blockage gave rise to a stronger effect.在生理条件下，睾酮对于成年动物的精子发生是不可或缺的，然而Ogawa 和Dohrinski等在精原干细胞移植研究中相继表明[1]，使用GnRH激动剂抑制受体动物睾酮后能显著增加精原干细胞移植后的克隆形成效率，进而证实促进精原干细胞克隆率就是通过抑制睾酮与受体结合来实现的，因此，不论何种方法只要抑制了睾酮的作用就能表现出这种促进作用（包括GnRH激动剂、受体拮抗剂等），其作用机理至今仍不完全明了。

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小鼠睾丸支持细胞
小鼠睾丸支持细胞产品说明：
为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。

派瑞金提供的小鼠睾丸支持细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。

研发的小鼠睾丸支持细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。

同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。

注意事项：
1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。

3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。

4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。

5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。

小鼠睾丸支持细胞产品简介：
产品名称：小鼠睾丸支持细胞
组织来源：小鼠睾丸
产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶
小鼠睾丸支持细胞细胞简介：
睾丸支持细胞又称sertoli细胞。

它是生精细胞的支架,为其提供必需的营养物质,能合成与分泌雄激素结合蛋白,为其提供高浓度的雄激素环境等,还具有构成血-睾屏障,形成睾丸内微环境,调节精子发生等功能。

制备高活率的sertoli 不仅对sertoli的基础研究有重要价值,而且在精子发生等领域有重要意义。

本研究旨在建立小鼠sertoli的快速高效分离方法,并根据其分泌FasL的特性,采用细胞免疫化学方法对分离的小鼠sertoli进行鉴定,以期为进一步研究和应用sertoli奠定基础。

本公司生产的小鼠睾丸支持细胞，细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

小鼠睾丸支持细胞培养基信息：
1）培养基类型：DMEM高糖
2）添加因子：FBS、Penicillin、Streptomycin 等
小鼠睾丸支持细胞使用方法：
1. 取出25cm2 培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO
细胞培
2
养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。

2. 小鼠睾丸支持细胞，建议直接使用，不建议扩大培养
3. 待细胞状态最佳时准备转孔培养，进行实验：
1) 吸出25cm2培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；
2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液约1mL至培养瓶中，37℃温浴1min左右；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化；
3) 用吸管轻轻吹打混匀，按适当的比例进行转孔培养实验，放入37℃，5% CO
2细胞培养箱中培养；
4) 待细胞完全贴壁后，培养观察。

之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。

小鼠睾丸支持细胞注意事项：
1. 培养基于4℃条件下可保存3-6个月。

2. 在细胞培养过程中，请注意保持无菌操作。

3. 传代培养过程中，胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态。

4. 该细胞只可用于科研。

备注：由于实验所用试剂与操作环境的不同，以上方法供各实验室参考。

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小鼠肝内胆管上皮细胞小鼠晶状体上皮细胞
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小鼠肝窦内皮细胞小鼠视网膜神经节细胞
小鼠肝星形细胞小鼠角膜成纤维细胞
小鼠直肠平滑肌细胞小鼠脉络膜血管细胞
小鼠小肠平滑肌细胞小鼠牙乳头细胞
小鼠结肠平滑肌细胞小鼠肝外胆管上皮细胞
小鼠肠上皮细胞小鼠肝Kupffer细胞
小鼠肠微血管细胞小鼠骨髓间充质干细胞
小鼠肠巨噬细胞小鼠下丘脑神经元细胞
小鼠子宫内膜上皮细胞小鼠睾丸支持细胞
小鼠卵巢颗粒细胞小鼠心肌微血管内皮细胞小鼠子宫颈上皮细胞小鼠真皮微血管上皮细胞小鼠子宫平滑肌细胞小鼠胚胎成纤维细胞
小鼠卵巢上皮细胞小鼠心脏干细胞
小鼠子宫成纤维细胞小鼠神经干细胞
小鼠卵巢成纤维细胞小鼠骨髓来源内皮祖细胞小鼠肾实质细胞小鼠椎间盘髓核细胞
小鼠肾系膜细胞小鼠肾足突细胞
小鼠膀胱上皮细胞小鼠肾小管平滑肌细胞
小鼠膀胱平滑肌细胞小鼠肾成纤维细胞
小鼠肾动脉内皮细胞小鼠尿道上皮细胞
小鼠肾动脉平滑肌细胞小鼠输尿管上皮细胞
小鼠肾小管上皮细胞小鼠肾管状上皮细胞
小鼠肾小球内皮细胞小鼠心肌细胞
小鼠前列腺上皮细胞小鼠心肌成纤维细胞小鼠肾上皮细胞小鼠主动脉内皮细胞小鼠膀胱成纤维细胞小鼠主动脉平滑肌细胞小鼠血管外膜成纤维细胞。