高效液相色谱培训
高效液相色谱仪Waters 工作站 Empower2_现场培训教材
接受默认的选项，然后单击“下一步”。 此页的复制是指从另一个项目复制现有设置。 可以复制项目的“视图筛选器”、“自 定义字段”、“方法”和“参数”。 关于视图筛选器和自定义字段的含义，请参阅Empower 帮助的“处理项目”与“自 定义项目”内容。 9. 在“新建项目向导－输入名称”页中，
输入项目的名称，最后单击“完成”来结束新项目的创建。 提示：项目名中不能出现空格。可使用下划线(_ ) 分隔词。另外，名称不能以数字和 中文字符开头。如果在前面选中了“完全审计追踪”选项，则需要在注释框输入注释。
仪器方法用于指定仪器控制和数据采集参数，如流量和波长。仪器包括泵、溶剂管理系统、 检测器、自动进样器、样品管理系统和气相色谱仪。可设置仪器方法以执行以下任务：
l 采集数据 l 设置初始条件以平衡系统 l 平衡色谱柱 l 清洗自动进样器管路和检测器流动池 l 通过设置清洗条件、关闭灯等来关闭系统
样品组方法包含一组函数和相关信息，用于指定从一组样品瓶中的每个样品瓶（标准样或 未知样）采集数据的参数。 提示：如果每天都运行同一类型的样品，则可创建一个样品组，这样每次运行时只需修改其 中具有新样品名的样品。
2. 出现配置管理器窗口。
3. 选择菜单“文件－新建－项目”。
6
4. 出现“新项目向导”的对话框：
在此对话框，需要确定项目是位于项目根目录中，还是为项目层次结构的一部分（作为 父项目的一个子项目）。 这种层次结构允许您将多个项目组织在一个公用项目结构中。 备份父项目及子项目时，该层次结构保持不变。 提示：在项目层次结构中选择要创建新项目的位置。 要将项目创建为新的顶级项目， 请单击“项目”文件夹。 要将项目创建为现有项目的子项目，请单击一个现有项目文件 夹。 该现有项目即被指定为父项目，而新项目即作为该父项目的子项目进行创建。 5. 单击“下一步”，出现“新建项目向导－表空间”，如下图所示：
Agilent 1200高效液相色谱培训材料使用说明书
Agilent 1200 LC[Agilent Chemstation B.04.02 Classic (中文)]现场培训教材安捷伦科技有限公司生命科学与化学分析仪器部一、 目录二、 培训目的 (3)三、 培训准备 (3)1. 仪器准备 (3)2. 溶剂准备 (3)四、 方法建立 (3)1. 开机准备 (3)2. 数据采集方法编辑 (5)9 G1310A(单元泵) (5)9 G1312A，G1312B XL(二元泵)/G1311A(四元泵)： (7)9 G1313A(标准型自动进样器)，G1329A/B(自动控温自动进样器) (8)9 G1367B/C/D(高性能自动进样器) (9)9 G1328A(手动进样器) (11)9 G1316A,G1316B XL(柱温箱) (11)9 G1314A/B/D/E,G1314C XL(可变波长紫外检测器) (13)9 G1315B/D ,G1315C XL(二极管阵列检测器)/ G1365B/D ,G1365C XL(多波长紫外检测器) (15)9 G1362A(示差检测器) (17)9 G1321A(荧光检测器) (19)9 G4218A(蒸发光散射检测器) (23)3. 数据分析方法编辑 (25)9 谱图优化 (25)9 积分参数优化 (25)9 校正 (27)9 打印报告 (28)9 光谱 (29)4. 建立全新完整方法向导 (31)9 新建完整方法： (32)9 保存方法： (36)9 保存即时改变的方法 (36)9 调用方法： (36)5. 进样 (36)9 单针进样 (36)9 序列进样 (37)五、 关机 (37)1. 关闭检测器的灯 (41)2. 冲洗系统 (41)3. 封存色谱柱 (41)4. 关闭电脑 (41)5. 关闭模块 (41)六、 RRLC(快速液相)注意事项 (41)七、 Agilent 1200保养维护 (43)八、 Agilent 1200常见问题解决方法 (45)二、 培训目的9基本了解1200LC硬件操作。
高效液相色谱法
答：气相温度对于样品的气化程度影响很大,一般来说温度越高,气化越快,通过色谱柱时间也越短,气相单一物质分析一般用恒温,多种物质分析时,通过改变柱温能够很好的对样品进行分离,节省了分析时间,这时往往用梯度升温。
3、若标准曲线用咖啡因浓度对峰高作图，能给出准确结果吗？与本实验的标准曲线相比何者优越？为什么？
答：能，浓度对峰面积更优越。因为有些峰不完全对称，用它作标准曲线误差较大。
4、在样品干过滤时，为什么要弃去前过滤液？这样做会不会影响实验结果？为什么？
答： 干过滤主要是保持溶液浓度不变而采取的一种过滤方法，前液中可能有一些滤纸或滤膜上的杂质存在，为了保持溶液浓度不变，所以要将前液去掉。干过滤为分离掉溶液中的固体并且不改变溶液浓度而采取的一种方法。为保持溶液浓度不变。前段滤液要弃去，并且滤纸漏斗盛接的烧杯都要干的。这样做不会影响实验结果。
液相并不是都是室温,一般来说,温度对于反相色谱分析影响不大,所以用反相柱分析时,一般用室温,不配备柱温箱,但是很多正相色谱分析时对于温度要求比较严格,比如说配位体交换色谱法时,温度的影响还是很大的。
5、测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。
6、10μL平头微量注射器。
四、实验内容
1、标准贮备液配制质量浓度分别为20、40、80、160μg·mL-1的标准系列溶液。（1mL，2mL，4mL，8mL稀释为50mL）
2、谱仪器条件：
泵的流速：1.0mL/min；检测波长：275nm；进样量：4μL；柱温：室温。
定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间tR和峰面积A后，可直接用tR定性，用峰面积A作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
高效液相色谱操作知识
高效液相色谱操作知识（一）高压恒流泵的维护注意事项泵的密封圈是最易磨损的部件，密封圈的损坏可引起系统的许多故障，要注意保养和定期更换。
应采取下列措施以延长使用寿命：绝对不允许在没有流动相的或流动相还没有进入泵头的情况下启动泵而造成柱塞杆的干磨。
每天使用后应将整个系统管路中的缓冲液体冲洗干净，防止盐沉积，整个管路要浸在无缓冲的溶液或有机溶剂中。
长期不用也要定期开泵冲洗整个管路。
要用HPLC级试剂输液管前端要用烧结不锈钢沉子过滤流动相。
要注意防止管路阻塞造成压力过高而损坏仪器。
压力下限应设置在0.5~1MPa，以防止储液器中的流动相被抽干或严重渗漏而引起柱塞的干磨有柱后清洗功能的高压恒流泵还要注意保持清洗液，否则将失去柱后清洗效果。
(二)流动相使用的注意事项必须使用HPLC级或相当于该级别的流动相，并要先经0.45?m薄膜过滤。
过滤后的流动相必须经过充分脱气，以除去其中溶解的气体（如02），如不脱气易产生气泡，增加基线噪声，造成灵敏度下降，甚至无法分析。
几种脱气方法比较：1、氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好但成本高。
2、加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。
3、抽真空脱气法：易抽走有机相4、超声脱气法：一种较为常见的脱气法。
流动相放在超声波容器中，用超声波震荡10~15 分钟，此法效果并不太好但操作简单。
如果管路中使用peek树脂部件，请不要使用下列流动相：浓硫酸、浓硝酸、二氯乙酸、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿和二甲基亚砜特别注意HPLC使用过后的系统清洗：含有缓冲盐溶液的流动相的清洗方法：1、先用100%的纯水冲洗，打开排放阀，用3~5ml/min的流量，洗二十分钟左右后停泵。
此举主要是针对吸液系统、泵头、进出口单向阀等体积较大的空间的清洗2、再用5：95的甲醇/水清洗整个系统，关闭排放阀，用1ml/min的流量，洗30~60分钟后停泵。
此举主要是用水清洗整个系统中的盐，用5%的甲醇主要是为了保护色谱柱。
安捷伦高效液相色谱工作站高级操作培训
安捷伦高效液相色谱工作站高级操作培训作为一种重要的分析技术，高效液相色谱（HPLC）在实验室中被广泛应用于各种化学、生物和环境领域的分析。
而安捷伦高效液相色谱工作站作为常用的HPLC设备，其高级操作技巧的掌握对于提高实验效率和结果的准确性至关重要。
以下是安捷伦高效液相色谱工作站高级操作培训的主要内容：1.仪器介绍：详细介绍设备的基本结构和主要部件，包括进样器、分离柱、检测器等，并对各个部件的功能和操作方法进行说明。
2.方法开发：介绍如何根据实验需求选择合适的柱和流动相，调整流速、梯度程序、温度等参数，以达到最佳的分离效果和分析结果。
3.样品处理：讲解样品的前处理方法，如提取、净化、稀释等，以及常用的样品制备技巧，如固相萃取、离心等，以确保样品的准确性和稳定性。
4.数据处理：教授如何使用工作站软件进行数据采集、分析和处理，包括峰识别、峰面积计算、定量分析等，以及如何导出和保存数据结果。
5.故障排除：介绍常见的仪器故障及其解决方法，如柱堵塞、泵压不稳定、峰形不对称等，提供具体的故障诊断和维修指南。
6.方法验证：讲解常用的方法验证和质量控制技巧，包括标准曲线的建立和验证、精密度和准确度的评估等，以确保实验结果的可靠性和准确性。
该培训旨在使参与者掌握安捷伦高效液相色谱工作站的高级操作技巧，提高实验效率和分析结果的准确性。
通过实践操作和案例分析，培训参与者将能够熟练使用工作站进行方法开发、样品处理、数据处理和故障排除，并能够进行方法验证和质量控制。
总结：安捷伦高效液相色谱工作站高级操作培训是一项重要的培训活动，对于提高实验效率、保证实验结果的准确性和可靠性具有重要意义。
通过该培训，参与者将能够全面掌握安捷伦高效液相色谱工作站的操作技巧，并能够独立开展高效液相色谱分析实验。
高效液相色谱法教学【全】精选全文
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
最新安捷伦高效液相色谱工作站高级操作培训ppt课件
Slide 54
自动积分
•检查开始和结束区域，确定噪音。 •赋予初始Slope Sensitivity和Height Reject值. •对第一次积分赋予一个临时峰宽值。 •设置Area Reject为0。 •执行测试性积分，有可能重复几次。 •基于较早洗脱出的色谱峰宽计算峰宽值。 •优化Slope Sensitivity和Height Reject。 •从初始的峰宽和噪音水平计算Area Reject。
Slide 34
泵的辅助功能
选择Instrument More Pump Auxiliary…菜单，即 可弹出下图窗口。
在该窗口可以设置泵 的最大升流速率、泵 冲程大小以及设置溶 剂的压缩补偿因子。
Slide 35
自动进样器的扩展功能
Slide 36
色谱柱信息的输入
Slide 37
VWD停泵扫描采集光谱
Slide 59
Peak width: (半峰宽)
如果没有设置半峰宽的时间积分表，半峰宽在整个积分过程中自动变化，变化 遵从0.75×exiting peak + 0.25×current peak。
Timed Events :(时间性积分事件)
•Area Sum ON or OFF:设定某一时间段内进行峰面积加和，加和后保 留时间被分配到第一个峰的保留时间上。
使用VWD停泵扫描的功能，可以采集样品的吸收光谱， 主要操作步骤如下： 1.在Online工作站界面的View菜单下打开VWD Scans窗口； 2.按照正常的进样方式采集样品色谱数据，并保证能够在
Online Signal窗口中观测到色谱信号； 3.进样后，色谱图上出现基线时，扫描空白吸收光谱
高效液相色谱法培训考核试卷.
考核及格标准：80分,且带*的必须正确。
精密仪器组培训考核试题集部门：姓名：成绩：一、填空题（66分，每题6分）1、流动相的pH值应控制在之间，当色谱系统中需使用pH值大于8的流动相时，应选用；当色谱系统中需使用pH值小于2的流动相时，应选用。
2、剩余检品按月存放，暂存期至少为个月。
3、HPLC法中，除另有规定外，流速一般为。
4、对照品或标准品自冰箱中取出后，必须放置至，然后才可以在分之一天平上称量，新开启的在使用后，必须标注。
5、对照或标准溶液需要保存的，其有效性必须经，确定后方可使用。
6、在系统适用性试验中：分离度除另有规定外，待测组分与相邻共存物之间的分离度应；拖尾因子除另有规定外，应在之间。
7、对于要求梯度洗脱的样品，在样品分析前必须进行，以辨认杂质峰，如洗脱过程中基线漂移较大，亦可对色谱图进行处理。
8、配制好的流动相应通过 um滤膜滤过，用前必须，否则容易在系统内，影响泵的工作、、检测器的灵敏度以及等。
对于规定pH值的流动相，应使用进行调节，除另有规定外，偏差一般不超过 pH单位。
*9、当两份平行测试样品检验结果一份合格、另一份不合格时，不得将其，应视为。
两份平行测试样品检验结果相对偏差应。
10、在出现检验结果、检验结果时应启动OOS。
11、配制好的流动相应及时记录，记录应包括：、、、、等，配制好的流动相应储存于中，避免直射，有效期一般为。
*12、外标法求组分含量计算公式：。
*13、内标法求组分含量计算公式：。
14、相对偏差计算公式：。
*15、相对标准偏差计算公式：。
16、调整流动相组分比例时，以组分比例较低者（小于或等于50%）相对改变量不超过 %且绝对改变量不超过 %为限，如 %相对改变的数值超过10%，则改变量以 %为限。
17、一般情况下，对于反相色谱柱，如使用缓冲液或含盐溶液作为流动相，在试验结束后，应用 %的甲醇/乙腈-水溶液冲洗，使色谱柱内的盐完全溶解洗脱出。
如色谱柱需长期保存，反相柱可以贮存于中，并将色谱柱两端，以免干燥，保存。
Waters e2695高效液相色谱仪维护操作培训
实验室
正确的实验步骤
• 选择适当的洗针溶剂（绿管溶剂）和Seal Wash溶剂 • 清洗进样针（Needle Wash） • 清洗柱塞杆密封（Seal Wash） • 平衡系统 • Purge 进样器 • 实验操作 • 清洗系统 • Purge 进样器 • 清洗进样针（Needle Wash） • 清洗柱塞杆密封（Seal Wash）
shift—1—shift—1
检 查 检 测 器 灯 的 能 量 ( 检查检测器灯的使用时 手动关检测器灯
灯的亮度)
间
单/双波长， 自动调零
方法调用， A/B通道切换
设置及诊断
运行/停止 键 选项移动键
分屏显示键
监视色谱图 第二功能键
屏幕对比度 回车键
溶剂过
滤头堵
不锈钢滤头应先用纯化水超声 清洗。若不行，则可用100%的 异丙醇超声波清洗20分钟，之 后再用纯化水超声清洗。
注射器中出现的气 泡会导致系统抽取 的样品量不准确， 进而影响峰面积的 重现性。
进样前检查注射器 内流动相是否存在 气泡。
Inject Samples
样品进样
➢操作步骤： 选择Inject Samples（样品进样）选项，Enter，出现 Inject Samples （样品进样）对话框，如上图： Vial Range： 样品瓶位置 Injects per vial： 进样次数（5~10次） Run time： 运行时间（一般0.5min） Inject volume： 进样量（设置要比检测时的进样量 大，一般为40μl或80μl）
安装在线过滤器滤 芯时需注意滤芯方 向，且需放平后再 上紧。
灌注流动相时压力变高
Inline filter（在线过滤器） Parts No. WAT088084
高效液相色谱仪使用与操作规程(学生用PPT培训课件
目录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的安装与调试 • 高效液相色谱仪的使用步骤 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 安全注意事项 • 高效液相色谱仪的发展趋势与展
望
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 广泛应用于化学、制药、食品、 环保等领域。
检测器技术升级
发展高灵敏度、高稳定性和高可 靠性的检测器，提高检测精度和
可靠性。
应用领域拓展
新药研发
高效液相色谱技术在药物分析、药物代谢和药物 动力学等领域发挥重要作用。
环境监测
用于检测水体、土壤和空气中的污染物和有害物 质，为环境保护提供有力支持。
食品安全
用于检测食品中的农药残留、添加剂、毒素等有 害物质，保障食品安全。
确保实验室环境干燥、 清洁，避免仪器受潮 或落尘。
操作时应避免剧烈振 动仪器，以防损坏内 部组件。
仪器安全
定期检查仪器管路是否漏液，若 有漏液应及时处理。
仪器应放置在通风橱内，以防气 体泄漏对实验人员造成危害。
仪器使用完毕后应关闭所有电源， 并按照仪器说明书进行保养。
数据安全与保密
操作过程中避免无关人员靠近 仪器，以防误操作导致数据丢 失或损坏。
仪器保养与校正
01
02
03
04
定期对仪器进行全面检查，包 括泵、进样阀、色谱柱和检测
器等部件。
根据仪器使用情况，适时清洗 或更换泵内滤网、色谱柱和检
测器。
按照厂家推荐，使用专用工具 和材料进行保养和校正。
定期对仪器进行性能验证，确 保其准确性和可靠性。
安捷伦1260高效液相色谱培训课件
D、选择使用适宜的流动相（尤其是PH值），以避免固 定相被破坏。有时候可以在进样器前面连接一预柱， 分析柱是键合硅胶，预柱为硅胶，可是流动相在进入 分析柱之前预先被硅胶饱和，避免分析柱中的硅胶基 质被溶解。
概述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年 代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极 为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经 典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论， 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏 度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度 高、操作自动化的特点。
•9 •安捷伦1260高效液相色谱培训
E、避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接进入柱内， 需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一 个保护柱，保护柱一般是填有固定相的短柱，保护柱可以 经常更换。 F、经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质 G、保存色谱柱时应将色谱柱中充满乙腈或甲醇，柱接
•4 •安捷伦1260高效液相色谱培训
2、输液泵的使用和维护注意事项 A、防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其他任何杂质 微粒都能磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先 除去流动相中的任何固体微粒； B、流动相不应含有任何腐性物质含有缓冲液的流动相不应 保留在柱内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如 果含有缓冲溶液的流动相在柱内，由于蒸发或泄漏，甚至 由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体。这些晶粒将 损坏密封环和柱塞等。因此，仪器在关机前必须将泵清洗 干净，再换成适合色谱柱保存的和有利于泵维护的溶剂。 C、泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空 泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。 D、输液泵的最高压力不要超过规定的最高压力值，否则会 使高压密封环变形。 E、流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的 稳定。
高效液相色谱知识培训测试题
安捷伦液相色谱知识培训试题姓名：成绩：一、选择题（每题至少有一个正确答案）（每题2分，共10分）1．以下哪种溶剂一般不作为反相色谱的流动相使用（）。
A 甲醇；Ｂ正己烷；C 二氯甲烷；D 乙腈2．影响液相色谱分离度的因素有（）。
A 流动相；Ｂ色谱柱；C 进样器；D 检测器3．以下哪种检测器的通用性比较好（）。
A VWD；Ｂ DAD；C FLD；D RID4．以下哪些项目属于色谱的“系统适应性试验”的内容（）。
A. 重复性B. 理论塔板数C. 分离度D.对称因子5．液相色谱适宜的分析对象是（）。
A 低沸点小分子有机化合物B 高沸点大分子有机化合物C 所有有机化合物D 所有化合物二、填空题（每题2分，共20分）1.液相色谱常用的检测器有（至少答出四种）、、、。
2. 目前常用的液相泵有、、。
3.一台完整的液相色谱主要由、、、、组成。
4.液相色谱根据流动相和固定相的极性可分为和。
5.配有自动进样器的一台高效液相色谱仪，其进样量的准确性主要由来决定。
6.泵头密封垫冲洗装置Seal Wash一般用作为溶剂。
7.采用VWD检测中药的有效成分，其检测波长一般设置在。
8.在液相反相色谱中，流动相极性增大，色谱峰保留时间。
9. 不对称峰有两种：T小于0.95为，T大于1.05为。
10. VWD检测器所使用的光源为。
三、是非题：（每题2分，共20分）1.序列属于方法的一部分。
（）2.色谱柱的理论塔板数越多代表柱效越高。
（）3.DAD和FLD均可以采集一个化合物的光谱图。
（）4.温度对液相色谱结果影响较小，因此可以不对液相色谱进行控温。
（）5.四元泵可以同时控制四种不同的溶剂进行梯度洗脱，其性能要优于单元泵和二元泵。
（）6. 流动相使用之前需先脱气。
（）7. 死体积是由进样器至检测器的流路中被流动相占有的空间。
（）8.为能获得较高的柱效，节约分析时间，采用较小的流速，通常内径4.6mm的色谱柱，多用50ml/min 的流量。
HPLC高效液相色谱法培训解析
进样方式
①部分装液法：注入的样品体 积应不大于定量环体积的50%， 并要求每次进样体积准确、相 同。
②完全装液法：注入的样品体 积应最少是定量环体积的3倍，
29
以完全置换定第29量页/共1环12页 内流动相， 消除管壁效应，确保进样准确
30
第30页/共112页
自动进样器
由计算机自动控制进样六通阀、 计量泵和进样针的位置，按预 先编制的进样操作程序工作， 自动完成定量取样、洗针、进 样、复位等过程。
应用范围
适用于任何挥发性小于流动相的 组分的检测
不适于检测挥发和半挥发性的化47
合物
第47页/共112页
其他检测器难以检测的化合物如
HPLC分析基本操作
1．准备：流动相配制、脱气， 样品制备。
2．开机：依次打开计算机、泵、 检测器、柱温箱电源开关，仪 器自检。
3．装柱：将吸液头插入已经过 滤和脱气处理的甲醇中，开启 泵，使液体流第48页出/共11，2页 调流速在 48 0.2mL/min，连接色谱柱（注意
第23页/共112页
进样器
➢ 手动 六通阀
经注射器进样
➢ 自动 六通阀
圆盘式自动进样器 链式自动进样器
24
第24页/共112页
25
第25页/共112页
六通阀手动进样器原理示意图
Load
Inject
26
第26页/共112页
六通阀
有6个接口，1和4之间接定量环，2接高压 泵，3接色谱柱，5、6接废液管。
4
第4页/共112页
仪器组成
进112页
数据处理 系统
5
高压输液系统
溶剂贮液瓶 溶剂脱气装置 高压输液泵 梯度洗脱装置
液相培训试题 (1)
高效液相色谱仪培训检测一、选择题1. 以下属于光学性质检测器的是（）A. 紫外-可见光检测器B. 荧光检测器C. 电导检测D. 光声检测器2. HPLC流动相对溶剂的要求有（）A. 纯度高、化学稳定性好B. 对待检测样品具有合适的极性和选择性C. 用于紫外检测时，溶剂在检测器的工作波长下不能有紫外吸收D. 分析纯级别即可以被用来作为流动相3. 高效液相色谱的流动相常见的脱气方法有（）A. 超声波脱气B. 抽真空脱气C. 在线真空脱气D. 加热脱气4. 液相使用过程中若发现有盐析出导致压力较高，应该选择用哪种流动相进行冲洗（）A. 水B. 甲醇C. 乙腈D. 缓冲盐5. 不可以用来对泵头进行冲洗的试剂是（）A. 异丙醇B. 甲醇C. 水D. 缓冲盐6. 在高效液相色谱流程中，试样混合物在（）中被分离。
A. 检测器B. 记录器C. 色谱柱D. 进样器7. 液相色谱流动相过滤必须使用何种粒径的过滤膜（）A. μmB. μmC. μmD. μm8. 在液相色谱法中，提高柱效最有效的途径是（）A. 提高柱温B. 降低板高C. 降低流动相流速D. 减小填料粒度9. 在液相色谱中，不会显着影响分离效果的是（）A. 改变固定相种类B. 改变流动相流速C. 改变流动相配比D. 改变流动相种类10. 在高效液相色谱仪中保证流动相以稳定的速度流过色谱柱的部件是（）A. 贮液器B. 输液泵C. 检测器D. 温控装置二、判断题11. 液相色谱柱没有方向区别，所以接色谱柱时无需根据流路方向来接。
（）12. 液相色谱仪使用完后，如果管路中有缓冲盐，需要用水冲洗。
（）13. 不建议使用乙醇代替甲醇作为常用的流动相，但可以作为低含量改性剂使用。
（）14. 脱气后的溶剂放置时间长了，又会溶解新的气体，使用时需要重新处理。
（）15. 乙腈作为流动相时，其体积浓度比例最好不超过75%。
（）16. 液相使用人超过申请使用时间后，若后续无其他人使用，可以不用申请，继续使用。
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
流动相的保存
有机溶剂流动相：
室温下密封，避光保存
缓冲盐流动相：
当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：
低温密封保存 防止有机相的挥发
选用适宜的容器
1．梯度洗脱的特点
（1）改善分离, 加快分析速度； （2）改善峰形, 减少拖尾, 有利于痕 量组分的检测； （3）增加峰容量； （4）强烈滞留的组分不容易残留在 柱上, 保持柱性能长期良好； （5）下次分析时, 流动相需要一段平 衡时间；不同溶剂的UV吸收程度稍有 差异, 可能会引起基线漂移
色谱柱柱内体积和平衡时间
色谱柱 尺寸
(mm)
4.6 x 50 4.6 x 30 4.6 x 15 4.6 x 150
柱内 体积
(Vm)
0.5 mL 0.3 mL 0.15 mL 1.54 mL
平衡时间 流速
1.0 mL/min
5 min 3 min 1.5 min 15 min
色谱柱 尺寸 (mm)
60 sec 36 sec 18 sec
色谱柱清洗保存
反相色谱柱：用20%甲醇溶液清洗10个柱体积，保存在 90%的甲醇溶液中。
分子筛色谱柱：用纯水清洗10个柱体积，保存在5%叠氮 化钠水溶液中。
离子色谱柱：用0.02M盐，pH6.5溶液清洗10个柱体积， 保存在含5%叠氮化钠0.02M盐，pH6.5溶液中。短期保存 在低盐的流动相中。
对压力、温度及流速等变化不敏感 长时间操作的稳定性 低死体积 非破坏性 选择性
灵敏度：信噪比
灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值
（S/N）
6:1
检测限（LOD）：S/N = 2~4
定量限（LOQ）：S/N = 8~10
好的信噪比有利于：
更好的色谱峰确认
S
更好的定量
普通分析型液相色谱的滞后体积为2~4ml
滞后体积变化的影响
设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化 滞后体积随反压变化的后果：
梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好 用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性
固定滞后体积，改善了梯度性能 梯度百分比
梯度曲线
好的梯度 滞后曲线
保留时间
pH变化值 0.1
RS变化值 1.6
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱
对溶剂的要求
水：
去离子水 自动纯水仪
纯净水
商品瓶装水
溶剂:
色谱纯（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，异丙醇）
试剂: 分析纯
• 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要 求越高放置时间越短。
灯的保养：
在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成 后，马上关闭检测器。
样品池要保养
谢谢！
今天用的图片都为 摄影协会 王诏同学所拍摄
每一次的加油，每一次的努力都是为 了下一 次更好 的自己 。20.11. 2520.11.25We dnesda y, November 25, 2020
更好地完成色谱峰纯度/均一性
N
吸光度（Absorbance UV/Vis）检测
目前实验室中最流行的选择 多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是 多波长，25%是PDA）
测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 吸光度与样品浓度呈线性关系 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大
梯度： 5 - 40% B in 35 min. 流速： 1.0 mL/min. 样品： 水（10 µL inj. vol.） 检测： 214 nm
图1；好的梯度系统 图2；一般的二元梯度系统 图3；一般的四元梯度系统
为何如此重要？
五个小肽的5ng进样，好的色谱系统非常容易鉴别出所有 峰。在不好的色谱系统中，第一个峰则消失在基线噪音中。
• 理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过0.22um 的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。
过滤与脱气
过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使
用无机盐配制的缓冲液。 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响：
1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
Minutes
吸光度检测器（UV/Vis）－ 缺点
由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用检测器 对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器 样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要使用多波
长检测，或使用折衷的波长 受流动相组成的影响：
用截止波长以上至少5～10nm作为工作波长 缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂也会有影响
HPLC的 使用与维护
分析与制剂研究室 胡锋
基本原理和特点 液相色谱仪器部件 实验操作与应用 日常维护
基本原理和特点
➢ 基本原理：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固 定相时,由于与 固定相(stationary phase)发生作用(吸附,分 配,离子吸引,排阻,亲和)的大小,强 弱不同,在固定相中滞留 时间不同,从而先后从固定相中流出.
2．梯度洗脱的主要条件 ① A 流动相/弱溶剂组成；
强溶剂 A%
② B 流动相/强溶剂组成；
③ 梯度时间；
④ 梯度曲线：线性、凸型或凹型等。
time
5 2 1
梯度洗脱
3 2 1
梯度：低压混合
低压梯度 用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合 对脱气要求高 不易调节梯度的滞后体积
如设计不当，梯度的 准确性受影响 滞后体积（系统 体积）设计合理
梯度滞后：系统体积的影响
低
B
压 AC
梯
D
比例阀
度
溶剂输送 系统(泵)
阻尼器 混合器
进样器
色谱柱
检测器
滞后(系统)体积
注意∶滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路
滞后(系统)体积
死体积/谱带展宽体积 (无色谱柱时)
溶剂输送
高 系统(泵) 压
梯 溶剂输送 度 系统(泵)
进样器
梯度混合器
色谱柱
检测器
梯度滞后大小的影响
滞后体积太大会引起梯度变化的延迟 例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min 实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题 对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min 实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受
滞后体积的不同会使方法转换麻烦 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现 滞后体积的变化会导致梯度重现性不好
2.1 x 50 2.1 x 30 2.1 x 15
柱内 体积 (Vm)
0.10 mL 0.06 mL 0.03 mL
平衡时间 流速
0.2 mL/min
5 min 3 min 1.5 min
单次样品运行时间 = 分析时间 + 色谱柱平衡时间 色谱柱平衡时间 = 10倍柱内体积 ÷ 流速
1.0mL/min
天生我材必有用，千金散尽还复来。14:30:5014:30:5014:3011/25/ 2020 2:30:50 PM
安全象只弓，不拉它就松，要想保安 全，常 把弓弦 绷。20. 11.2514:30:5014:30Nov-2025-Nov-20
得道多助失道寡助，掌控人心方位上 。14:30: 5014:30:5014: 30Wednesday, November 25, 2020
高效液相色谱仪组成
输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据记录处理系统
液相色谱流程图
溶剂
HPLC色谱柱
数据处理系统
自动进样器 色谱泵
检测器
废液
液相色谱的流动相
液相柱---保留值与pH的关系
色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um
流动相：27%甲醇：73%磷酸 pH： 2.5&2.6 温度： 50℃ 流速： 1.0mL/min.
普通的低压梯度系统 梯度百分比
不好的梯度 滞后曲线
保留时间
液相色谱的色谱柱
色谱柱的连接
Stop_depth长度不合适造成柱前死体积
色谱柱的连接
锥箍锥度不合适造成渗漏
可能提高柱效的方法
除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右)，再补充新的固 定相。
色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱效将明显下降，选合适 的溶剂进行洗净。
➢ 特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动 化。
流动相 脱气装置
四元泵
一些商品化仪器
检测器 柱温箱 样品盘
控温箱
启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源 打开泵、自动进样器、检测器电源，
待设备通过自检后，打开计算机启动 色谱管理软件 准备流动相
过滤，脱气 色谱泵排气
用新配制的流动相灌注泵
口管路，设定流速1mL/min， 如压力>3kgf/cm2，则堵塞。
泵的保养：
使用流动相尽量要清洁； 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； 流动相交换时要防止沉淀； 避免泵内堵塞或有气泡； 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污
染；
柱的保养：
柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净； 要注意流动相的脱气； 避免使用高粘度的溶剂作为流动相； 进样样品要提纯； 严格控制进样量； 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱； 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；