离子交换层析

伯胺[-NH2]
螯合离子交换剂 金属离子
由于树脂的孔径过小，电荷密度过高，疏水性过强使得大分子结合过牢而不易洗脱， 易造成变性。
常用于分离无机离子、有机酸、核苷、核苷酸、氨基酸等小分子物质。 除去表面活性剂、尿素、两性电解质
分类
• 亲水性离子交换剂
• 纤维素离子交换剂：微晶纤维素为基质引入电荷基团构成的 最广泛使用的是二乙胺基乙基(DEAE一)纤维素和羧甲基(CM一)纤维素
分类
➢ 电荷基团 • 阳离子交换柱：基团带负电荷，蛋白质带正电荷 • 阴离子交换柱：基团带正电荷，蛋白质带负电荷
配基
结构
阳离子 阴离子
硫酸基 磺酸基 磷酸基 羧酸基 叔胺基 季胺基
-OSO3H -(CH2)nSO3H
-OPO3H2 -(CH2)nCOOH -(CH2)nN+H(C2H5)2 -(CH2)n-N+≡(R)
强阳(阴)离子交换剂比弱阳(阴)离子交换剂对蛋白质的结合能力强，需较强的盐浓度 进行洗脱，强离子交换剂有时会和蛋白质结合太强而发生不可逆吸附，影响收率
分类
➢基质
疏水性离子交换剂:人工合成的、与水结合力小的树脂物质
亲水性离子交换剂:天然的或人工合成的、与水结合力较大的 物质。纤维素(Cellulose) 、葡聚糖(Sephadex) 、琼脂糖 (Sepharose)
5、稳定性 离子交换剂都具有很好的理化稳定性。
6、比重 离子交换剂经过溶胀处理后的比重是恒定的。
离子交换剂与缓冲液的选择
•离子交换剂
阴阳离子交换剂的选择 强弱离子交换剂的选择 不同载体离子交换剂的选择
离子交换剂的选择
• 阴阳离子交换剂的选择
取决于被分离的物质在其稳定的pH下所带的电荷。如果带正电，则选 择阳离子交换剂；如带负电，则选择阴离子交换剂；如果被分离的物质 为两性离子，则根据其稳定的pH范围所带的电荷来选择。
性能 弱碱性、阴离子 强碱性、阴离子 弱酸性、阳离子 强酸性、阳离子
离子基团 DEAE+ QAE+
CMSP-
分类
•交联琼脂糖离子交换剂
粒径
Sepharose 系列
大孔珠状 颗粒状
SepharoseCL-6B
SepharoseHP Q、SP
SepharoseFF 弱型（DEAE、CM） 强型（Q、SP）
另外，无机盐离子（如NaCl）对交换剂也具有交换吸附的能力， 当洗脱液中的离子强度增加时，无机盐离子和蛋白质竞争吸附交换剂。 当Cl-的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱。
因此，洗脱阴离子交换剂结合的蛋白时，则降低pH值，增加盐 离子浓度；洗脱阳离子交换剂结合蛋白时，则升高溶液pH值，增加 盐离子浓度。
价格 分辨率和稳定性
特点
纤维素离子交换剂 较低 葡聚糖离子交换剂 适中
较低 适中
适于初步分离和大量制备
受外界影响较大，体积可 能随离子强度和pH变化有 较大改变，影响分辨率
琼脂糖离子交换剂 较贵
较高
缓冲液的选择
缓冲离子：与功能基团带相同的电荷 pH：阳离子交换介质时，起始缓冲液的pH要低于目标蛋白的等电 点的0.5-1个单位；使用阴离子交换介质时，起始缓冲液的pH则要 高于目标蛋白的等电点的0.5-1个单位。 离子强度：离子强度↑→利于洗脱，不利于吸附
3、膨胀度（吸水量）：每g干胶在水或其他规定的溶剂中，在一 定时间与温度条件下膨胀后所占有的体积毫升数。
性质
4、交换容量: 是指离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换的能力。
一般用总交换容量和有效交换容量表示。总交换容量只和离子交换 剂本身的性质有关。有效交换容量与实验条件有很大的关系
影响因素： ① 筛孔：要根据被分离的对象来选择。一般离子交换剂的孔隙应尽
pK <2 <2 <2和6 3.5~4.2 8.5~9.5 >9
分类
简称
强酸
S
强酸 SM(n =1),SE(n =2), SP(n =3), SB(n =4)
中等酸性
P
弱酸
CM(n =1)
弱碱
DEAE(n =2)
强碱
Q ,QAE
pK决定了相应的离子交换剂的pH工作范围，强阳(阴)离子交换剂比弱阳(阴)离子交换 剂有更宽的工作范围
90μm 34μm
90μm
SepharoseBB Q型SP型
200μm
性质
颜色与形状 交联度 吸水量或膨胀度 交换容量 稳定性 比重
性质
1、颜色与形状 树脂类离子交换剂：褐色、黄色、乳白色等 亲水性离子交换剂：白色 珠状
2、交联度：交联剂在离子交换剂中的比例，用重量百分率表示。
原理
高分子聚合物基质 + 电荷基团 + 平衡离子
• 电荷基团与基质共价结合，形成一个带电的可进行离子 交换的基团。平衡离子能与溶液中其它的离子基团发生 可逆的交换反应。
• 蛋白质是两性分子，在一定的pH条件下带有电荷，不 同的蛋白质带有的电荷的种类和数量不同，因此它们与 带电的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同。利用蛋白质和 带电凝胶的作用力的差别从而把蛋白质分开。
特点：结构疏松、表面积大，亲水性强，吸附力弱、交换和洗脱条件温和
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分类
• 亲水性离子交换剂 • 交联葡聚糖离子交换剂：数个葡萄糖分子聚合而成，以
交联葡聚糖G–25和G–50为基质，引入电荷基团而制 成的。
特点：不会引起被分离物质的变性或失活、非特异性吸附少、交换容量大
类型 DEAE-sephadexA-25 DEAE-sephadexA-50 QAE-sephadexA-25 QAE-sephadexA-50 CM- sephadex C-25 CM- sephadex C-50 SP- sephadex C-25 SO- sephadex C-50
• 强弱离子交换剂的选择
强性离子交换剂适用的pH范围广，常用来制备无离子水和一些在极端pH 溶液中易解离且较稳定的物质。 弱性离子交换剂pH范围窄，在pH中性的溶液中交换容量高，常用来分离 生命大分子物质，确保不易失活。 一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换剂
离子交换剂的选择
分离大分子物质时，选用亲水性基质的交换剂较为合适，它们对被 分离物质的吸附和洗脱都比较温和，活性不易破坏。
离子交换层析基本步骤
待分离蛋白质透析至对应缓冲液中使其带正（负）电荷
例：HBV-15D1纯化 DE52(20mMPB6.5-CT)+CM(10mMPB6.5-100mMXT) 硫铵初纯
透析至20mM PB 6.5 +
DE52
CM
量能够让样品组分进入，样品组分与离子交换剂作用面积大。 ② 离子强度：离子强度增大，交换容量下降。 ③ pH值：样品组分带电性质、离子交换剂解离程度
pH对弱酸和弱碱型离子交换剂影响较大，弱酸型离子交换剂在pH较高时， 电荷基团充分解离，交换容量大，而在较低的pH时，电荷基团不易解离， 交换容量小
性质
分类
• 疏水性离子交换剂
强酸型R－SO3H
阳离子交换剂 中强酸型R－PO3H2
R－COOH＋Na+＝R－COONa＋＋H+
弱酸型R－COOH/R－苯环－OH
季胺[-N (CH3)3]
阴离子交换剂
叔胺[-N(CH3)2] 仲胺[-NHCH3]
R－N+(CH3)3OH-＋Cl=R－N+(CH3)3Cl-＋OH-
原理
pH=pI
COO-
R NH+3
+H
pH<pI
COOH 阳离子
R NH+3
阳离子交换剂
阴离子交换剂
-H
pH>pI
COO- 阴离子
R NH2
• 例：某蛋白质pI=6.0，在pH=6.5缓冲液中带负电，与阴离子交换剂结合
原理
当溶液的pH值发生改变时，蛋白质与交换剂的吸附作用也发生变 化，当pH值增高时，对阳离子交换剂的吸附力减弱，当pH值降低时， 对阴离子交换剂的吸附力减弱。
离子交换层析
江凌峰 2017年8月
CONTENTS
1
概念
3
分类
5
选择
2
原理
4
性质
6
步骤
概念
• 离子交换层析是利用离子交换剂作为吸附剂，将溶液中 的待分离组分，依据其电荷差异，吸附在离子交换剂上， 然后利用合适的洗脱剂将吸附质从离子交换剂上洗脱下 来，达到分离的目的。
• 离子交换层析具有灵敏度高，重复性、选择性好，分析 速度快等优点，是当前最常用的层析法之一。